방법 논문

Rupture and Delivery of DNA Tension probes into cell(파열 및 DNA 장력 프로브의 세포 내 전달을 기반으로 한 세포 메카노타입의 High-throughput Flow-cytometry) 측정

DOI:

10.3791/67852

⸱

2025년 6월 13일

 , 
1College of Biological Sciences, University of Minnesota

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법은 리간드를 제시하는 고정된 DNA-듀플렉스를 파열시켜 상대적인 세포 견인력을 보고하는 세포의 경향을 측정합니다. 파열된 형광 올리고는 세포로 전달되어 유세포 분석으로 분석되어 세포의 기계적 이력을 기록합니다. 이를 통해 세포 메카노피노타이핑(cellular mechanophenotyping)의 맥락에서 세포력 생성에 대한 고처리량 측정이 가능합니다.

초록

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기계적 힘은 많은 중요한 세포 과정을 안내하며, 세포의 기계적 표현형 또는 기계형은 많은 질병에서 방해를 받습니다. 세포의 힘을 정량화하는 데 가장 널리 사용되는 방법은 견인력 현미경 검사법으로, 전통적으로 형광 비드를 포함하는 탄성 기질을 변형시키거나, 마이크로 포스트를 편향시키거나, 고정된 분자 장력 센서의 형태를 변경하는 세포의 고해상도 현미경 검사를 통해 세포가 주변 환경에 가하는 힘을 포착합니다. 여기에서는 확립된 DNA 장력 프로브를 사용하여 상대적인 세포 견인력을 측정하고 유세포 분석을 통해 정량화하는 고처리량 방법을 제시합니다. 이 방법에는 아래에 설명된 5가지 전체 단계가 있습니다. 첫째, DNA 연결 HUH-태그에 융합된 고친화성 인테그린 리간드 에키스타틴의 발현 및 정제; 둘째, 리포터와 리간드를 포함하는 DNA 이중 프로브의 제조; 셋째, 프로브의 표면 준비 및 고정; 넷째, "Rupture and Deliver" 장력-게이지-테더 실험 및 흐름 판독 실행. 마지막으로 데이터 분석 및 실험 결과 해석에 대해 설명합니다.

서론

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기계적 힘은 이동(migration)1부터 줄기세포 분화(stem cell differentiation)2, T세포가 올바른 항원제시세포(antigen-presenting cell)3에 결합하고 활성화되는 능력에 이르기까지 많은 중요한 세포 과정을 안내합니다. 기계적 변수는 질병에서 조절이 되지 않아 세포의 세포, 기계적 표현형 또는 기계형에서 측정 가능한 차이를 초래합니다 4,5. 메카노타입(Mechanotype)은 세포와 조직의 기계적 특성을 포괄하는 용어이며 수축성(contractility), 이동(migration), 접착력(adhesion) 및 변형성(deformability)과 같은 매개변수를 포함할 수 있습니다. 세포 또는 조직의 강성은 높은 처리량으로 측정할 수 있으므로 측정되는 메카노타입의 가장 일반적인 측면입니다. 예를 들어, 암세포는 정상 세포보다 뻣뻣한 경우가 많고, 전이성 세포는 순응도가 더 높은 경우가 많습니다 6,7. 세포에 의한 힘 생성은 특정 세포와 환경 간의 상호 작용을 조사하기 때문에 질병8에서 변형된 기계형의 중요한 측면입니다. 견인력 현미경 검사는 세포의 힘 생성을 측정하는 가장 일반적인 방법이며, 형광 비드가 내장된 변형 가능한 탄성 기판 또는 마이크로포스트 어레이에 셀을 도금하고 비드 이동 또는 포스트 편향의 변화를 추적하여 세포가 가하는 힘을 계산하는 것을 포함합니다. 분자 장력 센서는 또한 견인력을 측정하는 데 사용되었으며 더 작은 크기의 힘에 대한 민감성과 특정 리간드-수용체 쌍에 의해 생성된 힘을 측정하는 이점을 제공합니다 9,10. 그러나 기존 TFM 및 분자 장력 센서로 세포력을 측정하는 것은 고해상도 이미징에 의존하므로 측정 처리량이 제한됩니다.

우리는 최근에 DNA-duplex tension probe를 세포 메카노피노타이핑11의 맥락에서 세포 힘 생성의 고처리량 판독에 적용했습니다(그림 1). 간단히 말해서, 광범위하게 사용되는 TGT(tension-gauge-tether) 프로브(12)에서 변형된 DNA 듀플렉스는 "앵커" 가닥13의 비오틴-뉴트라비딘 화학을 통해 96웰 플레이트의 웰에서 고정됩니다. TGT 듀플렉스의 필요한 파열력은 앵커 스트랜드에서 비오틴의 위치를 변경하여 조정할 수 있으며, 이는 듀플렉스의 기하학을 변경하여 낮은 파열력 언지퍼 형태(그림 2A) 또는 높은 파열력 전단 형태(그림 2B)를 초래합니다. 앵커 가닥에는 비오틴과 형광 소광제가 포함되어 있는 반면, DNA의 "리간드" 가닥에는 형광 프로브와 인테그린과 같은 메카노센싱에 관여하는 세포 표면 수용체를 인식하는 리간드가 포함되어 있습니다. 리간드는 리간드에 융합된 HUH-태그라고 하는 DNA 연결 융합 태그를 사용하여 DNA(그림 3)에 공유 연결됩니다14,15. HUH-태그는 바이러스 복제 및 기타 과정에 관여하는 작은 HUH 엔도뉴클레아제 도메인으로, 단일 가닥 DNA의 9bp 서열/구조를 인식하고, nick을 찍고, nicked DNA의 5' 말단에 공유 포스포티로신 부가물을 형성합니다.

이 프로브 위에 도금된 세포는 리간드에 결합하고 프로브가 생성하는 힘에 비례하여 프로브의 일정 비율을 파열시킵니다. 수용체에 결합된 형광 리간드 가닥은 이후에 세포로 전달됩니다. 따라서 세포의 기계적 이력은 형광의 크기를 통해 관심 세포에 기록됩니다. 형광은 유세포 분석을 사용하여 정량화할 수 있습니다. 이 방법을 Rupture and Deliver-TGTS 또는 RAD-TGT라고 합니다. 이 방법은 형광을 측정하여 한 번에 수천 개의 세포에서 생성되는 상대적인 힘을 측정할 뿐만 아니라 유세포 분석 판독을 통해 세포를 메카노타입별로 분류할 수 있는 가능성을 제공하여 다운스트림 오믹스 판독뿐만 아니라 세포 메카노타입을 변경하는 유전자 또는 약물을 식별할 수 있는 CRISPR-KO 또는 약물 스크리닝을 수행할 수 있습니다.

아래 프로토콜에서는 RAD-TGT 실험을 준비하고 실행하는 방법을 보여줍니다. 우리는 WDV(밀 왜성 바이러스에서 유래)로 알려진 HUH 유형의 발현 및 정제 자체로 음성 대조군 역할을 하고 RGD 결합 인테그린으로 알려진 세포와 환경 사이의 힘을 전달하는 접착 수용체 계열을 단단히 결합하는 리간드인 에키스타틴에 융합되어 실험 조건으로 작용하는 것을 강조할 것입니다. 이를 통해 실험용으로 RAD-TGT를 준비하는 방법을 보여줍니다. 실험을 진행하는 방법과 결과 데이터를 분석하는 방법을 설명합니다. 또한 ROCK 억제제가 CHO-K1 세포에서 인테그린 매개 힘을 어떻게 변경하는지 측정하여 RAD-TGT의 응용 분야를 강조할 것입니다(그림 4). 요약하자면, 우리는 이 프로토콜이 이전 경험에 관계없이 기계생물학에 입문하는 역할을 하기를 바랍니다. 이 분야는 초기 단계에 있으며 모든 배경은 더 많은 이해를 위해 필수적입니다.

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프로토콜

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1. HUH 발현과 정화

  1. 형질전환당 약 1.5 μL의 ~50 ng/μL 플라스미드인 WDV(± Echistatin) 플라스미드로 대장 균을 형질전환하고 암피실린 한천 플레이트에서 성장합니다.
  2. 단일 집락에 5mL의 LB를 접종하고 37°C에서 밤새 성장합니다.
  3. 1L의 LB에 하룻밤 배양을 접종하고 OD600 이 ~0.8에 도달할 때까지 성장합니다.
  4. 온도를 18°C로 낮추고 500μM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 유도한 다음 밤새 배양합니다.
  5. 3,750 × g 에서 30분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 40mL의 용해 완충액(300mM NaCl, 50mM Tris pH 7.5, 1mM EDTA)으로 펠렛을 재현탁합니다.
  6. 70 % 듀티 사이클, 전력 7에서 얼음에서 3 x 90 초 초음파 처리로 세포를 용해시킵니다. 24,000 × g 에서 4 °C에서 30분 동안 스핀다운하고 상층액을 새 50 mL 튜브에 붓습니다.
  7. Ni-NTA 수지 슬러리를 15mL 원뿔형 튜브(1mL 비드 현탁액/배양 L L)에 넣고 700× g 에서 2분 동안 스핀다운한 후 상등액을 제거합니다.
  8. 레진에 물 6mL를 넣고 1.7단계에서 세척 과정을 반복합니다.
  9. 물 대신 세척 버퍼(300mM NaCl, 50mM Tris[pH 7.5], 1mM EDTA, 20mM 이미다졸)로 세척을 두 번 반복합니다. 비드를 5mL의 세척 버퍼에 재현탁합니다.
  10. 용해된 세포(1.6단계)에 비드 슬러리(1.9단계)를 첨가하고 철저히 혼합합니다. 용해된 세포와 비드를 4°C에서 최소 1시간 동안 회전시킵니다.
    참고: 이 프로토콜의 나머지 부분에서는 수지를 건조시키지 말고 컬럼을 통해 흐르는 모든 샘플을 수집하십시오.
  11. 혼합물을 20mL 컬럼에 붓고 플로우스루를 수집합니다. 4 x 25mL의 세척 버퍼로 컬럼을 세척합니다.
  12. 1 x 10mL의 용리 완충액(300mM NaCl, 50mM Tris[pH 7.5], 1mM EDTA, 250mM Imidazole)을 새로운 15mL 튜브에 용리하여 조기 용출과 후기 용출을 별도로 수집합니다(조기 용출은 처음 1mL, 후기 용리는 최종 1mL).
  13. 용리 중에 HUH가 수집되었는지 확인하기 위해 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 수집된 모든 분획을 분석합니다( 보충 그림 S1 참조). 최상의 결과를 얻으려면 4-20% 젤을 로드하고 35W 및 200V에서 45분 동안 실행하십시오.
  14. 용출된 단백질을 투석 튜브에 넣고 4°C의 투석 완충액(용해 완충액과 동일)에서 밤새 배양합니다. HIS-tag를 제거하려면 단백질을 투석 튜브에 넣기 전에 환원제가 없는 ULP1을 용출된 단백질에 직접 첨가합니다.
  15. 다음날 아침, 1.7-1.9 단계에 설명된 대로 Ni-NTA 수지를 준비하고 투석된 단백질로 배양합니다. 단백질과 Ni-NTA 수지의 혼합물을 컬럼에 붓고 관류를 수집합니다. 10mL의 투석 버퍼로 컬럼을 세척하고 플로우스루를 수집합니다.
  16. 위의 설정에 따라 SDS-PAGE에서 수집된 분획을 평가하여 단백질이 존재하는지 확인하고, 분자량 컷오프가 10kDa인 15mL 초원심 필터를 사용하여 원하는 농도로 농축합니다( 보충 그림 S1 참조).
    참고: 이상적인 최종 단백질 농도는 40μM에서 100μM 사이입니다.

2. RAD-TGT 준비

  1. 10mM Tris(pH 7.5), 50mM NaCl 및 1mM EDTA 용액에서 40μM 리간드 가닥의 최종 농도에서 앵커 가닥(담금질 포함)과 리간드 가닥(형광단 포함)의 1.1:1 몰 비율로 듀플렉스를 조립합니다.
  2. 98°C에서 5분 동안 배양한 후 실온에서 1시간 동안 냉각하여 어닐링하는 단계; 빛으로부터 보호하십시오.
    참고: 소량 샘플은 쉽게 증발하며 완전히 회수하기 어려울 수 있습니다. 필요한 것보다 더 많은 양을 준비하십시오.
  3. 1mM MnCl2, 50mM HEPES(pH 8), 50mM NaCl을 포함하는 용액에서 10μM 듀플렉스 및 20μM HUH의 최종 농도에서 1:2 몰비로 어닐링된 듀플렉스를 HUH(어닐링 시 최소 농도 가닥, 이 경우 리간드 가닥 사용)와 반응시킵니다.
  4. 37°C에서 30분 동안 열 순환기 또는 빛 보호 열 블록에서 반응을 배양합니다. 배양 후 열을 제거하고 벤치 탑 미니필터를 사용하여 현재 조립된 TGT를 회전시킵니다. TGT를 즉시 플레이트에 넣거나 어두운 곳에서 4°C에서 보관하십시오.

3. 표면 처리

  1. 96웰 유리 바닥판을 개봉하는 즉시 모든 웰을 접착 PCR 플레이트 호일로 덮어 사용하지 않은 웰을 나중에 사용할 수 있도록 보존합니다. 면도날을 사용하여 관심 웰(가급적 가장자리가 없는 웰) 위의 호일을 잘라내고 원하는 웰에 100μL의 차가운 PBS를 추가합니다.
    알림: 액체가 우물에 추가되면 우물을 건조시키지 마십시오. 건조가 발생하면 생체 분자가 표면에 비특이적으로 흡착되어 데이터에 부정적인 영향을 미칩니다. 건조를 방지하기 위해 웰에 100μL의 초과 부피를 지속적으로 유지하십시오.
  2. 웰에 200μL의 차가운 PBS를 첨가하고 2-5회 부드럽게 피펫 믹스한 다음 200μL의 PBS를 제거합니다. 총 세 번 씻는 동안 반복합니다.
    알림: 웰에서 액체를 추가하고 제거할 때 표면을 방해하지 않도록 웰 가장자리의 피펫 팁을 45° 각도로 유지하십시오. 셀을 도금할 때를 제외하고 플레이트의 모든 취급에 대해 이 작업을 수행합니다.
  3. 실험용 웰의 경우, PBS에서 0.1 mg/mL Biotinylated-BSA 용액을 준비하고 용액 80 μL를 원하는 웰에 추가합니다. 대조군 웰의 경우 18.75μg/mL 피브로넥틴을 첨가하여 동일한 용액을 준비하고 각 웰에 80μL를 추가합니다. 사용된 모든 웰을 부드럽게 피펫으로 혼합하고 접시에 뚜껑을 놓고 호일로 덮습니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  4. 웰에서 80μL의 부피를 제거하고 3.2단계를 반복하여 웰을 세척합니다. 3.3단계와 동일한 방법으로 PBS 용액에 0.1mg/mL 뉴트라비딘 80μL를 추가합니다.
  5. 배양 후 웰에서 80μL의 부피를 제거하고 3.2단계를 반복합니다. 조립된 TGT(RAD-TGT 준비 단계 2)를 단계 3.3과 유사한 방식으로 PBS에서 0.1μM로 희석하고 80μL 용액을 웰에 희석합니다. 웰을 접착 호일로 덮고 4°C의 어두운 곳에 보관하거나 실험을 진행하기 전에 빛을 차단하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
    참고: 3.5단계를 중지 지점으로 취급하고 다음 날까지 기다렸다가 실험을 진행하는 것이 좋습니다.

4. RAD-TGT 실험 프로토콜

  1. TGT가 부착될 충분한 시간을 가지면 PBS로 웰(3.2단계 참조)을 3회 세척한 다음 무혈청 배지로 2회 세척합니다. 최종 세척 후 매체를 우물에 그대로 두십시오. 주변 웰에 200μL의 PBS를 추가하여 가장자리 효과를 완화하고 플레이트를 37°C 인큐베이터로 옮겨 플레이트를 예열합니다.
  2. ~80% confluency에서 관심 세포를 회수하고 배지를 흡인한 다음 PBS를 첨가하고 흡인하여 세포를 세척합니다. 적절한 양의 트립신을 추가하고 세포가 해리될 때까지(~5-10분) 플레이트를 37°C 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다.
  3. 세포가 해리되면 세포를 유지하는 데 사용되는 완전한 세포 배지의 원래 부피를 플레이트에 추가하고 혈청학적 피펫으로 재현탁합니다. 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브에 추가합니다.
  4. 300 × g 에서 4분 동안 세포를 원심분리하고, 배지를 흡인하고, 펠릿을 PBS에 재현탁합니다. 원심분리 및 흡인을 반복한 다음 무혈청 배지 5mL에 재현탁하고 원심분리 및 흡인을 반복합니다. ~2mL의 무혈청 배지에 세포를 재현탁합니다.
  5. 재현탁된 세포의 밀도를 측정하고 원하는 대로 농도를 조정합니다.
    참고: 웰당 ~15,000개의 세포를 플레이트링하는 것을 목표로 하여 세포를 150,000 cells/mL의 농도로 준비하여 15,000개의 세포를 100 μL의 재현탁 세포로 도금할 수 있습니다.
    1. 선택 사항: 약물 또는 기타 약리제의 효과를 테스트해야 하는 경우 세포에 적절한 농도의 약물을 추가하고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 다음 단계로 진행하기 전에 충분한 사전 배양 시간을 허용합니다.
  6. 인큐베이터에서 플레이트를 회수하고(4.1단계) 예열된 플레이트의 실험용 웰에서 세척 후 남은 매체의 부피를 제거합니다. 원하는 매체로 한 번 씻으십시오. 재현탁된 세포 100μL를 원하는 웰에 조심스럽게 피펫팅합니다. 도금된 세포를 90분 동안 인큐베이터로 옮깁니다.
    알림: 세포를 웰 중앙에 부드럽게 피펫으로 넣고 피펫을 수직으로 유지하려고 합니다.
  7. 배양 후 웰에서 ~125-170 μL의 부피를 제거합니다. 필요한 경우 200μL의 데운 PBS로 세포를 부드럽게 세척합니다. 각 웰에 50μL의 트립신을 추가하고 세포가 해리되기 시작할 때까지(5-10분) 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
    알림: 우물이 마르지 않고 과도한 트립신화가 발생하지 않는지 확인하십시오.
  8. 새로 준비된 흐름 완충액 160μL(1mM EDTA, 2% w/v 소 혈청 알부민, 차가운 PBS)를 웰에 추가합니다. 세포를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 해리하고, 이 세포 현탁액 196μL를 PCR 튜브에 첨가한 다음 4μL의 프로피듐 요오드화물을 첨가한 후 부드럽게 혼합합니다. 생존율 게이팅을 위한 대조군 역할을 하기 위해 프로피듐 요오드화물이 없는 하나의 대조군 샘플을 준비합니다.
  9. 뚜껑이 있는 얼음 양동이에 튜브를 넣고 유세포 분석기로 형광 강도를 측정합니다.

5. 데이터 수집 및 분석

  1. 유세포 분석기로 각 시료를 분석합니다. 샘플당 최소 2,000개의 살아있는 단일 세포를 수집하는 것을 목표로 합니다.
    참고: 아직 분석되지 않은 샘플의 경우 빛 노출을 최소화하고 얼음 위에 보관하십시오.
  2. 모든 데이터가 수집되면 파일을 선택한 소프트웨어로 전송하고 셀을 게이트합니다.
    1. 전방 산란 영역(FSC-A) 대 측면 산란 영역(SSC-A)에 의한 세포 게이트.
    2. FSC-A 대 전방 산란 높이(FSC-H)에 의한 세포 집단 내 싱글릿 게이트.
    3. 4.8단계에서 준비한 프로피듐 요오드화물 제어에 대해 가장 높은 값으로 프로피듐 요오드화물 면적 강도의 히스토그램에 수직 게이트를 설정하여 singlet 집단의 살아있는 세포에 대한 게이트. 게이트를 초과하지 않는 모든 이벤트는 라이브 셀입니다
    4. 세포 파편으로 인한 Cy5-A 채널의 비형광 이벤트를 제거하기 위해 싱글릿의 Cy5 영역(Cy5-A) 강도 히스토그램에 수직 게이트를 설정합니다. 이 수직 게이트가 분석된 라벨링되지 않은 세포보다 작지만 형광 강도가 0보다 큰 값인지 확인합니다.
    5. 세포 집단을 분석하려면 각 음성 대조군의 99번째 백분위수에 이등분 게이트를 설정합니다.
    6. 해당 실험 조건과 동일한 강도로 게이트를 적용하고 각 조건에 대해 음성 대조 게이트를 초과하는 세포의 백분율을 수집합니다.
      참고: 백분율은 적절한 통계 분석을 통해 생물학적 복제물 간에 직접 비교할 수 있습니다. 대표 데이터를 참조하십시오.
  3. 중앙값 Cy5 형광을 사용하여 데이터를 분석하고, 리간드-WDV의 중앙값을 WDV의 중앙값으로 나누고 이러한 값을 반복 간에 비교합니다.

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결과

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RAD-TGT의 유용성과 사용 편의성을 입증하기 위해 CHO-K1 세포의 기계형에 대한 Rho Kinase(ROCK) 억제제의 효과를 분석했습니다. ROCK 경로는 액틴 조직 및 미오신 활성화에 관여합니다. TGT를 사용한 이전 연구에서는 ROCK 억제가 TGT 전단 파열을 감소시킨다는 것을 보여주었습니다 16,17,18. 전단 또는 고하중 TGT는 국소 접착을 통해 가해지는 수축력에 대해 보고하는 반면, 지퍼가 풀리거나 낮은 힘의 TGT는 초기 접착, 세포 확산 및 국소 접착 형성의 초기 단계에 관여하는 낮은 세포력에 민감합니다. 따라서, Y-27632 처리는 이전에 미오신 II 억제제 블레비스타틴11에서 관찰한 바와 같이 TGT 압축 해제의 효과가 적으면서 차량 제어에 비해 전단 구조에서 RAD-TGT 형광 신호를 감...

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토론

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당사는 생명 과학 분야의 과학자들이 워크플로우에 메카노타이핑을 통합하도록 장려하기 위해 RAD-TGT 실험을 설정하고 수행하는 방법에 대한 프로토콜을 제공했습니다. 특히 단백질 생산 능력이 있는 RAD-TGT의 주요 이점은 HUH 엔도뉴클레아제를 사용하여 화학적 가교 및/또는 정제 없이 높은 충실도로 리간드를 DNA 듀플렉스에 접합한다는 것입니다. HUH 엔도뉴클레아제는 부위 특이적 방식으로 단일 가닥 DNA에 결합하는 뉴클레아제 계열을 포함합니다. HUH는 다음 결합을 통해 DNA 골격을 절단하고 새로 노출된 5' 말단과 공유 부가물을 형성하기 때문에 특히 흥미롭습니다. 이러한 반응은 빠르며 몇 분 내에 완료될 수 있습니다. HUH는 크기가 작고 메커니즘이 간단하기 때문에 많은 단백질의 말단에 추가될 수 있으며 원래 단백질과 HUH 유지 기능이 모두 가능합니다. 우리는 이를 활용하여 관심 리간드를 듀플렉스에 빠르게 접합하여 장력 게이지 테더를 1단계 반응으로 조립했습...

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공개 사항

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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.R.G.는 NIH R35GM119483의 자금 지원을 인정합니다. Biorender는 도형 회로도를 만드는 데 사용되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 mL 원뿔형 튜브Sarstedt62.554.205
96 웰 유리 바닥 플레이트CellvisP96-1.5H-N
접착제 PCR 플레이트 호일Thermo Fisher ScientificAB-0626
AmpicillinApex Bioresearch 제품 25-530
Bio-Rad 20mL 컬럼Bio-Rad7321010
Biotinylated BSAThermo Fisher Scientific29130
BL21 (DE3) Competent E. coliNew England BiolabsC2527H
소 혈청 알부민Thermo Fisher ScientificBP9703100
세포 배양 인큐베이터Thermo Fisher Scientific51030284
원심분리기Thermo Fisher Scientific75009521
CHO-K1ATCCCCL-61
투석 튜빙Thermo Fisher ScientificPI88242
DMSOThermo Fisher ScientificD12345
EDTAThermo Fisher ScientificS311-100
Flow 사이토미터BDAccuri C6 Plus
FlowJo BDFlowJo v10.10
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-1
이미다졸Thermo Fisher ScientificO3196-500
IPTGIBI ScientificIB02125
LB 한천Fisher ScientificBP1425-500
리간드 스탠드통합 DNA 기술사용자 설계 올리고GCT ATA, AAC, TCA CCG, TAA TTT, TTT, GGC, CCG, CAG, CGA, CCA, CCC, TTT /3Cy5Sp/
용해 육수(LB)Thermo Fisher ScientificBP1426-500
MnCl2Thermo Fisher ScientificM87-100
NaClThermo Fisher ScientificBP358-212
NeutrAvidinProtein Thermo Fisher Scientific31000
Nickel-NTA 수지 Thermo Fisher Scientific88222
PBSCorning21-031-CV
페트리 디쉬VWR25384-342
프로피듐 요오드화물 용액케이맨 화학 물질10008351
SDS-PAGE 젤Bio-Rad4561096
무혈청 매체Thermo Fisher ScientificA4124801Gibco Optimem 중고, 대체 혈청 무함유 배지는 사용해도 괜찮습니다
Shearing AnchorStrand Integrated DNA 기술사용자 설계 oligo/5IAbRQ//iBiodT/G GGT, GGT, CGC, TGC, GGG CC
Sonicator,Thermo Fisher Scientific15-345-139
Thermal Cycler,Bio-Rad1861096
TrisThermo Fisher ScientificBP152-500
TrypinThermo Fisher Scientific12605036
초원심 필터, 10 kDa 차단Amikon
Unzipping Anchor StrandIntegrated DNA Technologies사용자 설계 oligo/5IAbRQ/GG GTG GTC GCT GCG GGC C/3Bio/
WDV PlasmidAddGene226983
WDV-Echistatin PlasmidAddGene226985
Y-27632Selleck ChemicalsS1049DMSO에서 재구성되었습니다.
, . 는

참고문헌

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