용융 전기방사 쓰기(MEW), 폴리카프로락톤(PCL) 스캐폴드 및 피브린 하이드로겔을 hiPSC 유래 심근세포 및 섬유아세포와 결합한 3D 심근 조직을 생성하기 위해 재현 가능한 방법이 제시됩니다. 이 기술은 스캐폴드 아키텍처를 정밀하게 제어하며 전임상 약물 테스트 및 심장 질환 모델링에 적용할 수 있습니다.
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방법 논문
폴리카프로락톤 골격 및 hiPSC 유래 심장 세포의 용융 전기방사 쓰기를 사용한 3D 인간 심근 조직 생성
이 논문에서
요약
초록
기능성 인간 심장 조직의 개발은 약물 스크리닝, 질병 모델링 및 재생 의학 분야의 응용 분야를 발전시키는 데 중요한 가능성을 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 MEW(melt electrospinning writing), PCL(polycaprolactone) 골격을 피브린 하이드로겔 및 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 유래 심장 세포와 결합하여 천연 심장 구조를 고급 모방한 3D 심근 조직의 단계적 제작을 설명합니다. 이 과정에는 섬유소 매트릭스 내에 심근세포(hiPSC-CM)와 심장 섬유아세포(hiPSC-CF)의 혼합물을 삽입하여 MEW에서 생성된 골격이 제공하는 구조적 지지와 함께 미니 조직을 만드는 작업이 포함됩니다. 이 섬유소 골격은 마이크로에서 나노 규모로 제작되어 세포 분포 및 정렬을 구성하는 데 중요한 역할을 하는 섬유 구조를 정밀하게 제어할 수 있습니다. 한편, 피브린 기질은 세포 생존력을 촉진하고 세포 외 환경을 모방합니다. 생성된 조직의 특성화는 안정적인 수축 활동과 함께 hiPSC-CM 내에서 잘 조직된 sarcomeres를 나타냅니다. 이 조직은 파종 후 빠르면 이틀 후부터 일관된 자발적 박동을 보여주며 시간이 지남에 따라 지속적인 기능을 발휘합니다. hiPSC-CF와 hiPSC-CM의 조합은 조직의 구조적 무결성을 향상시키는 동시에 장기적인 세포 생존력을 지원합니다. 이 접근 방식은 생체 모방 심장 조직 모델을 만들기 위한 재현 가능하고 적응 가능하며 확장 가능한 방법을 제공하여 전임상 약물 테스트, 심장 질환의 기계론적 연구 및 잠재적인 재생 요법을 위한 다목적 플랫폼을 제공합니다.
서론
기능성 인간 심장 공학 조직의 제작은 충격이 큰 응용 분야에 큰 가능성을 가지고 있습니다. 이는 심장독성 약물 및 인간 심장 질환 모델링 개발부터 관련 크기의 치료 조직 생성에 이르기까지다양합니다 1. 지난 15년 동안 이 분야에서 상당한 발전이 있었지만, 고도로 모방적인 인간 심근의 제작은 현재 자연적 대응2의 복잡한 구조적, 기계적 조직을 재현하는 데 어려움이 있어 방해를 받고 있습니다.
생물학적 측면에서, 혁신적인 세포 재프로그래밍 기술은 환자 맞춤형 치료용 세포를 개발할 수 있는 가능성을 열었습니다. 현재 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)는 개인화된 맥락에서 인간 심근세포의 유일한 공급원입니다. 높은 수율의 심근세포는 강력한 분화 프로토콜 3,4에 따라 얻을 수 있습니다. 핵심 쟁점은 현재 사용되는 human hiPSC-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM)가 기존의 2D 분화 조건 하에서 미성숙 표현형을 나타내기 때문에 성숙 정도입니다
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프로토콜
이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 배지 및 시약 설정
- 세포 배양 플레이트의 사전 코팅
- MGFr(Matrigel Growth Factor Reduced) 주식 부분 표본을 준비합니다. MGFr 한 바이알을 얼음에 담아 냉장고에서 하룻밤 동안 해동합니다. 멸균 후드에서 냉장 팁을 사용하고 스톡과 튜브를 항상 얼음 위에 보관하고 저온 RPMI 1640 L-글루타민(RPMI)에 스톡을 1:1로 희석하여 적절한 부피의 부분 표본을 만듭니다.
참고: hiPSC 배양 및 hiPSC-심근세포(hiPSC-CM)의 파종을 위해 다양한 MGFr 희석액이 사용됩니다. hiPSC에 대한 MGFr 코팅 희석은 특정 세포주에 따라 다릅니다. 그러나 심근세포 단계에 도달하면 세포주에 관계없이 1:80 희석이 사용됩니다. - 세포 배양 플레이트를 코팅하려면 얼음에서 필요한 수의 MGFr 분취량을 천천히 해동하고 차가운 RPMI, hiPSC 배양의 경우 1:180(9mL의 RPMI 중 MGFr 100μL), hiPSC-CM 리플레팅의 경우 1:80....
- MGFr(Matrigel Growth Factor Reduced) 주식 부분 표본을 준비합니다. MGFr 한 바이알을 얼음에 담아 냉장고에서 하룻밤 동안 해동합니다. 멸균 후드에서 냉장 팁을 사용하고 스톡과 튜브를 항상 얼음 위에 보관하고 저온 RPMI 1640 L-글루타민(RPMI)에 스톡을 1:1로 희석하여 적절한 부피의 부분 표본을 만듭니다.
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결과
2D hiPSC 유래 심장 세포의 특성화
다중 표현형 심장 조직을 생성하기 위해 hiPSC-CM과 hiPSC-CF를 독립적으로 분화하고 in vitro에서 특성화합니다. 적절한 최적화와 엄격한 유지 관리를 통해 다음 프로토콜은 분화 9일차에 80% 이상의 hiPSC-CM 수율을 달성하여 자발적으로 박동하는 세포를 생성합니다(그림 1A). 또한, 대사 선택에 의한 순도 강화는 non-hiPSC-CM을 크게 제거하여 21일째에 심장 트로포닌 단백질(cTNT+)을 발현하는 세포의 90% 이상으로 구성된 배양물을 생성합니다(그림 1B). 이러한 강력한 박동 단층은 IF 염색에 의한 수축성 육종 악티닌 단백질(ACTN)의 발현을 보여줍니다(그림 1C, D).
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토론
인간 심근의 고유한 특성을 복제하는 3D 복합 심장 미니 조직 모델을 생성하려면 몇 가지 필수 요소를 고려해야 합니다. 이는 (1) 조직 제조를 위한 세포의 수율과 순도 최적화, (2) 3D 기계 환경을 모방하기 위해 섬유소 골격 인쇄, (3) 제조 공정에서 피브린 하이드로겔 통합의 세 가지 주요 요점으로 그룹화할 수 있습니다.
성공적인 분화 과정을 보장하기 위한 주요 단계 중 일부는 포화도가 90%를 초과하지 않도록 방지하여 hiPSC의 다능성 특성을 유지하고, CM 또는 CF 분화 시작 시 적절한 포화도를 달성하기 위해 계류 시 hiPSC의 희석을 최적화하고, 효율적인 중배엽 유도를 보장하기 위해 각 세포주에 대한 CHIR 농도를 미세 조정하는 것입니다4, 15. 배양액이 90% 이상의 순도를 달성하고 다양한 심.......
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 보조금 계약 No 874827(BRAV
)에 따라 H2020 연구 및 혁신 프로그램의 지원을 받았습니다. MICIU/AEI /10.13039/501100011033 및 European Union NextGenerationEU/PRTR이 자금을 지원하는 프로젝트 PLEC2021-008127(CARDIOPRINT), PID2022-142562OB-I00(VOLVAD) 및 PID2022-142807OA-I00(INVESTTRA)을 통한 Ministerio de Ciencia y Universidades(스페인); Gobierno de Navarra Proyectos Estratégicos IMPRIMED(0011-1411-2021-000096) 및 BIOHEART(0011-1411-2022-000071); Gobierno de Navarra Proyectos Colaborativos BIOGEN (PC020-021-022) 및 Gobierno de Navarra Salud GN32/2023. 그림 1A,....
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| &마이크로;-슬라이드 8웰 챔버 커버슬립(IbiTreat) | IBIDI | 80826 | |
| 0.1% 젤라틴 용액(Embryomax) | Merck Millipore | ES-006-B | |
| 10% 포르말린 | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| 12웰 플레이트 | Costar/Corning | 3513 | |
| 6웰 플레이트 | Costar/Corning | 3506 | |
| 고급 DMEM 1x (ADMEM) | Gibco | 12491015 | |
| 아프로티닌 | Sigma Aldrich | A1153 | |
| B-27 SUPLEMENT, 플러스 인슐린 (50x) | Life Technologies | A317504044 | |
| B27 보충제, 인슐린 제외 (50x) | Life Technologies | A1895601 | |
| 생검 펀치 (직경 6mm) | Medical | BP-60F | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Sigma Aldrich | A9647 | |
| CHIR-99021 | AXON MEDCHEM | AXON1386 | |
| 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 | Zeiss | LSM 800 | |
| 문화 플라스크 175 cm | Greiner Bio-One | 660175 | |
| 문화 플라스크 75 cm | Falcon | 353136 | |
| Cytometer | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| 다피 | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 동키 안티-마우스 IgG (H+L) 고-교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21202 | |
| 당나귀 항-토끼 IgG (H+L) 고-교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21207 | |
| DPBS (Mg2+, Ca2+ free) | Gibco | A314190094 | |
| EDTA 0.5M pH 8.0 | Life Technologies | AM9260G | |
| ESSENTIAL 8 MEDIUM KIT | Life Technologies | A1517001 | |
| FGF2 (재조합 인간 FGF-basic 154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
| 소 혈장에서 추출한 피브리노겐 | Sigma Aldrich | F8630 | |
| 섬유아세포 성장 매체 3 KIT (FGM3) | PromoCell | C-23130 | |
| 녹아웃 세럼 교체(KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| 젖산염(L-락테이트나트륨) | Sigma Aldrich | 71718 | |
| Matrigel 성장 인자 감소 (MGFR) 기저막 매트릭스, LDEV-free | Corning | 354230 | |
| MEW 23-G 바늘 | Nordson | 7018302 | |
| MEW 프린터 | QUT, 퀸즐랜드 공과 | ||
| MEW 주사기 | Nordson | 7012072 | |
| Mouse Anti-Cardiac Troponin T Monoclonal Anti Neural Anti | Biological | Gen MA5-12960 | |
| 마우스 Anti-DDR2 단클론 항체 | Sigma Aldrich | SAB5300116 | |
| Mouse Anti-α-actinin (sarcomeric) 단클론 항체 | Sigma Aldrich | A7811 | |
| 페니실린 - 스트렙토마이신 | 생명 기술 | 15140122 | |
| 폴리&엡실론;-카프로락톤(PCL), 의료용 | Corbion | PURASORB® PC 12 | |
| Rabbit Anti-Vimentin 재조합 단클론 항체 [EPR3776] - 세포골격 마커 | Abcam | Ab29547 | |
| 레티노산 | Sigma Aldrich | R2625 | |
| ROCK 억제제 Y-27632 (10mg) | Fisher Scientific | HB2297 | |
| RPMI 1640 (L-글루타민) | Gibco | 21875034 | |
| RPMI 1640 (페놀 레드 없음) | Gibco | 32404014 | |
| RPMI 포도당 없음 | Gibco | 11879020 | |
| SB431542 | SELLECK CHEMICALS | S1067 | |
| 분광 광도계 | BMG 랩테크 | SPECTROstar 나노 | |
| 트롬빈(인간 알파 트롬빈, Factor IIa) | 효소 연구소 | HT 1002a | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604021 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287 | |
| Wnt-C59 | AXON MEDCHEM | AXON2287 |
참고문헌
- Cho, S., et al. Challenges and opportunities for the next generation of cardiovascular tissue engineering. Nat Methods. 19 (9), 1064-1071 (2022).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Heart regeneration: 20 years of progress and renewed optimism. Dev Cell.
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재인쇄 및 허가
