Method Article

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH: Drosophila melanogaster에서 유전자좌 특이적 리보솜 RNA 전사 검출

DOI:

10.3791/67881

⸱

March 28th, 2025

 , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Stony Brook University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 Drosophila melanogaster의 X 또는 Y 염색체 리보솜 DNA 자리에서 유래한 리보솜 RNA 전사체를 구별하기 위해 단일 뉴클레오티드 다형성에 민감한 제자리 형광 혼성화(SNP-FISH) 방법을 설명합니다.

Abstract

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리보솜 기능을 위해 충분한 리보솜 RNA(rRNA)가 전사되도록 하기 위해 게놈에는 리보솜 DNA(rDNA) 자리라고 하는 영역을 구성하는 rRNA를 암호화하는 염기서열의 수백 개의 탠덤 복제가 포함되어 있습니다. 많은 유기체의 게놈에는 서로 다른 염색체에 분포된 하나 이상의 rDNA 유전자 자리가 포함되어 있으며, rRNA는 여러 rDNA 유전자 자리 또는 단일 유전자 자리에서 전사될 수 있습니다. rRNA 전사 소스의 변화는 종종 리보솜 장애를 나타냅니다. 그러나 rRNA의 균질성은 rRNA가 여러 rDNA 유전자 자리에서 전사되는지 아니면 단일 rDNA 자리에서 전사되는지 구별하는 데 방해가 됩니다. 여기에서는 단일 뉴클레오티드 다형성에 민감한 형광 제 자리 혼성화(SNP-FISH)를 사용하여 X 염색체와 Y 염색체의 Drosophila melanogaster rDNA 유전자좌 사이의 rRNA 전사를 구별하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 유전자좌 특이적 rRNA 변이체를 활용하여 단일 세포 분해능으로 rRNA 전사 소스를 쉽게 검출할 수 있습니다. 이 분석은 모든 초파리 세포 유형에 적용할 수 있으며 다른 시스템에서 사용하도록 조정할 수 있습니다.

Introduction

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리보솜 기능에 필요한 18S, 5.8S 및 28S 리보솜 RNA(rRNA)는 45S pre-rRNA라고 하는 단일 시스론에 공동 전사됩니다. 3개의 rRNA는 2개의 내부 전사 스페이서 염기서열(ITS)에 의해 45S pre-rRNA 내에서 분리되고 5' 및 3' 말단에서 외부 전사 스페이서 염기서열(ETS)에 의해 측면에 있습니다. 이러한 모든 spacer sequence는 성숙한 rRNA가 ribosomes에 통합될 수 있도록 45S pre-rRNA에서 제거됩니다(1 참조). 리보솜 활성을 지원하는 데 필요한 rRNA 생산에 대한 높은 수요를 충족하기 위해 모든 진핵생물 게놈에는 수백 개의 45S 염기서열 사본이 포함되어 있습니다. 이러한 사본은 탠덤 반복으로 함께 클러스터링되어 리보솜 DNA(rDNA) 자리라고 하는 게놈 영역을 형성합니다. 대부분의 진핵생물 게놈은 별도의 염색체에 걸쳐 퍼져 있는 여러 rDNA 유전자좌를 포함합니다(2 참조). 45S 사본의 높은 중복성은 일반적으로 전사에 필요한 것보다 훨씬 더 많은 45S 사본이 있음을 의미하며, 대부분의 45S 사본은 전사적으로 조용하고 이질염색질3에 묻혀 있습니다. 전사 활성은 rDNA 유전자좌 전반에 걸쳐 균일하지 않으며, rDNA 유전자 좌위 전사의 변화는 유기체 4,5,6 전반에 걸쳐 널리 관찰되며, 이는 45S 전사가 개별 rDNA 유전자좌에서 차등적으로 조절됨을 나타냅니다. 식물, 무척추동물 및 척추동물 7,8,9,10에서 유전자좌 전체 rDNA 침묵이 관찰되었으며, 이는 유전자좌 전체 rDNA 침묵이 rRNA 투여량11을 조절하는 주요 메커니즘임을 시사합니다. rRNA 전사(transcription)는 리보솜 생산의 핵심 조절 단계이며, 번역 활성을 조절하는 rRNA 전사(transcription)의 변화는 정상적인 분화(normal differentiation)와 질병 상태(disease condition) 모두의 중요한 특징이다12. rDNA 유전자좌 전사의 변화는 총 rDNA 복제 수13의 감소와도 관련이 있습니다. 따라서 변경된 유전자좌 특이적 rDNA 전사는 파괴된 세포 생리학의 중요한 지표가 될 수 있습니다.

유전자좌 특이적 침묵(locus-specific silencing)이 rRNA 전사 조절의 주요 원인인 것으로 보이지만, 이러한 침묵(silencing)을 확립하고 어떤 rDNA 유전자좌가 전사 활성인지를 지시하는 메커니즘은 대부분 알려져 있지 않습니다. rDNA 염기서열의 균질성으로 인해 개별 rDNA 유전자 좌위 전사를 평가하기 어려워 유전자 좌위 특이적 rDNA 전사 활성에 대한 광범위한 분석을 방해합니다. 이 도전은 동일한 게놈 4,5,6,13 내의 rDNA 사본 사이의 구조적 및 단일 뉴클레오티드 서열 변이를 활용하여 극복할 수 있습니다. 이러한 변이체 중 일부는 개별 유전자 자리의 대부분 또는 모든 사본 간에 공유될 수 있으며, rDNA 유전자 자리를 구별하는 여러 변이의 고유한 rDNA 유전자 자리 일배체형을 생성할 수 있습니다. 실제로, 텔로미어-텔로미어 컨소시엄(telomere-to-telomere consortium)에 의한 rDNA 변이체의 특정 유전자좌에 대한 최근 매핑은 인간 게놈14에서 유전자좌 특이적 공유 rDNA 변이체를 밝혀냈습니다. 이러한 rDNA 유전자좌 지도는 염기서열분석 데이터 세트에서 유전자좌 특이적 전사를 식별할 수 있게 할 수 있습니다. 그러나 이러한 지도의 가용성은 현재 제한되어 있으며 제작이 쉽지 않습니다. rDNA 유전자좌는 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster, 각 X 및 Y 염색체에 하나의 유전자좌)의 성염색체에만 존재하기 때문에15, Y 염색체 rDNA 유전자 자리는 XX 암컷에게는 없습니다. Y 염색체 자리에서 이러한 자연적인 분리는 X와 Y rDNA 자리 사이의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 변이체가 수컷(XY)에는 존재하지만 암컷(XX)에는 없는 변이체로 단기 판독 염기서열분석에서 쉽게 식별할 수 있음을 의미합니다. 이전에 확인된 SNP는 수컷과 암컷의 DNA에 대한 간단한 PCR 및 Sanger 염기서열분석을 통해 신형이 지정되지 않은 초파리 균주에서 신속하게 테스트할 수 있습니다. 또한, rDNA 유전자 자리16이 없는 X 염색체를 가진 초파리 균주를 사용할 수 있다는 것은 개별 X 및 Y rDNA 유전자 자리를 개별적으로 분리하여 훨씬 더 정확한 rDNA SNP 특성 분석을 수행할 수 있음을 의미합니다. Drosophila rDNA 유전자좌 사이의 SNP 변이체를 쉽게 식별할 수 있으므로 고유한 X 및 Y rDNA 유전자좌 SNP 일배체형을 결정할 수 있습니다13. X 염색체 rDNA 자리는 일반적으로 초파리 수컷에서 완전히 침묵하지만 두 X 염색체 자리는 모두 암컷에서 전사됩니다10,17 따라서 초파리는 유전자좌 전체 rDNA 침묵을 연구하는 데 유용한 시스템입니다.

FISH(Fluorescence in situ hybridization)는 조직의 개별 세포 내에서 특정 RNA 또는 DNA 염기서열의 존재를 시각화하는 강력한 도구입니다. FISH 라벨은 형광단에 접합된 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브를 통해 RNA 또는 DNA 염기서열을 표적으로 합니다. FISH 프로브는 일반적으로 시각화할 수 있을 만큼 안정적인 표적 결합을 제공하기 위해 ~20 뉴클레오티드 길이가 필요하지만, 이 길이의 프로브는 단일 뉴클레오타이드만 다른 비표적 염기서열에도 쉽게 결합할 수 있습니다(그림 1A). 반대로, 단일 뉴클레오티드 특이성을 부여할 만큼 충분히 짧은 프로브는 시각화를 위해 충분히 안정적으로 결합하지 않습니다. 특이성과 안정성의 균형을 맞추기 위해 SNP-sensitive FISH(SNP-FISH)는 ~26 뉴클레오티드 긴 안티센스 형광 프로브와 프로브의 5' 말단을 제외한 모든 곳에 결합하는 비형광 센스 마스크 올리고뉴클레오티드를 결합합니다(18). 이 마스크는 프로브의 10개 최대 5' 뉴클레오티드만 단일 가닥으로 남겨두고 표적 결합에 사용할 수 있습니다(그림 1B). 프로브의 이 짧은 단일 가닥 부분은 표적에 특이성을 부여하지만 이러한 10개의 뉴클레오티드와 단 한 번의 불일치라도 있는 RNA와의 교차 반응을 방지합니다(그림 1B). 프로브의 5' 끝이 타겟과 결합하면 수동 스트랜드 변위가 프로브에서 마스크를 벗겨내어 3' 영역이 타겟을 결합하고 안정적인 타겟 라벨링을 생성할 수 있도록 합니다(그림 1B)18. 따라서 SNP-FISH는 각각 다른 SNP를 보완하지만 공통 마스크를 공유하는 서로 다른 형광단을 가진 한 쌍의 프로브를 사용하여 단일 SNP에 의해 다른 RNA를 차등적으로 시각화할 수 있습니다(그림 1C). 이 방법은 단일 형광단 접합 프로브만 타겟 SNP로 모집하지만, 공유 rDNA 하플로타입 내에서 여러 프로브 마스크 세트를 여러 SNP에 풀링하는 데 사용하여 단일 rRNA의 SNP 민감성 검출을 증폭할 수 있습니다(그림 1D). 또한 rRNA는 매우 풍부하게 전사되어 있기 때문에 RNA당 적은 수의 형광 표지를 사용하여 FISH 실험에서 rRNA 전사체를 쉽게 시각화할 수 있습니다. RNA당 형광단에 대한 요구 사항이 이처럼 낮다는 것은 SNP-FISH가 몇 개의 고유한 SNP만으로 특정 유전자 자리의 rRNA를 시각화할 수 있음을 의미합니다. 이 방법은 다양한 초파리 조직 및 발달 단계에서 유전자좌 특이적 rRNA 전사를 쉽게 검출할 수 있습니다17. 그것은 Drosophila 남성 생식계열 줄기 세포에서 특히 효과적이며, 이는 노화13 동안 독점적인 Y-rDNA 전사와 X-염색체 및 Y-염색체 rDNA 자리의 공동 발현 사이에서 변화합니다. 여기에서는 유전자좌 특이적 rRNA 침묵을 평가하는 전반적인 목표를 달성하기 위해 초파리 고환에서 뚜렷한 X 및 Y rRNA 전사체를 시각화하는 SNP-FISH 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 일반적인 y1w1 실험실 초파리 균주의 X 및 Y 염색체의 rDNA 유전자 자리 사이에서 이전에 특성화 된 4 개의 SNP를 사용합니다 (그림 1D).

Protocol

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1. 완충액 및 시약의 준비

참고: RNase-free 기술은 1, 3, 4단계에서 사용되며 인증된 RNase-free 시약을 사용해야 합니다.

  1. 화학 물질 후드에서 26mL의 RNase-free 물에 10mL의 16% 포름알데히드와 4mL RNase-free 10x PBS를 추가하여 1x PBS 고정 용액에 40mL의 4% 포름알데히드를 준비합니다. 1mL 부분 표본에 분배하고 준비 후 30분 이내에 -20°C에서 보관합니다. 정착액은 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
    주의 : 용액에는 포름알데히드가 포함되어 있습니다. 장갑과 적절한 PPE로 다루고 안전하게 폐기하십시오.
  2. 20x RNase-free 식염수-시트르산나트륨(SSC) 1mL, 덱스트란 설페이트 1g, 100mg/mL 사카로미세스 세레비시아e tRNA 100μL, 200mM 바나딜 리보뉴클레오시드 복합체 100μL, 5% RNase-free BSA 1mL, 탈이온화 포름아미드 1mL와 RNase-free 물 6mL를 혼합하여 10mL의 혼성화 완충액을 준비합니다. 1.5 mL 마이크로분리 튜브에 1 mL 분취액을 분배하고 -20 °C에서 최대 1개월 동안 보관합니다.
  3. RNase가 없는 물 40mL에 20x RNase-free SSC 5mL, 탈이온화 포름아미드 5mL, Triton-X 50μL를 추가하여 50mL의 세척 버퍼를 준비합니다. 실온에서 어두운 곳에서 최대 1개월까지 보관하십시오.
  4. 100mL의 물에 100M Tris-HCl pH 7.5-8.0, 20μL의 0.5M EDTA 및 50μL의 5M NaCl을 첨가하여 9.8mL의 DNA 분리 완충액을 준비합니다.

2. X- 및 Y 특이적 rRNA SNP에 대한 시료 유전형 분석

  1. 0.2mL 튜브에 동일한 X 염색체를 가진 짝짓기되지 않은 동형접합 X 암컷과 수컷을 개별적으로 수집하고 얼음 위에서 식힙니다.
  2. 시료당 50μL의 DNA 분리 완충액을 0.5μL의 20mg/mL 단백질분해효소 K와 결합합니다.
  3. Drosophila 샘플에 50 μL의 DNA 분리 buffer/Proteinase K를 추가하고 피펫 팁을 사용하여 샘플을 균질화합니다.
  4. 37°C에서 30분 동안 샘플을 배양한 다음 95°C에서 2분 동안 배양합니다. 40mL의 샘플(동물 배설물 방지)을 깨끗한 1.5mL 튜브에 옮깁니다.
  5. 다음 프라이머 쌍의 10 μM 농도를 사용하여 PCR로 각 DNA 샘플로부터 각 SNP 타겟 영역을 개별적으로 증폭합니다 : 18S SNP 정방향 + 역방향; ITS1 SNP 정방향 + 역방향; 28S SNP 정방향 + 역방향. 프라이머 염기서열 및 예상 PCR 앰플리콘 크기는 표 1에 나와 있습니다.
  6. 겔 전기영동을 사용하여 1% 아가로스 1x TAE 겔에서 전체 PCR 샘플을 분리하여 예상되는 PCR 산물을 확인합니다. 예상 제품 크기는 표 1에 나열되어 있습니다.
  7. 시중에서 판매되는 겔 추출 키트를 사용하여 겔에서 PCR 산물을 분리합니다.
  8. Sanger 염기서열분석에 의한 염기서열 PCR 산물. 각 표적에 대한 F 및 R 프라이머에 대한 별도의 개별 반응을 사용하여 양방향으로 샘플을 염기서열분석합니다.
  9. 짝짓기를 하지 않은 여성 DNA 샘플에서 표 2 의 위치에서 X 염색체 SNP 변이체를 측정합니다. 예상되는 X 일배체형은 표 2에 설명되어 있습니다.
  10. 남성 DNA 시료 염기서열분석 크로마토그램에서 SNP 위치를 관찰합니다. 각 SNP 위치에서 이미 결정된 X SNP 변이를 기반으로 Y 염색체 SNP 변이체를 추론합니다. 예상되는 Y 일배체형은 표 2에 설명되어 있습니다.
프라이머 이름순서예상 앰플리콘 크기
18초 SNP F갓타캣꺅그트카악652 bp
18S SNP RTTCACCTCTCGCGTCGTAAT
ITS1 SNP FCTTGCGTGTTACGGTTGTTTC955 bp
ITS1 SNP R아카그캣꺅트그그트가탔
28초 SNP FATGCGTAGAAGTGTTTGGCG598 bp
28초 SNP RGCCGACTTCCCTTACCTACA

표 1: rDNA SNP 염기서열분석을 위한 프라이머 염기서열. 18S, ITS1 및 28S rDNA 영역에서 이전에 특성화된 SNP를 포함하는 rDNA 영역을 증폭하기 위한 프라이머 쌍. 프라이머 올리고뉴클레오티드 서열 및 예상 PCR 앰플리콘 크기가 나열되어 있습니다.

일배체형SNP 위치순서
X rDNA18초1603-ATACTTGTATTTTTTCATATG-1625
그것1-12873-CGTTATAAATATTTTTAATT-2895
그것1-23115-GAAAATCGAAGAAAAAATT-3137
28초5932-AACAAAAATGCCTAACTATAT-5954
Y rDNA18초1603-ATACTTGTATCTTTTCATATG-1624
그것1-12873-CGTTATAAAC아트그타트-2895
그것1-23115-GAAAATCGAA AAAAAATT-3137
28초5932-AACAAAAATGGCTAACTATAT-5954

표 2: 예상 rDNA 하플로타입. y1w1 초파리 균주의 X 및 Y 염색체 rDNA 자리에서 예상되는 SNP. SNP는 굵게 표시되고 밑줄이 그어집니다. 합의된 45S rRNA 염기서열에 따라 위치가 나열되었습니다(보충 파일 1).

3. 고환 해부, 고정 및 투과성

  1. 실체 현미경, 워크스테이션, 해부 접시 및 70% 에탄올(또는 다른 RNase 처리)로 해부하는 집게를 청소합니다.
  2. 실체현미경으로 초파리 를 해부하여 1x RNAse-free PBS에서 고환을 분리합니다. 한 쌍의 집게로 동물의 복부 중앙을 잡고 다른 한 쌍의 집게로 복부 끝을 잡고 동물을 부드럽게 잡아당깁니다. 고환은 동물과 분리되며 겸자를 사용하여 더 분리할 수 있습니다. 샘플당 30 - 40개의 고환을 수집합니다.
  3. 겸자를 사용하여 고환을 집어 해부 접시에서 0.5mL의 1x RNase-free PBS가 들어 있는 1.5mL 마이크로분리 튜브로 옮깁니다.
  4. PBS를 흡입하고 고정 용액 1mL를 추가합니다. 실온에서 너트 셰이커에 30분 동안 배양합니다.
  5. 1x RNase-free PBS 1mL로 2x를 너트 쉐이커에서 각각 5분 동안 세척합니다. 1x PBS를 흡입하고 RNase-free 70% 에탄올(EtOH) 1mL를 추가합니다. 4 °C에서 너트 셰이커에서 밤새 배양합니다.

4. SNP에 민감한 리보솜 RNA FISH

  1. 에탄올을 흡입하고 세척 완충액 1mL를 추가합니다. 실온에서 너트 셰이커에서 3분 동안 배양한 다음 튜브를 똑바로 세워 2분 동안 놓습니다.
  2. 프로브와 마스크를 혼성화 버퍼와 혼합하여 시료당 총 부피 100μL를 만듭니다. 프로브, 마스크 염기서열 및 형광단 라벨은 표 3에 나열되어 있습니다. 4개의 SNP를 모두 사용하는 경우 혼성화 완충액 80μL, 10μM Y-SNP 프로브(총 4μL) 각 1μL, 10μM X-SNP 프로브(총 4μL) 각 1μL, 10μM 공통 마스크(총 12μL) 각 3μL를 준비합니다.
  3. 세척 버퍼를 흡입한 다음 100μL의 혼성화 용액을 추가합니다. 튜브 가장자리에 투명 필름을 바르고 알루미늄 호일로 싸서 빛으로부터 보호한 다음 37°C 수조에서 최소 24시간 동안 배양합니다.
  4. 하이브리드화 용액을 흡인하지 않고 샘플에 1mL의 세척 버퍼를 추가합니다. 어둠 속에서 30분 동안 37°C 수조에서 배양합니다.
  5. 세척 버퍼를 흡입한 다음 세척 완충액 1mL를 샘플에 추가합니다. 어둠 속에서 30분 동안 37°C 수조에서 배양합니다.
  6. 세척 버퍼를 흡입하고 50μL의 장착 매체를 추가합니다. 시료는 슬라이드에 즉시 장착하거나 장착하기 전에 4°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
SNP 위치올리고뉴클레오티드순서3' 공액 형광단
18초X SNP 프로브AAAAAATACAAGTATTTAATCACATA알렉사 488
Y SNP 프로브AAAAGATACAAGTATTTAATCACATA알렉사 647
마스크타그가타아탓트
그것1-1X SNP 프로브AAATATTTATTAACGGTAAGGATATT알렉사 488
Y SNP 프로브AAATGTTTATTAACGGTAAGGATATT알렉사 647
마스크아
그것1-2X SNP 프로브GTTTCTTCGATTTTCATGTTCGAAAC알렉사 488
Y SNP 프로브GTTTTTTCGATTTTCATGTTCGAAAC알렉사 647
마스크GTTTCGAA캣가아아
28초X SNP 프로브TTAGGCATTTTTGTTTTACTTGAAAA알렉사 488
Y SNP 프로브TTAGC고양이 캣트택트가아아알렉사 647
마스크삐��

표 3: rDNA SNP-FISH에 대한 프로브 및 마스크 염기서열. SNP 위치는 굵게 강조 표시됩니다. 마스크 올리고뉴클레오타이드에 결합하는 프로브 부분에는 밑줄이 그어져 있습니다. 적합한 3' 공액 형광단의 예가 나열되어 있지만, 호환 가능한 모든 형광단을 사용할 수 있습니다.

5. 이미징을 위한 샘플 준비

  1. 해부 실체 현미경 아래에서 작업하면서 와이드 오리피스 피펫을 사용하여 샘플을 현미경 슬라이드로 옮깁니다.
  2. 겸자를 사용하여 이미징 시 샘플을 쉽게 찾을 수 있도록 고환을 일렬로 정렬합니다(특정 방향이 필요하지 않음). 커버 슬립으로 샘플을 덮습니다. 티슈 와이프로 커버슬립 가장자리를 닦아내어 과도한 장착 매체를 제거합니다.
  3. 커버슬립의 가장자리를 매니큐어로 밀봉합니다. 매니큐어가 마를 때까지 실온에서 10분 동안 슬라이드를 어두운 곳에 두십시오. 슬라이드는 컨포칼 이미징에 즉시 사용하거나 이미징 전에 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.

Results

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SNP 유전형 분석의 염기서열분석 결과는 X rDNA 자리와 Y rDNA 자리 사이의 SNP 차이를 검출할 것으로 예상됩니다. 이러한 SNP는 염기서열분석 크로마토그램에서 SNP 위치를 직접 평가하여 검출됩니다 (그림 2). 여성 샘플의 염기서열분석은 SNP 위치에서 단일 염기서열분석 신호를 가질 것으로 예상되며, 이는 두 X 염색체 사이의 SNP 동형접합성을 나타냅니다 (그림 2A). 수컷 샘플 염기서열분석 결과는 SNP 위치에서 이중 피크를 가질 것으로 예상됩니다 (그림 2B). 여성 샘플 염기서열분석에서 결정된 X 염색체 유전자형을 기반으로 non-X 변이체는 Y 염색체 rDNA SNP( 즉, 그림 2의 18S SNP 염기서열분석의 경우 X = T, Y = C)로 추론됩니다. 또는, 수컷 샘플의 SNP 위치에서 단일 염기서열분석 피크는 해당 SNP 위치에서 수컷과 암컷 rDNA 유전자좌 사이의 동형접합성을 나타내며, 해당 위치는 rRNA SNP-FISH에 사용할 수 없습니다.

SNP FISH에 대한 프로토콜에 따라 슬라이드에 장착하여 샘플을 시각화하고 밀봉된 커버 슬립 아래에 놓은 다음 컨포칼 현미경을 볼 수 있습니다. 표 3에 나열된 프로브를 사용하여 Y 유래 rRNA 신호는 Alexa Fluor 647 방출에 의해 검출되고 X 유래 rRNA 신호는 Alexa Fluor 488 방출에 의해 검출됩니다. rRNA 신호는 핵소체에서 관찰될 것으로 예상되며, 이는 핵의 DAPI가 부족한 구멍으로 식별될 수 있습니다(그림 3A). nucleolus는 큰 핵과 nucleolus로 인해 생식 세포에서 특히 쉽게 식별할 수 있습니다(그림 3A). 희미한 신호는 일반적으로 세포질에서도 발견될 수 있지만(그림 3), 이는 상보적 SNP를 포함하는 rRNA가 없는 샘플에서도 검출될 수 있는 비특이적 신호입니다(즉, Y rDNA가 없는 세포의 Y 신호 또는 X rDNA가 없는 세포의 X 신호; 그림 3B-C). 또한, X 또는 Y rDNA 유전자좌가 없는 샘플에서도 X 및 Y rRNA의 인위적인 공동 표지는 때때로 체세포 허브에서 검출될 수 있습니다(그림 3B-C, 노란색 화살표). 따라서 유전자좌 특이적 전사를 평가하기 위해 핵 신호만 사용해야 합니다. 대부분의 세포, 특히 체세포는 Y rRNA 신호만 가질 것으로 예상되며, 이는 rRNA가 Y rDNA 자리(그림 3A, 노란색 점선 및 빨간색 화살표)에서 독점적으로 전사됨을 나타냅니다10,17. 그러나 X 및 Y rRNA의 동시 발현은 종종 생식 세포, 특히 생식 세포 줄기 세포에서 검출됩니다13 (그림 3A, 흰색 점선 원). 공동 발현 세포의 X 및 Y rRNA 신호는 인접하여 단일 핵소체를 형성하거나(그림 3A 상단 세포) 분리되어 두 개의 핵소탈(그림 3A 하단 세포)을 형성할 수 있습니다. 그림 3의 예는 2개의 SNP(2개의 ITS1 SNP)만을 대상으로 하는 프로브 세트를 사용하는 rDNA SNP-FISH에서 제공되었으며, 이는 rDNA SNP-FISH에 2개의 SNP만 필요함을 보여줍니다. 그러나, 4개의 SNP들(13) 모두를 표적으로 하는 프로브를 사용할 때 더 강력한 신호가 관찰된다.

음성 대조군은 특히 분석법을 처음 문제 해결할 때 프로브가 잘못된 SNP 표적과 교차 반응하지 않는지 확인하기 위해 이 분석에 포함된 중요한 요소입니다. X 염색체 음성 대조군에는 X 염색체 rDNA가 결핍된 모든 상태(예: rDNA 결실이 있는 X 염색체를 가진 남성)가 포함됩니다. X 염색체 음성 대조군은 Y rRNA 신호만 검출하고 X rRNA는 검출하지 않을 것으로 예상됩니다 (그림 3B). Y 염색체 음성 대조군에는 Y 염색체 rDNA가 결핍된 모든 상태가 포함됩니다. 이러한 질환의 몇 가지 예로는 XX 여성 조직, Y 염색체가 없는 남성 조직 또는 rDNA 결실15를 가진 Y 염색체를 가진 남성 조직 등이 있습니다. Y 염색체 음성 대조군은 X rRNA 신호만 검출하고 검출 가능한 Y rRNA 신호는 없을 것으로 예상됩니다 (그림 3C). 이러한 제어는 프로브 특이성을 결정하는 데만 중요한 것이 아니라 신호 배경 또는 아티팩트를 결정하는 데에도 중요합니다. 이러한 대조군에서 특이성을 제공하는 모든 새로운 프로브 또는 분석 조건을 사용하여 유전자좌 특이적 rDNA 전사를 정확하게 검출할 수 있습니다.

다양한 유전적, 발달적 또는 환경적 조건에 따라 rDNA가 Y염색체 rDNA 유전자 좌위13,17에서 독점적으로 전사될 가능성이 변경될 수 있습니다. 단일 유전자 자리 또는 여러 유전자 자리에서 rDNA 전사 빈도를 정량화하고 샘플 간에 직접 비교할 수 있습니다. rDNA 유전자좌 전사의 차이를 정량적으로 비교하기 위해서는 각 세포를 Y-우성, 공동 우성 또는 X-우성으로 개별적으로 분류해야 합니다. 셀은 해당 신호만 감지되는 경우에만 Y- 및 X-우성으로 분류됩니다. Y 및 X rRNA 신호를 모두 가진 모든 세포는 한 신호가 다른 신호보다 훨씬 약하더라도 공동 우성으로 간주됩니다. 따라서, 매우 강한 X 및 Y 신호를 포함하는 셀은 Y가 강하고 X가 약하거나 X가 강하고 Y 신호가 약한 셀과 질적으로 동일한 것으로 간주됩니다. 각 범주의 모든 샘플에 대한 모든 세포의 총 백분율은 카이 제곱 테스트를 통해 샘플 간에 비교할 수 있습니다. 이 분석은 특정 rDNA 유전자 자리가 전사되었는지 여부를 정성적으로 결정하는 데 효과적이지만, 개별 SNP-FISH 신호의 형광 강도를 직접 정량화할 때 샘플 간의 일관된 평가는 관찰되지 않았습니다. 따라서 샘플 간 FISH 신호 강도 또는 단일 세포 내 X 및 Y rDNA 신호의 상대적 강도에 대한 정량적 평가를 수행하지 않는 것이 좋습니다. 형광 강도의 이러한 불일치의 원인은 불분명하지만, 모든 타겟 rRNA에 결합하지 않는 마스킹된 프로브의 비효율적인 결합 때문일 수 있습니다.

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그림 1: SNP-FISH 방법의 다이어그램. (A) 전통적인 FISH 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브는 단 하나의 뉴클레오티드만 다른 비표적 RNA와 교차 반응합니다. (B) SNP-FISH 방법은 올리고뉴클레오티드 프로브의 3' 영역에 결합된 상보적 마스크 올리고뉴클레오티드를 사용합니다. 마스크는 표적 염기서열에 결합할 수 있는 뉴클레오티드가 10개에 불과합니다. 마스킹되지 않은 프로브 영역은 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 다른 비표적 염기서열에 안정적으로 결합하지 않습니다. 프로브가 표적에 결합한 후 마스크가 프로브에서 분리되어 프로브와 표적 사이에 안정적인 결합이 가능합니다. (C) 공통 마스크와 결합된 서로 다르게 표지된 쌍을 이룬 SNP 프로브는 교차 반응 없이 단일 뉴클레오티드에 의해 다른 표적에 특이적으로 결합합니다. (D) 여러 프로브를 함께 모아 뚜렷한 rRNA 하플로타입을 특이적으로 라벨링할 수 있습니다. y1w1 Drosophila melanogaster 균주에서 X와 Y rDNA 유전자좌 사이에 4개의 SNP 차이가 특성화되었습니다. 18S rRNA에 1개의 SNP, 28S rRNA에 1개, pre-rRNA의 ITS1 부분에 2개의 SNP가 있습니다. SNP-FISH에 사용되는 X 및 Y 특이적 rRNA 하플로타입이 표시됩니다. 4개의 rRNA SNP에서 X rDNA 변이체를 표적으로 하는 프로브는 일반적인 형광단(녹색)에 접합되고, Y rDNA 변이체를 표적으로 하는 프로브는 다른 형광단(자홍색)에 접합됩니다. 각 SNP(총 4개)에 대해 공통 마스크가 사용됩니다. rRNA의 각 SNP 위치에서 결합하는 SNP 특이적 probe는 최대 4개의 FISH 올리고뉴클레오티드 probe를 사용하여 X 및 Y rDNA loci의 rRNA를 특이적으로 라벨링할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 동형접합 및 이형접합 rDNA SNP 염기서열분석 결과의 예. 18S SNP의 크로마토그램 염기서열분석 예시: (A) 여성 및 (B) 남성 샘플의 DNA 염기서열분석. 18S SNP 위치는 별표(*)로 표시됩니다. 여성 샘플의 SNP 위치에 대한 단일 티민(T) 신호는 X 염색체 rDNA 자리의 SNP 위치에 있는 티민을 나타냅니다. 남성 샘플에서 티민과 시토신(C)으로 분할된 SNP 위치의 이중 신호는 Y 염색체 rDNA 자리의 SNP 위치에 있는 시토신을 나타냅니다(티민이 X 염색체 자리에 있다는 것을 알고 추론). 염기서열분석 결과는 플라스미드 편집기 소프트웨어인 ApE를 사용하여 관찰하였다19. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: SNP-FISH의 예는 두 개의 SNP-FISH 프로브 세트만 사용하는 초파리 고환의 결과입니다. (A) X 및 Y rDNA를 모두 가진 동물의 고환에서 SNP FISH의 예, (B) Y rDNA만 또는 (C) X rDNA만 있는 동물의 고환에 있는 예. 이 예시에서는 두 개의 ITS1 rRNA SNP를 라벨링하는 프로브 세트만 사용했으며, 이는 rRNA SNP FISH가 두 개의 표적 SNP에서만 작동한다는 것을 보여줍니다. 생식 세포는 큰 둥근 핵으로, 체세포는 더 작고 덜 둥근 핵으로 식별됩니다. 생식계열 줄기세포는 별표(*)로 표시된 체세포 허브 바로 옆의 위치로 식별됩니다. X 및 Y rDNA 유전자좌 모두에서 rDNA를 전사하는 생식 세포는 X 및 Y 핵 FISH 신호(흰색 점선 원, A-A'')에 의해 식별됩니다. Y rDNA 유전자 좌위에서만 DNA를 전사하는 생식 세포는 Y 핵 FISH 신호(노란색 점선)만 가지고 있습니다. Y만 발현하는 체세포는 빨간색 화살표로 표시됩니다. X 및 Y rDNA 유전자 자리의 인위적인 공동 표지는 체세포 허브(노란색 화살표)에서 관찰할 수 있습니다. 눈금 막대는 10μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: X 염색체 자리의 rRNA 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

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여기에서는 Drosophila melanogaster tissue의 X 및 Y 염색체 rDNA loci에서 유래한 45S rRNA transcript를 구별하기 위해 SNP-FISH를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 SNP-FISH 타겟으로 사용되는 45S SNP의 정확한 유전형 분석입니다. 자사는 4개의 알려진 Drosophila 45S SNP의 유전형 분석에 대한 프라이머와 프로토콜을 제공하지만, 다른 염기서열분석 방법을 통해 분석에 대안적으로 사용할 수 있는 새로운 SNP를 밝힐 수 있습니다. X염색체와 Y염색체 rDNA 유전자좌 간에 동일한 것으로 밝혀진 SNP 위치(즉, 남성 DNA 샘플에 단일 염기서열분석 피크가 있음)는 SNP FISH에 사용할 수 없습니다. 일부 SNP 위치는 단일 rDNA 유전자 자리 내에서 이질적인 것으로 밝혀질 수 있습니다(즉, 염기서열분석 결과에서 XX 샘플에 대해 단일 SNP 변이체가 제공되지 않거나 XY 샘플에서 매우 미미한 두 번째 염기서열분석 피크만 제공됨). 단일 rDNA 유전자 자리 내에서 이질적인 SNP도 변이체 중 하나가 두 개의 rDNA 유전자 자리 간에 공유되어 단일 유전자 자리 또는 여러 유전자 자리 간의 전사를 구별할 수 없기 때문에 이 분석에 적합하지 않습니다. 더욱이, 암컷의 정자 저장20으로 인해, 짝짓기를 한 암컷으로부터 분리된 DNA는 Y 염색체 rDNA를 포함할 수 있다. 따라서 짝짓기를 하지 않은 암컷을 XX 염기서열분석 분석에 사용하는 것이 중요합니다. 중요한 것은 이 방법은 최소 두 개의 유전자 자리 특정 프로브가 검출을 위해 각 rRNA 분자에 결합할 수 있도록 하기 위해 최소 두 개의 염색체 특이적 SNP가 필요하며, 그 사이에 최소 두 개의 구별되는 SNP가 있는 rDNA 유전자좌에 대한 적용을 제한한다는 것입니다. 더 많은 SNP를 사용할 수 있게 되면 더 많은 프로브가 각 rRNA에 결합할 수 있으며 더 큰 신호 효과를 제공할 수 있습니다. 흥미롭게도, 이 방법은 세포질로 내보내지는 18S 및 28S rRNA의 SNP를 표적으로 하는 두 개의 프로브 쌍에도 불구하고 nucleolus의 rRNA만 라벨링합니다(두 개의 ITS1 타겟 부위를 포함하는 rRNA는 nucleolus에만 존재함). 세포질 FISH 신호의 부족은 두 가지 비배타적 가능성을 시사합니다: 1) 18S 및 28S 프로브만으로는 rRNA가 nucleolus보다 세포질 전체에 더 분산되어 있기 때문에 세포질 rRNA를 검출하기에 불충분하거나, 2) 처리되지 않은 45S rRNA보다 성숙한 리보솜 소단위체에 통합된 rRNA에 대한 프로브 결합 효율이 낮습니다. 18S 및 28S rRNA 내의 추가 SNP는 세포질 rRNA의 SNP 민감성 FISH 검출을 가능하게 할 수 있습니다.

유전자좌 특이적 rRNA 전사를 평가하는 다른 방법에는 특정 유전자좌6에 할당된 rRNA 변이체의 발현을 구별하는 rRNA 염기서열분석 접근법이 있습니다. 마찬가지로, qPCR은고유한 검출을 가능하게 할 만큼 충분히 뚜렷한 rRNA 변이체의 발현을 차등적으로 평가할 수 있지만, 5,21 이러한 변이체의 침묵이 전체 rDNA 유전자 자리의 침묵을 나타내는지는 불분명합니다. 이러한 방법은 특정 rRNA 변이체의 발현을 정량화하는 데 효과적일 수 있지만 단일 세포 분해능으로는 수행할 수 없습니다. 초파리 조직에서 X 염색체 rDNA 침묵의 이질성은 rDNA 유전자좌 전사에 강한 세포 간 변이가 있음을 시사하며, 17 이러한 변이성을 설명할 수 있는 기술의 필요성을 강조합니다. H3.3 히스톤 변이체10 또는 Pol I 전사 인자 UBF22와 같은 rDNA 유전자좌에서 활성 전사와 관련된 이미징 기능은 단일 세포 해상도로 유전자좌 특이적 rRNA 전사를 식별하는 데 사용되었습니다. 그러나 이 두 가지 방법 모두 특정 rDNA 자리에서 발생하는 전사를 구별하기 위해 유사분열 세포의 응축된 염색체를 필요로 합니다. 초파리 세포에서 X 및 Y 염색체의 rDNA 유전자좌는 염색체 모양10으로 식별될 수 있지만, 인간 세포에서 전사 활성 rDNA 유전자좌를 식별하려면 염색체 특이적 표지22와 함께 염색해야 합니다. SNP-FISH 방법은 염색체 특이적 공동 표지 또는 전사 마커의 표지가 필요하지 않으며 모든 세포주기 단계 또는 유사분열 후 세포에서 평가할 수 있어 다양한 조직 및 실험 조건에서 사용할 수 있는 유연성을 제공합니다.

이 rRNA SNP-FISH 방법은 초파리 rRNA를 구별하는 다른 SNP와 함께 사용하기 위해 수정되거나 잠재적으로 다른 유기체의 rDNA 유전자좌를 구별하는 SNP에 적용될 수 있습니다. 이 방법을 두 개 이상의 rDNA 유전자 좌를 가진 유기체에 적용하려면 다른 rDNA 유전자 자리에 존재하지 않고 해당 유전자 자리의 모든 45S 사본 간에 공유되는 최소 두 개의 SNP를 포함하는 고유한 rDNA 변이 일배체형을 가진 유전자 자리가 필요합니다. 이 요구 사항은 이 방법이 다른 모든 유전자 자리와 비교하여 하나의 특정 유전자 자리에서만 전사를 지정할 수 있음을 의미합니다(즉, 유전자 자리 2 및 3에서 공유하는 SNP와 비교하여 유전자 자리 1의 rRNA SNP). 그러나 각 rDNA 자리에 호환 가능한 일배체형이 있는 경우 여러 실험을 결합하여 한 번에 하나씩 각 자리의 전사를 개별적으로 평가할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 혼성화 온도(37°C)의 상대적으로 낮은 엄격성은 특히 프로브의 짧고 마스킹되지 않은 부분을 감안할 때 강력한 프로브 결합을 허용하지만, 더 높은 온도(50-75°C)에서의 혼성화가 일부 FISH 프로브(23)의 신호를 향상시키는 것으로 나타났습니다. 하이브리드화 온도가 높을수록 마스크 가닥 변위가 향상되고 프로브 결합이 증가할 수 있지만, 온도가 너무 높으면 프로브-마스크 결합이 불안정해지고 SNP 특이성이 손실될 수 있습니다. 이러한 이유로, 프로브 결합을 가능하게 하기 위해 이중 가닥 DNA 표적을 용융하는 데 필요한 온도가 프로브 마스크 결합을 불안정하게 하고 SNP에 민감한 표적 특이성을 제거하기 때문에 SNP-FISH가 DNA를 특이적으로 라벨링할 것으로 예상하지 않습니다. 그러나 새로운 rRNA SNP 프로브에 대한 혼성화 온도를 최적화하면 특히 SNP 부위를 두 개만 사용할 수 있는 경우 신호가 증가할 수 있습니다. X 염색체 rDNA 침묵의 손실은 초파리13의 rDNA 복제 수 감소와 관련이 있으므로 다른 시스템에서 유전자좌 특이적 rRNA 전사를 특성화하기 위한 SNP-FISH 분석의 개발은 rDNA 및 리보솜 기능의 무결성을 평가하는 데 유용한 도구 역할을 할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 초파리의 결실 변이체와 함께 사용하도록 수정되었으며, 이 단일 구조적 rRNA 변이체는 검출에 적합했습니다(아마도 프로브 마스크가 없는 더 큰 표적 결합 친화도로 인해)17. SNP 변이체와 잠재적으로 결합될 수 있는 구조적 rRNA 변이체의 사용은 다른 시스템에서의 적용 가능성을 넓힙니다. rDNA 유전자좌 전사를 조절하는 메커니즘은 대체로 불분명하기 때문에 rRNA SNP-FISH의 유연성과 다른 시스템에 대한 잠재적 적응성은 rRNA 전사를 조사하기 위한 향후 연구를 위한 강력한 도구가 됩니다.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bloomington Drosophila Stock Center, Kyoto Drosophila Stock Center 및 FlyBase의 자원에 감사드립니다. 이 연구는 Stony Brook University Department of Biochemistry and Cell Biology와 Renaissance School of Medicine(JON)에서 제공한 창업 자금의 지원을 받았습니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PTC Tempo 96 Thermal CyclerBio Rad12015382모든 thermal cycler를 사용할 수 있습니다
0.2 mL 8 strip flatcap PCR tubesVWR89133-912모든 호환 가능한 튜브 사용 가능
1 kb DNA ladderNEBN3232Ssequencing PCR 앰플리콘 크기를 확인할 때 사용
1.5 mL 눈금 마이크로 원심분리기튜브 USA Scientific1615-5510인증된 RNase free 튜브는
2mM dNTP MixThermoFisher ScientificR0241
50x TAE BufferBio Rad1610743겔 전기영동에 사용됩니다. 모든 TAE 버퍼를 사용할 수 있습니다.
5M NaCl모든 NaCl은 어떤 출처에서든 사용하거나 준비할 수 있습니다
AgaroseVWR97064-250모든 Agarose를 사용할 수 있습니다
ApE - A 플라스미드 편집기 소프트웨어N/AN/A
투명 매니큐어모든 소매점의 모든 매니큐어를 사용할 수 있습니다
커버 유리, No. 1 두께Thomas Scientific6672A38
탈이온화 포름아미드피셔 사이언티픽NC9569627
덱스트란 설페이트 나트륨시그마 알드리치D8906-10G
DreamTaq Green PCR 마스터 믹스ThermoFisher ScientificK1081
Dumont #5 집게정밀 과학 도구11252-20샘플 해부에 사용
EDTA(0.5M), Ph 8.0ThermoFisher ScientificR1021이와 유사한 모든 제품을 사용할 수 있습니다
에탄올VWR89125-172모든 200 프루프 에탄올을 사용할 수 있습니다. Rnase가 없는 조건의 투과화 및 세척을 위해 70% 에탄올로 희석하는 데 사용
Ethidium BromideThermoFisher Scientific15585011
수평 미니 겔 전기영동 시스템Fisher Scientific14-955-170모든 겔 전기영동 시스템 사용 가능
KimwipesFisher Scientific06-666
Micro-Test Staining DishElectron Microscopy Sciences71564시료 해부에 사용
너트 쉐이커Sigma AldrichBMSB3D1020모든 너트 쉐이커를 사용할 수 있습니다
ParafilmUSA Scientific3023-4526
인산염 완충 식염수(10X) pH 7.4, RNase-freeLife TechnologiesAM9624
피어싱 16% 포름알데히드(w/v), 메탄올 프리Life Technologies28908
Precision General Purpose Water BathLife TechnologiesTSGP02모든 수조를 사용할 수 있습니다
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704모든 Gel 추출 키트를 사용할 수 있습니다
재조합 단백질분해효소 K 용액 (20 mg/mL)InvitrogenAM2546유사한 제품을 모두 사용할 수 있습니다
Rnase-free UltraPure BSAThermoFisher ScientificAM2618
S. cerevisiae tRNASigma AldrichR8759
SSC (20X), RNase-freeFisher ScientificAM9763
Triton-X 100Life TechnologiesA16046.AE
UltaPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5ThermoFisher Scientific15567027유사한 제품을 사용할
수 있습니다.UltraPure DNase/RNase-Free 증류수Life Technologies10977023
바나딜 리보뉴클레오시드 복합체NEBS1402S
VECTASHIELD 마운팅 미디어(DAPIVector LaboratoriesH-1200-10
VWR Superfrost 현미경 슬라이드VWR48311-601
y[1]w[1] Drosophila melanogaster lineBloomington Drosophila Stock Center1495
Zeiss LSM 980 컨포칼 현미경Zeiss 현미경 Zeiss 현미경가능한 방출 및 검출 기능이 있는 모든 컨포칼 현미경을 사용할 수 있습니다
Zeiss Stemi 2000-C 스테레오 현미경 및 광원현미경 중앙455053모든 입체 현미경을 사용할 수 있습니다
https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ 호환 .

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