방법 논문

Multi-color 유세포분석법을 통한 혈소판 하위 모집단 분석

DOI:

10.3791/67878

⸱

2025년 6월 10일

 ,  , 
1Department of Cardiology and Angiology, University Hospital Tübingen, University of Tübingen

이 논문에서

요약

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혈소판에 대한 다색 유세포 분석은 고전적인 혈소판 하위 집단 내에서 휴지 혈소판, 응집성 혈소판, 단백질 응고제 및 자가사멸성 혈소판과 같은 새로운 혈소판 하위 유형을 식별할 수 있습니다. 이를 통해 다양한 혈소판 작용제에 의해 유도된 다양한 하위 집단 패턴을 비교할 수 있습니다. 여기에서는 multi-color 유세포 분석 패널을 설정하는 절차를 자세히 설명합니다.

초록

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혈소판 또는 혈소판은 지혈과 혈전증에 중요한 역할을 하는 작은 핵 혈액 세포입니다. 혈소판 기능의 결함은 심혈관 질환 환자에서 출혈 또는 혈전성 사건을 유발할 수 있습니다. 그러므로, 혈소판 기능(platelet function)에 혈소판 하위모집단(platelet subpopulation)을 할당할 수 있도록 표현형적으로 혈소판을 특성화하는 것이 중요합니다. 혈소판 작용제와 활성제를 이용한 인간 혈소판 자극은 표면 수용체 집단의 변화를 동반하여 혈소판의 형태학적, 생리학적 변화를 유도합니다. 이는 기능적으로 다양한 혈소판 하위 집단으로 이어집니다. 고전적으로 정의된 혈소판 하위 모집단은 휴지 혈소판(resting, aggregatory), 혈소판(procoagulant) 및 자가사멸성 혈소판(apoptotic platelets)입니다. 혈소판 아형에 대한 작용제의 효과를 특성화하기 위해 10가지 항체 및 염료(anti-CD62P, anti-CD63, anti-CD61, anti-CD41, anti-CD42b, anti-IntegrinαIIbβ3 (clone: PAC-1), anti-CXCR4, anti-ACKR3, Annexin V, Zombie NIR)로 구성된 다색 유세포 분석을 사용하여 분석을 구축했습니다. 분리된 인간 혈소판을 혈소판 작용제로 배양하고 특정 형광단 접합 항체 및 염료로 염색했습니다. 그 후, 유세포 분석으로 측정했습니다. 이를 통해 고전적인 4개의 하위 모집단 내에서 작용제 특이적 하위 유형을 정의할 수 있습니다. 결론적으로, 이 원고에 기술된 10색 유세포분석 패널을 구성하는 활성화 마커(anti-CD62P, anti-CD63, anti-IntegrinαIIbβ3 (클론: PAC-1)), 염증 마커(anti-CXCR4, anti-ACKR3) 및 apoptotic marker(Annexin V, Zombie NIR)의 조합은 특정 혈소판 기능과 연결될 수 있는 추가 혈소판 아형을 정의할 수 있는 가능성을 열어줍니다. 이 방법은 혈소판 기능 및 생리학에 대한 기초 연구뿐만 아니라 질병 모델 및 환자 연구에서 새로운 혈소판 아형을 정의하는 데 적용할 수 있습니다.

서론

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혈소판이라고도 하는 혈소판은 지혈과 혈전증 발병에 필수적인 작고 핵이 없는 혈액 세포입니다 1,2. 다양한 혈소판 작용제에 의해 활성화될 수 있습니다. 고전적인 생리학적 혈소판 작용제는 P2Y12 및 P2Y1 수용체에 결합하는 아데노신 이인산(ADP), PAR1 및 PAR4 수용체를 통해 혈소판을 활성화하는 트롬빈, 당단백질 VI와 상호 작용하는 콜라겐입니다. 콜라겐은 체외 실험에서 콜라겐 관련 펩타이드(CRP-XL)로 대체할 수 있습니다.3,4. 최근 헤민은 C형 렉틴 유사 수용체(CLEC-2)와 당단백질 VI(GPVI)의 상호작용에 의해 혈소판 활성화를 유도하는 것으로 나타나 헤민을 새로운 내인성 혈소판 활성제/작용제로 확립했습니다 5,6. 여러 병리학적 상황이 용혈로 이어질 수 있으며, 그 결과 유리 철분 함유 헤민이 방출될 수 있습니다. 이러한 모든 혈소판 작용제는 혈소판의 표면 수용체 발현을 변경합니다. 표면 수용체와 원형질막의 변화는 혈소판 작용제의 강도와 농도에 따라 달라집니다 7,8,9. 따라서 혈소판 기능(platelet function)에 혈소판 하위 모집단(subpopulation)을 할당할 수 있도록 혈소판을 표현형적으로 특성화하는 것이 중요합니다.

유세포 분석법(flow cytometry)과 같은 고차원적 방법은 혈소판이 뚜렷한 기능을 가진 하위 집단을 형성한다는 것을 밝혀냈습니다. 하위 모집단은 서로 다른 표면 마커로 분류할 수 있습니다. 문헌에서는 두 개의 뚜렷한 혈소판 하위 집단이 존재한다는 것이 잘 알려져 있습니다: 포스파티딜세린 외재화를 특징으로 하는 procoagulant와 integrin αIIIbβ 3 을 활성화하는 응집 표현형.고전적인 활성화 마커 외에도 미토콘드리아 기능과 산화 스트레스를 감지하는 글루타티온-S-아릴옥사이드(GSAO)와 같은 형광 염료를 추가 분류에 사용할 수 있습니다(예: 대사 상태에 따른 procoagulant platelets)10. 이를 통해 벌루닝(ballooning)과 미토콘드리아 투과성 전이 공극 형성(MPTP) 전구응고제 혈소판 표현형11을 구별할 수 있습니다.

Heemskerk 등은 포스파티딜세린(PS) 노출과 인테그린 αIIbβ 3 활성을 분석하여 서로 다른 혈소판 집단이 뚜렷한 응고 단계를 조절할 수 있으며 포스파티딜세린 노출에는 트롬빈 및 콜라겐과 같은 강력한 활성제가 필요하다는 것을 보여주었습니다12. 또한, 콜라겐 또는 특정 GPVI 작용제 경련을 가진 GPVI에 의한 혈소판 활성화는 주로 부착성 procoagulant 혈소판 형성에 책임이 있습니다. 마찬가지로, 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase)에 의해 트롬복산 A2(thromboxane A2)를 생성하여 혈소판 활성화를 유도하는 아라키돈산(arachidonic acid)은 PS 노출을 유도한다13. 그러나 아라키돈산은 트롬빈이나 콜라겐에 비해 약한 혈소판 활성화제이다14. Van Velzen 등은 또한 두 가지 개별 측정에서 혈소판 표면 항원(CD42a/b, CD36, CD41, CD61)과 활성화 마커(PAC-1, CD63, CD62P)를 평가했습니다15. 또한 van Velzen 등은 혈전증 환자의 혈액을 분석하고 건강한 환자와 질병에 걸린 환자 사이의 하위 집단을 비교할 수 있었습니다. Hindle 등은 각각 4개의 마커(PAC-1, Annexin V, CD62P, CD42b 또는 CDCD154, CD62P, CD63, CD42b)로 구성된 2개의 개별 패널을 사용하여 트롬빈 및 CRP-XL 치료 후 혈소판 하위 집단에 대한 프로스타사이클린의 영향을 측정했습니다16. 최근에는 휴지(CD42b+, PAC1-, CD62P-, Annexin V-), 응집(CD42b+, PAC1+, CD62P+, Annexin V-), 응고제(CD42b+, PAC1-, CD62P+, Annexin V+) 및 세포사멸(Cd42b-, PAC1-, CD62P-, Annexin V+) 혈소판 하위집단을 정의하기 위해 다색 유세포 분석법이 사용되었습니다 7,17. Laspa 등은 케모카인 수용체 CXCR4 및 ACKR3에 대한 항체를 추가하여 다색 유세포 분석 접근법을 확장/개선했습니다18. 사용 가능한 문헌에 따르면, 이것은 하나의 튜브에서 분리된 인간 혈소판 집단 내에서 개별 혈소판(단일 세포 수준)에서 10개의 서로 다른 항원을 검출할 수 있는 분리된 인간 혈소판을 위한 최초의 10색 유세포 분석기 패널입니다. 따라서 단일 세포의 활성화, 접착 및 응집 전위, 케모카인 수용체 및 세포사멸 전위를 동시에 측정하여 기존 하위 모집단을 더욱 구별할 수 있습니다. 따라서, 이는 4개의 주요 하위 모집단을 4개의 마커(resting, procoagulant, aggregatory, apoptotic)로 정의한 Johnson et al.을 보완합니다17. 따라서 다색 유세포 분석 분석을 확립하면 활성화 패턴 및 고전적인 혈소판 하위 집단 내에서 혈소판 아형의 형성과 관련하여 다양한 혈소판 작용제를 비교할 수 있습니다.

이 방법은 혈소판 기능 및 생리학 분석에 관한 기본 연구에 사용할 수 있습니다. 또한, 인간 혈소판에 대해 확립된 다색 유세포 분석 분석은 심혈관 질환 및 혈전성 질환 연구와 같은 환자 연구에서 얻은 혈소판으로 수행하여 이러한 질병에 의해 유도된 혈소판 하위 집단과 이러한 유도된 표현형에 대한 치료의 효과를 해독할 수 있습니다. 예를 들어, Mueller 등은 대동맥 협착증 환자에서 혈소판 하위 집단이 다를 수 있음을 보여주었습니다19. 얻은 지식은 제약 개입에 대한 새로운 기회를 제공할 수 있습니다.

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프로토콜

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연구 목적의 혈액 채취 및 취급은 에버하르트 칼스 대학(Eberhard Karls University)과 튀빙겐 대학병원(University Hospital of Tübingen)의 윤리 위원회(윤리 투표 238/2018B02)의 승인을 받았으며, 연구 방법론은 헬싱키 선언에서 정한 기준을 따랐습니다. 건강한 헌혈자들은 채혈에 대해 충분한 정보를 바탕으로 동의서를 제출했습니다. 건강한 기증자의 기준 특성은 표 1에 나열되어 있습니다. 그림 1 은 유세포 분석 프로토콜에 대한 개요를 제공합니다.

1. 전혈에서 인간 혈소판의 분리

참고: 혈소판을 분리하기 위한 표준화된 방법을 보장하기 위해 검체 채취, 지혈대 및 항응고제 선택과 관련하여 ISTH 지침을 따랐습니다20.

  1. 완충액 준비
    1. 산-시트레이트-덱스트로오스(ACD) 항응고제 완충액: 12.50g Na3-시트랫(85mM C6H5Na3O7 x 2 H2O), 6.82g 시트레이트산(71mM) 및 10.00g 포도당(111mM)을 475mL의 아쿠아 스틸라타에 용해시킵니다. 1M NaOH로 pH를 4.69로 조정합니다. 최대 500mL를 아쿠아 destillata로 채웁니다. 그런 다음 버퍼를 필터 살균하고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
      참고: 모든 솔루션은 0.22μm 공극 크기의 고속 흐름 폴리에테르 설폰 멤브레인을 사용하는 진공 구동 필터 시스템으로 필터 멸균됩니다.
    2. Tyrode의 완충액(10x): NaCl 80.00g, NaHCO 3 10.15g, KCl 1.95g의 무게를 측정하고 1L에 아쿠아 데스틸라타를 추가합니다. 필터는 완충액을 살균하고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
    3. Tyrode's-HEPES 완충액(1x, 137mM NaCl, 2.8mM KCl, 12mM NaHCO3, 5mM 포도당, 10mM HEPES): 10x Tyrode 완충액 10mL와 아쿠아 destillata 90mL를 혼합합니다. 포도당 0.1g과 소 혈청 알부민(BSA) 0.1g을 용해합니다. 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)으로 pH를 7.4로 조정합니다. Tyrode의 완충액 10mL를 pH 7.4로 설정하고 Tyrode의 잔여 90mL의 pH를 1N HCl을 pH 6.5로 7.4로 조정합니다.
      참고: BSA는 헤민과 같은 일부 화학 물질을 제거할 수 있습니다. 이 경우 BSA 없이 1x Tyrode의 버퍼를 준비하는 것이 중요합니다. 모든 버퍼는 사용하기 전에 실온 또는 37°C까지 예열해야 합니다.
  2. 혈액 샘플 채취
    1. 모든 기증자에 대해 10mL 주사기와 ACD 항응고제 2mL를 준비하고 인큐베이터를 사용하여 실온 또는 37°C로 조정합니다. 희석 계수를 1:5(ACD: 혈액)로 유지합니다.
      참고: 더 작거나 큰 주사기를 사용하여 혈액 샘플을 채취하십시오. 차가운 ACD 완충액은 혈소판을 미리 활성화하고 결과를 손상시킬 수 있습니다.
    2. 버터플라이 바늘(21G)을 사용하여 예열된 ACD 주사기에 헌혈자의 혈액을 천천히 채취합니다. 사전 활성화를 피하기 위해 주사기를 채우기 전에 지혈대 호스를 엽니다.
      참고: 더 큰 게이지 바늘이 있는 주사기는 혈소판의 전단 유도 활성화를 최소화할 수 있습니다.
    3. ACD 혈액을 15mL 반응 튜브로 천천히 옮깁니다. 혈소판의 사전 활성화를 피하기 위해 즉시 혈액을 사용하십시오.
  3. 혈소판 분리
    1. 브레이크 없이 209 x g (실온, RT)에서 20분 동안 ACD 혈액을 원심분리합니다. 50mL 반응 튜브에 pH 6.5의 Tyrode's-HEPES 완충액 25mL를 준비합니다.
    2. 생성된 혈소판이 풍부한 혈장(PRP, 상층)을 pH 6.5의 Tyrode's-HEPES 완충액이 들어 있는 50mL 반응 튜브로 부드럽게 옮깁니다.
    3. 다른 혈액 세포와의 오염을 방지하기 위해 담황색 코트와 적혈구 위에 약 1mL의 PRP를 남겨 두십시오.
    4. 현탁액을 430 x g 에서 RT에서 10분 동안 원심분리하여 혈소판을 펠릿화합니다. 생성된 펠릿을 200-300μL의 Tyrode 완충액(pH 7.4)에 조심스럽게 재현탁합니다.
    5. 세포 계수기를 사용하여 혈소판 수를 확인합니다. Tyrode's-HEPES-buffer pH 7.4에서 200 x 103 platelets/μL로 혈소판 수를 조정합니다. 혈소판 염색의 추가 처리에 대해서는 3단계를 참조하십시오.

2. 유세포 분석을 위한 항체의 선택 및 적정

  1. 항체 및 염료 선택
    1. 유세포분석기21에 적합한 형광단을 가진 항체와 염료를 선택합니다. 유세포 분석기 제조업체에서 권장하는 필터 구성을 확인하십시오. 혈소판 마커 및 형광단 구성의 예는 다음 세포분석기에 대해 표 2 및 그림 2 에 나와 있습니다: 레이저 구성을 갖춘 BD LSR Fortessa: 보라색(402nm), 파란색(488nm), 노란색/녹색(561nm), 빨간색(640nm).
      참고: 발현이 낮은 항원에는 더 밝은 형광 색소를 사용하십시오. 예를 들어, 밝은 형광 색소 BV412 및 BV650은 약하게 발현된 케모카인 수용체(ACKR3 및 CXCR4)에 사용되었습니다(22,23,24).
  2. 항체 및 염료의 적정
    1. 항체를 적정하여 올바른 작업 농도를 찾습니다. 적정을 위해 1단계에서 분리된 인간 혈소판과 항체의 농도 시리즈를 사용합니다.
      참고: 제조업체가 제공한 작업 농도는 일반적으로 농도 계열의 좋은 시작점입니다.
      1. 치료 중에만 발현되는 항원을 다루는 경우, 염색 전에 혈소판을 활성화하여 음성 세포와 양성 세포도 검출할 수 있는지 확인하십시오. 예를 들어, PAC-1은 활성화된 인테그린 αIIbβ 3에만 결합합니다. 따라서 혈소판을 강력하게 활성화하여 밝고 긍정적인 신호를 얻습니다(예: 10μg/mL의 콜라겐 관련 펩타이드(CRP, 그림 3 참조).
  3. 샘플 적정
    1. 1단계에서와 같이 인간 혈소판을 분리하고 혈소판 수를 샘플당 1 x 106 혈 소판으로 조정합니다.
      1. 염색 전에 활성화가 필요하지 않은 수용체의 경우: CD61, CD42b, CD41, CXCR7, CXCR4는 항체당 하나의 염색되지 않은 샘플과 염색된 샘플을 사용합니다. 예를 들어 염색 전에 10 μg/mL의 CRP-XL로 활성화해야 하는 수용체/마커의 경우: PAC1, CD63, CD62P, Annexin V, Zombie NIR은 하나의 활성 샘플과 하나의 비활성화 샘플을 사용합니다 15,25,26.
    2. 필요한 경우 10 μg/mL CRP-XL로 30분 동안 혈소판(검체당 1 x 10,6 혈소판)을 활성화합니다. 그런 다음 분리된 혈소판(샘플당 1 x 106 혈소판)을 서로 다른 농도의 형광색소 또는 염료로 30분 동안 배양하고 300μL의 1x Annexin Binding Buffer를 첨가하여 샘플을 희석합니다(농도에 대한 예는 표 3 참조).
    3. 모든 샘플에 대해 10,000개의 이벤트를 측정합니다.
    4. 보충 그림 1에 표시된 것처럼 모든 항체에 대한 양성 및 음성 집단의 최적 분리를 보여주는 염색 지수를 계산합니다.
    5. 최적의 농도를 찾기 위해 각 항체 농도에 대한 염색 지수를 플롯합니다.

3. 유세포 분석을 위한 염색

참고: 4가지 다른 혈소판 활성제(CRP-XL, ADP, 트롬빈, 헤민)를 사용한 염색 예는 표 4 를 참조하십시오.

  1. Hemin은 새롭게 준비해야 합니다. 분말을 1.4M NaOH에 3M 용액에 용해시키고 450rpm에서 5분 동안 96°C로 가열합니다. 그런 다음 증류 된 H2O로 3mM 원액으로 희석합니다.
  2. 혈소판 수를 조정한 후(검체당: 1 x 106 혈소판), 표 4와 같이 RT에서 30분 동안 혈소판 활성화제와 함께 튜브의 혈소판을 활성화합니다.
  3. 샘플에 43.3μL의 항체 칵테일을 추가하고 어둠 속에서 RT에서 30분 동안 혈소판을 배양합니다.
  4. 배양 후 Annexin V 단백질이 세포막 외부의 포스파티딜세린에 결합할 수 있도록 300μL의 1x Annexin Binding Buffer(10mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl2)로 샘플을 희석합니다. 샘플을 즉시 측정하십시오.
    알림: s를 측정하십시오.amp준비 직후. 샘플이 고정되어 있지 않기 때문에 샘플 준비 및 측정을 지연하면 결과의 변동성이 증가할 수 있습니다. 고정은 Annexin V 결합을 손상시킵니다.

4. 보상 설정 및 형광 마이너스 원 컨트롤(FMO) 측정

참고: 데이터를 기록하기 전에 보정 설정을 실행하십시오. 유세포 분석기는 보상 설정을 자동으로 계산합니다. 특정 보상 절차에 대해서는 유세포 분석기의 일반적인 설명서를 참조하십시오. 그럼에도 불구하고 보상 제어는 셀 또는 비드와 함께 사용하십시오.

  1. 보상 설정
    1. 비드 보상을 위해 비드 1방울과 형광 접합 항체 1μL로 각 형광단에 대해 150μL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비합니다.
    2. 구슬에 대한 종의 반응을 모니터링합니다. 안티 마우스 IgGκ 및 폴리스티렌 미립자의 음성 제어를 사용합니다. Annexin V를 보상하기 위해 Annexin V와 동일한 형광단을 접합하는 항체 PE/Cy7 anti-human CD62L로 PE/Cy7 비드를 라벨링합니다.
    3. 아민 반응성 염료에 대해 아민 반응성 보상 비드를 사용합니다. 150μL의 PBS에 1μL의 염료와 함께 2방울의 포지티브 비드와 1드롭의 마이너스 비드를 사용합니다. 아민 반응성 보상 비드가 염료와 반응하여 긍정적인 신호를 보이는지 확인합니다. 음수 비드가 아민 반응성 염료와 반응하지 않고 음의 신호를 나타내지 않는지 확인합니다.
      참고: Zombie NIR APC-Cy7의 경우 음성 및 양성 아민 반응성 비드를 사용합니다.
    4. 보상 샘플을 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
    5. 모든 compensation tube를 개별적으로 실행하고 FSC 및 SSC를 기반으로 singlet bead population을 게이트합니다. 비드 개체군은 하나의 작은 집중 개체군으로 나타납니다. 이 인구 주위에 게이트를 그립니다.
    6. 모든 compensation tube에 대한 히스토그램을 표시하고 서로 다른 항체 및 dye의 positive peak가 겹치지 않을 때까지 compensation 값을 조정합니다. 그런 다음 모든 단일 보상 튜브를 측정하고 제조업체의 SOP에 따라 형광단의 파급을 계산하도록 합니다.
    7. 분리된 인간 혈소판을 사용한 실제 염색 실험을 진행하십시오(3단계 및 표 4 참조). 혈소판 집단을 찾기 위해 측정하기 전에 SSC/FSC 전압을 조정합니다. CD61은 혈소판에서 흔히 발현되므로 혈소판의 모든 크기를 검출할 수 있는지 이 형광 역치를 확인하십시오.
    8. 그런 다음 샘플당 20,000개의 이벤트를 측정합니다.
  2. FMO 측정
    1. 표 5와 같이 모든 마커에 대해 FMO 컨트롤을 준비합니다. 모든 마커의 중복을 결정할 수 있으려면 자극되지 않은 샘플과 자극된 샘플을 모두 준비하십시오.

5. 데이터 분석

  1. 유세포 분석 데이터 분석 소프트웨어를 사용한 분석(그림 4)
    1. FSC 파일을 소프트웨어로 끌어다 놓습니다. FMO 컨트롤을 사용하여 각 마커에 대한 양수 모집단을 정의합니다.
      1. 점도표의 각 마커에 대해 각 FMO 컨트롤을 플로팅하여 FMO를 결정합니다. 이렇게 하면 다른 채널로의 유출을 볼 수 있습니다. 형광 스필오버가 가장 높은 FMO 게이트를 처리된 10색 샘플에 대한 양성 모집단에 대한 경계로 사용합니다.
  2. 클라우드 기반 유세포 분석을 통한 분석(그림 5)
    1. 소프트웨어를 열고 새 데이터셋을 만듭니다. 유세포 분석기로 획득한 FCS 파일을 끌어다 놓습니다.
    2. 워크플로우를 작성하여 분석을 시작합니다. 보정 매트릭스는 원시 데이터 파일에서 자동으로 생성됩니다.
    3. 다음 설정을 사용하여 UMAP 분석을 실행합니다: 이웃: 15, 최소 거리: 0.4; 구성 요소: 2; 미터법: 유클리드; 학습률: 1; 신기원: 200; 임베딩 초기화: spectral. 모든 파일과 10개의 마커(기능)를 모두 선택합니다.
    4. Phenopraph 분석을 새 작업으로 추가하고 다음 설정으로 분석을 실행합니다. K 최근접 이웃: 20; 거리 메트릭: 유클리드; 루뱅 득점: 1; 결과 수: 1.
    5. 생성된 클러스터를 나타내는 게이트 작업을 추가합니다. 분석을 실행한 후 데이터를 내보낼 수 있는 다른 블롯으로 표시할 수 있습니다.

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결과

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multi-color 유세포 분석 패널에서 수집한 원시 데이터를 분석하기 위한 두 가지 옵션이 있습니다. 한 가지 옵션은 분석 소프트웨어를 사용하여 수동으로 분석하는 것입니다(그림 3 및 그림 4). 따라서 원시 데이터를 소프트웨어 창으로 끌어다 놓아야 합니다. 먼저, 산점도 표시 모드에서 SSC/FSC 척도를 조정하여 혈소판 집단을 별개의 포인트 클라우드로 표시하여 세포를 찾아야 합니다. 그런 다음, 디스플레이를 히스토그램 모드로 전환하고 처리되지 않은 파이크와 치료 파이크 사이의 임계값을 설정하거나 산점도 디스플레이를 사용하고 FMO에 의해 결정된 게이트를 정의함으로써 처리되지 않은 샘플과 처리된 샘플을 사용하여 각 마커에 대한 양성 세포를 정의할 수 있습니다.

혈소판 개체군의 명확한 변화는 점도표에서 볼 수 있습니다(그림 4A

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토론

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Multi-color 유세포 분석을 통해 불연속 기능 12,17,18과 관련된 별개의 혈소판 클러스터/하위 모집단을 정의할 수 있습니다. subpopulations와 receptor surface 발현의 결과에 결정적인 영향을 미치는 것은 분리된 human platelets의 품질입니다. 따라서 제시된 프로토콜의 핵심 단계 중 하나는 혈소판을 준비하는 것입니다. 다른 작용제(agonist)로 검체를 처리하기 전에 활성화를 피하기 위해 부드럽게 분리해야 합니다. 다른 질병을 비교하기 위해 이 방법을 시행하는 경우에도 질병으로 인한 것이 아니고 결과에 영향을 미칠 수 있는 혈소판 활성화를 피하기 위해 환자로부터 혈액을 천천히 빼내는 것이 중요합니다.

10색 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

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이 프로젝트는 독일 연구 재단(DFG) - 프로젝트 번호 335549539 - GRK 2381의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10x 바인딩 버퍼   Invitrogen,
Carlsbad, California, USA		88-8103-74완충액 
아데노신 이인산염(ADP)Probe & go Labordiagnostica GmbH
Lemgo, Germany   		70212혈소판 작용제 
Annexin V PE-Cyanine7Invitrogen,
Carlsbad, California, USA		88-8103-74dye 
항-CD41 AF 700BioLegend,
San Diego, CA, USA		303728항체 
항-CD41 Alexa Fluor 700BioLegend,
San Diego, CA, USA		303727항체 
항-CD42b PerCP/시아닌 5.5 BioLegend,
San Diego, CA, USA		303918항체 
항-CD61 BV605BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, USA 		744382항체 
항-CD62P PEBeckman Coulter,
Brea, California, USA		IM1759U항체 
항-CD63 PE/Cy5 Abcam,
Cambrigde, UK		ab 234251항체 
항-CXCR4 BV650BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, USA		740599항체 
안티 CXCR7 BV421 BD Bioscience
프랭클린 레이크스, 뉴저지, 미국 		566234항체 
항-PAC-1 FITCBD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, USA		340507항체 
소 혈청 알부민(BSA)Applichem,
다름슈타트, 독일		A1391-
시트릿산 Carl Roth,
Karlsruhe, Germany		6490.1-CRP-XL
CambCol Laboratories,
Ely, UK		CRP-XL혈소판 작용제 
D-(+)-GlucoseSigma Aldrich Co.,
St. Louis, Missouri, USA		G7528-Dubecco
' s 인산염 완충 식염수(PBS)Sigma Aldrich Co,
미국 미주리주 세인트루이스		D8537-Hemin
 Sigma Aldrich Co.,
미국 미주리주 세인트루이스		H9039-10G혈소판 작용제 
HEPESCarl Roth,
Karlsruhe, Germany		9105.3-
염화칼륨 Carl Roth,
Karlsruhe, Germany		6781.3-
염화나트륨 Carl Roth,
카를스루에, 독일		3957.1-
탄산수소나트륨   Sigma Aldrich Co,
미국 미주리주 세인트루이스
401676-Thrombin 로슈 10602400001혈소판 작용제 
트리-구연산나트륨-디하이드레이트 Applichem,
Darmstadt, Germany
1416551211-Zombie NIRBioLegend,
San Diego, CA, USA		423105아민 반응성 염료 

참고문헌

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