이 프로토콜은 죽상경화증의 메커니즘과 진행에 대한 보다 심층적인 연구를 용이하게 하기 위해 죽상경화성 플라크의 정량적 분석을 위한 포괄적인 방법론을 제공합니다.
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방법 논문
Isolation and Analysis of Aortic Arch and Root Lesions in an Atherosclerotic Mouse Model(죽상경화성 마우스 모델에서 대동맥궁 및 뿌리 병변의 분리 및 분석)
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
심혈관 질환의 주요 원인인 죽상동맥경화증은 병변 발달 및 진행에 대한 상세한 검사가 필요합니다. 이 연구는 널리 사용되는 죽상경화성 마우스 모델인 저밀도 지단백질 수용체 녹아웃(Ldlr-/-) 마우스에서 대동맥궁 및 뿌리 병변의 분리 및 조직학적 분석을 위한 포괄적인 프로토콜을 소개합니다. 대동맥궁과 뿌리는 죽상경화성 병변의 핵심 부위이며, 이들의 검사는 죽상동맥경화증의 발병, 진행 또는 퇴행을 평가하고, 심혈관 질환 위험을 예측하고, 잠재적인 치료 표적을 식별하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 조직 분리, 고정, Oil Red O 염색, 대동맥근 절편, Hematoxylin 및 Eosin(HE) 염색, Verhoeff-Van Gieson(VVG) 염색 및 이미지 분석을 포함하여 대동맥궁 및 뿌리의 죽상경화성 부담을 정량화하는 방법을 설명합니다. 오일 레드 O 염색은 대동맥궁의 플라크 면적을 측정하여 죽상동맥경화증의 중증도를 평가하고, 대동맥근의 HE 염색은 지질핵 및 섬유낭과 같은 플라크 성분을 드러내어 플라크 안정성 및 파열 위험을 쉽게 평가할 수 있습니다. VVG 염색은 조직 내 콜라겐 섬유를 염색할 수 있어 플라크 구성 및 관련 정보에 대한 추가 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 철저한 분석은 병변 발달 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하며 죽상동맥경화증을 예방하고 치료하기 위한 새로운 치료 전략을 수립하는 데 도움이 될 수 있습니다.
서론
심혈관 질환, 특히 죽상동맥경화증은 전 세계적으로 상당한 건강 부담이자 주요 사망 원인으로 부상하고 있습니다 1,2. 죽상동맥경화증은 지질이 점진적으로 축적되고 동맥벽에 플라크가 형성되는 것을 특징으로 하는 만성 진행성 염증성 질환으로, 궁극적으로 동맥 내강이 좁아지고 잠재적으로 플라크가 파열되어 심근경색 및 뇌졸중과 같은 급성 심혈관 질환을 유발합니다 1,2,3. 인간의 건강에 미치는 지대한 영향을 감안할 때 죽상동맥경화증의 기전을 이해하고 효과적인 치료 전략을 개발해야 할 긴급한 필요성이 있습니다.
최근 몇 년 동안 동물 모델은 죽상동맥경화증에 대한 이해를 증진하는 데 중요한 역할을 했습니다. 다양한 종 중에서 생쥐는 빠른 번식, 낮은 유지 보수 비용 및 고급 유전자 조작 기술의 가용성으로 인해 선호되는 모델로 부상했습니다 4,5
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프로토콜
이 연구에 사용된 모든 동물 프로토콜은 상하이 체육 대학의 동물 실험 윤리 검토 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 시약 및 해부 도구의 준비
- 가는 가위, 곧은 집게, 구부러진 집게, 스프링 가위 및 핀을 포함한 해부 도구를 미리 오토클레이브로 소독하십시오.
- 75% 에탄올: 75mL의 무수 에탄올과 25mL의 ddH2O를 혼합합니다.
- 1x 인산염 완충 식염수(PBS): 0.01M PBS 분말을 ddH2O2L에 용해시킵니다.
- 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액: 흄 후드의 자석 교반기에서 800mL의 1x PBS를 약 60°C로 가열합니다. 파라포름알데히드 분말 40g을 천천히 넣고 계속 저어줍니다. 완전히 용해될 때까지 1N NaOH로 적정합니다. 실온으로 식히고 PBS 1개로 부피를 1L로 조정하고 필터를 걸러내고 pH를 7.2-7.4로 조정합니다.
주의 : PFA는 신중한 취급과 안전 프로토콜의 엄격한 준수가 필요한 유해 화학 물질입니다. - Oil Red O의 스타킹 용액 : 100 % 이소프로판올 500mL에 Oil....
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결과
대표적인 결과는 죽상경화성 마우스 모델에서 대동맥궁 및 뿌리 병변에 대한 격리 및 분석 기술의 적용을 보여줍니다. 이러한 결과는 죽상경화성 병변을 식별하고 특성화하는 기술의 능력에 대한 명확한 증거를 제공합니다. 예를 들어, 특정 염색(예: Oil Red O)이 있는 조직학적 이미지는 지질 축적을 강조하는 반면, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 동맥벽의 구조, 지질 코어의 존재 및 괴사 영역을 포함한 죽상경화성 병변의 전반적인 형태를 보여줍니다. H&E 염색 절편을 분석하여 대동맥의 병변 발달 및 구조적 변화 정도를 평가할 수 있으며, 플라크 진행 및 조직 리모델링에 대한 개요를 제공할 수 있습니다.
이 프로토콜에서는 4개월 동안 서양식 식단(WTD)을 먹인 12주 된 C57 Ldlr 녹아웃 마우스와 대조군으로 차우 식단을 먹인 Ldlr-/- 마우스에서 죽상경화성 병변의 정도를 분석했습니다.
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토론
여기에서는 Ldlr 녹아웃 마우스의 대동맥 샘플링 방법과 플라크의 정량 분석에 대한 자세한 정보를 제공합니다.
박리 절차의 정확성은 죽상동맥경화증의 마우스 모델에서 생체 내 대동맥 박리에 대한 가장 큰 기술적 과제입니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 요점은 다음과 같습니다 : (1) PBS를 사용하여 동맥의 모든 혈액을 씻어 내고 대동맥 아치 가지와 혈관 주위 지방의 비교를 증가시킵니다. (2) 인내심을 가지십시오. 쥐 대동맥의 크기가 작기 때문에 수술은 신체 현미경으로 수행해야 하며 수술 오류를 최소화하기 위해 고품질의 현미경 클리퍼와 집게를 사용해야 합니다. (3) 용기의 절단이나 손상을 방지하기 위해 스트리핑이 정확하고 올바른 방향으로 시작되도록 보장하는 것이 필수적입니다.
생쥐의 대동맥 기름 적색 O 염색과 관련하여, 공식적인 염색 전에 분리된 .......
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공개 사항
선언할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 상하이 스포츠 대학의 운동 및 공중 보건 연구 프로그램(0831), 상하이 고등 교육 젊은 교사 훈련 기금 프로그램(A2-0213-22-0058-5), 상하이 시 과학 기술 위원회 상하이 우수 학술 지도자 계획(21XD1403200)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 접착 현미경 슬라이드(25회; 75mm) | CITOTEST | Cat# 80312-3161 | |
| 임베딩 카세트 | CITOTEST | Cat# 80106-1100-16 | |
| 에오신 염색 용액 | Beyotime | Cat# C0109 | |
| 에탄올 | Sinopharm 화학 시약 Co. | Cat# 10009218 | |
| Hematoxylin 염색 용액 | Beyotime | Cat# C0107 | |
| 저프로필 일회용 블레이드 | Leica | Cat# 14035838925 | |
| 현미경 커버 유리(24× 50mm) | CITOTEST | Cat# 10212450C | |
| 중립 발삼 장착 매체 | Sango Biotech | Cat# E675007-0100 | |
| 오일 레드 o 파우더 | Sigma-Aldrich | Cat# 1320-06-5 | |
| 파라핀과 세레진 | Sinopharm 화학 시약 Co. | Cat# 69019461 | |
| 파라포름알데히드 | Servicebio | Cat# G1101 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS, 분말) | Servicebio | Cat# G0002-2L | |
| Ponceau S 염색 용액 | EveryLab | Cat# FM024 | |
| Victoria Blue' B | 알라딘 | Cat# 2580-56-5 | |
| 자일렌 | 시그마-알드리치 | cat# 104-81-4 |
참고문헌
- Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 56(2019).
- Herrington, W., Lacey, B., Sherliker, P., Armitage, J., Lewington, S. Epidemiology of atherosclerosis and the potential to reduce the global burden of atherothrombotic disease. Circ Res. 118<....
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