방법 논문

Isolation and Identification of Bacterial Sstrain from Skin of Terrestrial Amphibians(육상 양서류의 피부에서 박테리아 균주의 분리 및 식별)

DOI:

10.3791/67862

⸱

2025년 6월 17일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life, Health, and Environmental Sciences (MeSVA), University of L'Aquila

이 논문에서

요약

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이것은 유럽 과다도롱뇽(Speleomantes 속)의 피부 미생물총(microbiota)에서 배양 가능한 박테리아를 샘플링하고 분리하는 방법입니다. 여기에서는 면봉으로 도롱뇽 피부를 샘플링하고 배양 가능한 접근 방식을 사용하여 처리하는 프로토콜을 제시합니다. 우리는 박테리아 균주 특성화를 통해 axenic 배양의 샘플링, 분리 및 확립에 대해 설명합니다.

초록

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미생물총(microbiota)은 고등 유기체의 필수 요소이며, 피부 미생물총(microbiota)은 외부 인자에 대한 유기체의 방어에 크게 기여합니다. 미생물 배양 접근법을 위한 Speleomantes (Amphibia: Plethodontidae) 피부 미생물 군집을 샘플링하는 표준 방법은 없습니다. 이 문제를 해결하기 위해 당사는 개인의 피부에서 박테리아를 분리하기 위한 실용적인 프로토콜과 샘플 취급 및 보관을 위한 모범 사례를 개발했습니다. 단계는 간단합니다: 면봉은 샘플링 시 글리세롤이 보충된 생리학적 식염수에 보관됩니다. 실험실로 이송된 면봉은 미생물 군집의 무결성을 보장하기 위해 최대 10일 동안 +4°C에서 보관할 수 있습니다. 이 연구는 Speleomantes 속에 속하는 것과 같은 육상 양서류 종의 피부 미생물군 조사에 대한 흥미로운 통찰력을 제공합니다. 이 접근 방식은 멸종 위기에 처한 종에 대한 조치를 구현, 모니터링 및 보존하는 데 기여하며 양서류의 건강 및 생태학에서 미생물총의 기능에 대한 지식을 향상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 많은 야생 동물 보호 시나리오에서 마이크로바이옴 연구에 더 광범위한 중요성을 가질 수 있습니다.

서론

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모든 유기체는 상피 표면, 조직 및 장기에 다양한 미생물 공생체를 보유하고 있습니다1. 피부는 숙주와 환경 사이의 주요 인터페이스로서 다양한 미생물의 서식지를 제공합니다2. 피부는 척추동물의 가장 큰 기관이며 기계적, 화학적, 미생물적 공격에 대한 장벽 역할을 합니다3. 그러나 피부가 환경 조건에 광범위하게 노출됨에 따라 피부는 유기체와 외부 생물 및 비생물적 요인과의 상호 작용을 중재하는 가장 중요한 생태학적 개척지가 될 수 있습니다4.

양서류의 피부 미생물총(skin microbiota)은 지난 10년 동안 집중적으로 연구되어 왔으며, 이 미생물 군집과 숙주 사이의 관계는 5,6,7,8,9,10 에 대해 깊이 탐구되어 왔습니다. 피부 미생물총(skin microbiota)의 생물 다양성은 주로 숙주의 유형(즉, 종 특이적 군집)에 의해 결정되지만, 추가적인 환경적 요인은 더 높은 종간 다양성을 촉진할 수 있다11. 양서류의 피부 미생물총(microbiota)은 다른 동물과 독특한 구성을 가지고 있습니다. 양서류는 피부 미생물과 상호 관계를 맺고 있는 것으로 알려져 있으며, 항균 화합물을 생합성하거나 신종 전염병으로부터 숙주를 보호할 수 있는 것으로 알려져 있다12.

피부에서 박테리아를 분리하는 것은 일반적으로 다른 단계를 수행 한 후에 도달합니다. 첫 번째 단계는 면봉을 통해 대표적인 시료를 채취하고 외부 오염을 방지하는 것입니다. 미생물 샘플은 멸균 식염수 또는 완충액에 부유합니다. 현탁액에 보호제(예: 글리세롤)를 보충하면 실험실 이송 중에 박테리아 군집 무결성을 향상시킬 수 있습니다13,14. 실험실로 이송된 샘플은 미생물 군집 무결성을 유지하기 위해 즉시 또는 짧은 시간 후에 처리할 수 있습니다. 고전적인 미생물 접근법은 연속 희석을 통한 시료 처리를 포함하여 미생물 밀도를 줄이고 페트리 플레이트에서 더 나은 콜로니 분리를 보장합니다. 그런 다음 샘플 및 연속 희석액을 한천 Luria-Bertani (LBA) 15, 트립 소이 (TSA) 16, 트립톤 효모 추출물 한천 (TYEA) 17 , 18 , 19 또는 영양소 (NA) 20 와 같은 비특이적이고 비선택적인 배지에 줄무늬를 만듭니다. 샘플링 및 처리 중 비선택적 농축이 사용되는데, 이는 광범위한 미생물을 배양해야 하기 때문입니다. 줄무늬 또는 스프레드 플레이트 방법은 미생물 현탁액을 한천표면(21)에 고르게 분포시킵니다. 균일한 분포는 샘플에 존재하는 다양한 미생물 종이 별개의 군체를 형성할 수 있도록 합니다. 20-37 °C에서 2-7 일 동안 배양 한 후, 미생물 집락은 형태에 따라 계산되고 구별됩니다. 박테리아 군집의 형태학적 특성화는 색소, 형태, 고도, 여백, 불투명도 및 표면을 기준으로 수행되었습니다. 가장 높은 희석액에서 잘 격리된 콜로니는 미생물 배양을 정제하기 위해 신선한 한천 플레이트로 하위 배양됩니다. 콜로니의 순도는 세포 균일성과 그람 염색에 대한 친화력에 따라 보장됩니다. 콜로니의 순도를 확인하기 위해 여러 가지 생화학적 또는 분자 테스트를 수행할 수도 있습니다22. 분리된 균주의 순수 배양액은 단기 사용을 위해 4°C의 한천에 저장하거나 동결 보호제(예: 20:80 또는 50:50의 글리세롤-중간 비율)로 -80°C에서 장기간 보존할 수 있습니다(예: 20:80 또는 50:50의 글리세롤-중간 비율)23.

이 프로토콜에서는 지표와 지하 환경 모두에서 살 수 있는 육상 양서류인 Speleomantes 동굴 도롱뇽의 피부 미생물군에서 박테리아를 분리하는 모범 사례 접근 방식을 보고합니다24. 문헌에 보편적으로 적용되는 프로토콜이 없다는 점을 감안할 때, 이 연구는 이러한 육상 양서류의 피부 미생물군 샘플을 샘플링하고 보존하기 위한 모범 사례를 개발하는 것을 목표로 했습니다. 이 프로토콜을 테스트하기 위해 이탈리아 동굴 도롱뇽(Speleomantes italicus)을 모델로 사용하여 이탈리아 아브루초(Abruzzo)에 위치한 동굴 개체군에서 12명의 개체를 샘플링했습니다. 개인은 손으로 채취하여 등쪽, 복부 측면 및 옆구리를 반복적으로(최소 5회) 면봉으로 채취했습니다. 사용한 면봉은 멸균 증류수에 담갔다. 그런 다음 면봉을 글리세롤 보충 유무에 관계없이 생리학적 0.9% 식염수에 담그었습니다. 실험실로 이송된 후 10일 동안 제어되지 않은 실온, 4°C 및 -20°C의 다양한 조건에서 샘플 보존 테스트를 수행했습니다. 배양 가능한 미생물 군집은 일반 및 반선택적 배지(LBA, TSYEA, TSA, NA)에서 배양 기반 방법을 사용하여 비교되었습니다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 박테리아 균주를 분리하기 위한 미생물 배양 가능한 접근법을 위해 Speleomantes 피부 샘플을 획득하고 처리하기 위한 모범 사례를 제시합니다. 다음 단계에서 유용한 재질은 재료 표에 나열되어 있습니다. 이 의정서는 이탈리아 환경부의 승인에 따라 DPR 357/97 11조의 동물 관리 지침을 따릅니다(2024년 4월 22일 PNM 74554).

1. 배지 준비

  1. 성분 분말의 양을 계산하고 무게를 잰다(LBA, TSYEA, TSA, NA 또는 기타 매체에 사용되는 분말의 양은 제조업체의 지침 참조).
  2. 제조업체의 지침에 따라 증류수에 성분을 녹이십시오. 매체 및 구매한 제품에 따라 끓는 단계가 필요할 수 있습니다.
  3. 성분이 완전히 용해되고 pH를 제어하면 배지를 최종 부피로 가져옵니다. 값이 예상보다 높거나 낮으면 제조업체의 지침에 제안된 솔루션을 사용하여 조정하십시오. HCl 및 NaOH 용액은 일반적으로 pH를 각각 낮추고 증가시키는 데 사용됩니다.
  4. 한천(2% w/v)을 넣고 95°C까지 가열한 후 약 1분 동안 끓여 한천을 녹인 후 고압멸균합니다.
  5. 제조업체의 지침에 따라 고압증기멸균으로 배지를 살균합니다. 일반적인 오토클레이브 공정에는 15-30분 처리를 위한 121-134°C가 포함됩니다.
  6. 고압증기멸균 후 한천 배지를 약 45-50°C로 냉각하고 이전에 멸균된 층류 후드 아래의 멸균 페트리 접시에 붓습니다.
  7. 응고 후 매체 유형과 준비 날짜에 따라 플레이트에 라벨을 붙입니다.

2. 샘플 수집

  1. 도롱뇽의 피부(Speleomantes 속)를 멸균 증류수로 헹구어 일시적인 미생물 군집을 제거합니다.
  2. 시험관에 멸균된 면봉을 사용하여 양서류의 피부 면봉을 수집합니다. 면봉을 피부 표면에 부드럽게 문질러 개인에게 해를 끼치 지 않고 미생물 샘플을 수집합니다.
    1. 멸균 증류수에 적신 면봉을 모든 사지를 포함한 전신의 양쪽에 5회(앞뒤로 5번) 통과시켜 개인을 샘플링합니다.
      참고: 첨가제를 첨가하는 것은 개인에게 해를 끼칠 수 있으므로 권장하지 않습니다.
    2. 글리세롤(0.9%)이 보충된 생리식염수(20% NaCl)가 들어 있는 튜브에 면봉을 넣습니다.
  3. 샘플을 용액과 혼합하여 튜브를 짜고 면봉을 완전히 회전시키면서 면봉을 튜브 벽 쪽으로 밀어 넣습니다(시계 방향 10회, 시계 반대 방향 10회).
  4. 혼합 후 튜브 내부의 면봉을 닫고 미생물 샘플을 실험실로 옮기고 미생물 분석까지 샘플을 4°C로 유지합니다.
    참고: 모든 단계는 오염과 작업자가 생물학적 및 화학적 오염 물질에 노출되는 것을 방지하기 위해 각 개인에 대해 새로운 멸균 재료와 장갑을 사용하여 수행됩니다.

3. 접종 및 잠복기

  1. 미생물 샘플을 철저히 혼합하십시오.amp처리하기 전에.
  2. 10-1에서 10-6 범위의 식염수(0.9% NaCl)로 피부 샘플의 연속 희석액을 준비합니다.
  3. 100μL의 as-is 샘플과 연속 희석액을 준비된 한천 플레이트에 접종합니다. 멸균 L자형 루프를 사용하여 한천 매체의 표면을 가로질러 샘플을 줄무늬로 만들고 한천 손상을 방지하기 위해 과도한 압력을 가하지 않고 균등하게 분배합니다.
  4. 접종된 플레이트를 20-25°C의 인큐베이터에서 3-5일 동안 뒤집습니다. 이 온도 범위는 양서류 피부에 서식하는 많은 환경 중온성 및 향정신성 박테리아를 성장시키는 데 유리합니다.
    참고: 모든 단계는 이전에 멸균된 층류 후드 아래에서 멸균 재료를 사용하여 수행됩니다. 각 실험 단위에 대해 5개의 독립적인 반복실험이 준비됩니다. 시작 밀도는 알 수 없고 예측할 수 없기 때문에 광범위한 희석액을 포함하는 것이 항상 도움이 됩니다.

4. 균주 정화 및 식별

  1. 배양 후 추가 분석을 위해 뚜렷한 형태를 가진 박테리아 콜로니를 선택합니다.
    1. 첫째, 오염이나 중복을 피하기 위해 잘 격리된 군체를 선택하고 군체가 병합될 수 있는 밀집된 지역을 피하십시오. 또한 모양이 다른 군체(예: 색상, 크기, 모양, 가장자리, 표면 또는 질감)가 다른 군체를 선택하여 잠재적으로 다른 종 또는 균주의 샘플링을 보장합니다.
      참고: 이 단계는 피부 미생물총(microbiota)의 다양한 배양 가능한 박테리아 균주를 선택하는 데 중요합니다.
  2. 선택한 식민지를 하위 배양합니다.
    1. 접종 루프를 사용하여 원래 한천 플레이트의 잘 격리된 콜로니를 무균으로 새로운 한천 플레이트로 옮깁니다. 군체를 줄무늬로 만들어 격리한 다음 적절하게 배양하십시오.
    2. 새로운 한천 플레이트에서 이 단계를 여러 번 반복하여 분리된 콜로니가 비슷하게 나타날 때까지 각 박테리아 분리물에서 순수한 배양물을 얻습니다. 선택적이고 일반적인 매체를 사용하여 subculturing을 반복합니다.
      참고: 무균 취급, 육안 및 현미경 검사, 분자 식별을 결합하여 오염 없는 변형을 보장합니다.
  3. 현미경 관찰(5x 대물렌즈에서 100x 대물렌즈까지), 그람 염색 친화도(집락 고정, 착색 및 관찰) 및 생화학적 테스트(예: 카탈라아제, 산화효소, 우레아제 및 설탕 발효 테스트)를 통해 미생물 배양의 순도를 확인합니다.21,25.
    참고: 순수 배양은 균일한 집락 형태, 일관된 미시적 특성 및 생화학적 특성을 보여야 합니다.
  4. 분자 식별을 수행합니다.
    1. 정제된 박테리아 군집체에서 DNA를 추출하고 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 수행하여 박테리아 종을 식별합니다. 박테리아 범용 프라이머를 사용하여 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭을 수행한 후 GenBank26과 같은 데이터베이스에서 알려진 염기서열분석 및 비교합니다.
  5. 바이오뱅크 배양을 확립합니다.
    1. 축삭(또는 순수) 배양물을 비선택적 배지에 접종하고 오염 물질의 성장이 없는지 확인하여 무균 여부를 테스트합니다. 중장기 사용을 위해 axenic culture를 보관하십시오.
      참고 : 표준 방법에는 선택적 배지 및 실온 저장의 한천 경사면에 줄무늬 콜로니, 선택적 배지와 글리세롤의 혼합물로 제조 된 원액에서 배양을 현탁 (20:80 또는 50:50) 또는 육수 배양 동결 건조(동결 건조) 및 -80 °C에서 동결하는 것이 포함됩니다.

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결과

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실험적 접근 방식의 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다.

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그림 1: 양서류 피부 샘플의 샘플링, 취급 및 처리 작업 흐름.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜의 첫 번째 중요한 단계는 동물 윤리에 따라 멸균 장갑과 면봉을 사용하여 양서류로부터 샘플을 수집하는 것입니다. 이 단계...

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토론

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우리는 양서류 피부 미생물총(microbiota)에서 배양 가능한 박테리아 군집을 얻기 위한 모범 사례 프로토콜을 개발했으며 이를 Speleomantes italicus에서 입증했습니다. 위의 응용 프로그램에서 입증된 바와 같이, 양서류 피부에서 성공적인 미생물 분리를 보장하기 위해 몇 가지 단계를 수행해야 합니다. 부드러운 면봉 기술과 멸균 물질을 사용한 채취는 충분한 미생물 물질을 수집하고 오염을 방지하는 데 매우 중요합니다. 글리세롤이 보충된 식염수로 덮인 면봉을 4°C에서 운송 및 보관하는 것은 추가 분석이 있을 때까지 미생물 생존력을 보존하는 데 필수적입니다. 접종 및 배양은 한천 플레이트에서 미생물 종을 분리하기 위해 적절한 희석 및 줄무늬 방법이 필요한 중요한 과정입니다33. 20-25 °C의 배양 온도는 양서류 피부에 서식하는 미생물의 성장을 촉진하여 다른 종 간의 경쟁을 줄이는 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

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우리는 Sub-BioMon - Developing and testing approaches to monitor sub-Biomon project의 맥락에서 "Progetti di Ateneo per la Ricerca di base 2024 UNIVAQ: Ecotoxicology of the endangered European cave salamanders" 및 "Analisi delle divergenze inter- e intraspecifiche del microbiota dei pletodontidi europei - FFORIC24.35" 프로젝트에서 라퀼라 대학교의 재정적 지원을 인정합니다. 2022–2023 BiodivMon 공동 통화, 국가 복구 및 회복력 계획(NRRP), 미션 4, 구성 요소 2, 투자 1.1, 입찰 번호 1409, 이탈리아 대학 연구부(MUR)가 2022년 9월 14일에 발표하고 유럽 연합이 자금을 지원함 - NextGenerationEU- 프로젝트 코드: P2022CYF9L, 프로젝트 제목 통성 동굴 종은 금속 오염 물질을 지하 환경으로 유입시키는 동인입니까? (METALCAVE) - 컵 E53D23015380001.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Lauria-Bertani 한천Merk MilliporeL3027
트립스 대두 한천Merk Millipore22091
트립톤 대두 효모 추출물 한천Merk Millipore17221
영양 한천Merk Millipore70148
글리세롤 용액Merk Millipore49781

참고문헌

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