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방법 논문

단일 마우스 배아 줄기세포에서 신경관 오가노이드 생성을 위한 견고하고 재현 가능한 프로토콜

463 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67883

⸱

2025년 12월 19일

 , 
1Vienna BioCenter, Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA), 2Vienna BioCenter PhD Program, Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna

이 논문에서

요약

마우스 배아 줄기세포에서 유래한 3차원 신경관 오가노이드(NTOs)는 초기 발달 단계에서 중추신경계를 연구하는 데 유용한 도구입니다. 여기서는 NTO를 시험 관 내에서 배양하기 위한 최적화된 프로토콜을 단계별로 시연하며, 안정적인 배양 조건과 신뢰할 수 있고 재현 가능한 NTO 생성을 위한 문제 해결 전략을 제공합니다.

초록

포유류의 발달은 매우 복잡한 과정으로, 올바른 패턴 형성과 형태 발생을 위해 정밀한 집중 및 시간 의존적 신호가 필요하다는 점이 특징입니다. 상당한 기술 발전과 지식 수집에도 불구하고, 포유류 발달의 많은 측면은 여전히 모호합니다. 전체 유기체를 조사할 때, 개별 경로의 효과나 외부 자극이 주변 조직과 인자들의 간섭을 어떻게 유도하는지 해명하는 것이 어려워집니다. 이러한 복잡성을 해결하기 위해 오가노이드와 같은 3차원(3D) 시험관 내 모델이 귀중한 도구로 부상했습니다. 배아 줄기세포(ESC) 또는 유도 다능 줄기세포(iPSCs)에서 유래한 오가노이드는 발현 패턴과 기능 면에서 생 체 내 조직과 매우 유사한 조직 유사 특징을 보입니다. 중요한 점은, 통제된 실험 환경 내에서 조작과 광범위한 생물학적 연구가 가능하다는 점입니다. 다능성 배양에서 유래했음에도 불구하고, 오가노이드 시스템은 종종 이질성과 상당한 변이를 보여 복잡하고 복잡한 생물학적 문제를 연구할 때 그 유용성을 제한합니다. 따라서 고품질의 재현 가능한 데이터를 제공하고, 사용되는 재료의 감소를 제공하며, 복잡한 현상을 조사할 수 있도록 절차를 조화시키는 세부 프로토콜이 시급히 필요합니다. 이와 관련해, 시험 관 내 신경관 오가노이드(NTO) 배양을 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 안정적인 배양 조건을 만들고 포괄적인 문제 해결 전략을 제공함으로써, 이 프로토콜은 NTO의 신뢰성 있고 재현 가능한 생성을 가능하게 하며, 이는 신경 유도, 패턴 형성, 초기 중추신경계 발달 메커니즘 등 관련 과학적 질문을 연구하는 데 적합한 모델이 됩니다.

서론

포유류의 발달은 단일 전능성 줄기세포에서 시작되며, 패턴 형성과 형태 발생을 유도하는 복잡한 과정입니다 1,2. 이러한 발전은 세포와 환경 간의 동적 상호작용을 관리하기 위해 엄격히 조절된 세포 프로그램이 필요합니다. 줄기세포는 형태원 구배3, 기계적 경계4, 세포 증식, 환경 재형성5 등 전신 및 국소 신호를 감지, 통합, 반응하는 고유한 능력을 가지고 있습니다. 외부 시공간적 단서도 초기에는 균질 조직에서 다세포 반응을 유도하여 복잡한 구조의 정확한 형성을 보장합니다. 줄기세포는 자기 재생능력과 분화 능력으로 구별되며, 배아 발달과 성체 조직 수리에서 중요한 역할을 하며, 주요 유형으로는 배아 줄기세포(ESC), 성인 줄기세포(ASC), 유도 다능성 줄기세포(iPSCs)가 있습니다.

ESC는 배반포의 내부 세포 덩어리(ICM)에서 추출되며, 보통 2차원(2D) 환경에서 피더 세포나 세포외 기질에서 특정 배양지를 사용하여 다능성을 유지합니다8. 최근 몇 년간 보다 현실적인 세포 배양 조건과 기술에 대한 필요성이 급격히 증가하여, 기본적인 생의학 과정을 연구하기 위해 3차원(3D) 세포 및 조직 모델이 구축되었습니다. 특히 발생생물학에서 오르가노이드와 같은 3D 모델은 조직 형태발생과 체외 내 기관발생을 모델링하는 견고한 방법을 제공합니다. 오르가노이드는 증식하는 줄기세포의 자기 조직화를 통해 형성되며, 이는 대칭 깨짐과 패턴 형성을 통해 자발적으로 복잡한 3D 구조로 발전합니다. 이 과정은 생체 내에서 관찰되는 것과 유사하지만 동일하지는 않으며, 대부분 외부 지도 없이 내부 역학과 상호작용에 의해 주도됩니다. 오가노이드는 실제 장기의 구조와 기능을 매우 잘 모방하기 때문에, 전통적인 2D 세포 배양에 비해 포유류 생물학을 더 정확하게 표현할 수 있습니다11. 또한, 주요 이점 중 하나는 윤리적 이점으로, 오가노이드는 동물 모델의 필요성을 줄여 동물 실험과 관련된 우려를 해소합니다12,13. 더 나아가, 오가노이드는 고처리량 약물 스크리닝을 위한 플랫폼을 제공하여 약물 효능과 독성 예측을 향상시킵니다. 하지만 오르가노이드 사용에는 여러 가지 도전 과제도 존재합니다. 2D 배양보다 더 현실적이긴 하지만, 살아있는 유기체 내 전체 장기의 복잡성과 상호작용을 완전히 재현하지는 못합니다. 또한, 같은 종류의 세포에서 유래하더라도 오가노이드 간에 상당한 변동성이 관찰될 수 있어 실험 결과에 불일치가 발생할 수 있습니다15. 따라서 오가노이드를 견고하고 재현 가능하게 배양하는 것은 필수적이며 고급 기술, 특수 장비, 상세한 프로토콜이 필요합니다.

신경계는 몸 전체에 신호를 주고받으며 행동을 조정하고 감각 정보를 처리하는 복잡한 네트워크로, 움직임, 감각, 사고, 심장 박동과 소화 같은 자율신경 기능 등 필요한 모든 기능을 제어하고 조정합니다. 뇌와 척수로 구성된 중추신경계의 전구체는 신경관입니다. 초기 신경관 발달 과정에서 신경 구조가 어떻게 형성되고 기능하는지 이해하는 것은 다양한 신경학적 장애와 발달 이상에 대한 통찰을 얻는 데 매우 중요합니다. 신경발달장애는 특히 인간 대상에서 유래한 경우 윤리적 문제로 인해 생체 내에서 연구하기 어렵습니다. 뇌 오가노이드16,17과 같은 신경 오가노이드는 인간 뇌 조직을 밀접하게 모방하는 다재다능하고 접근 가능한 모델을 제공함으로써 신경계 발달과 질병에 대한 이해를 크게 향상시켰습니다. 이 3차원 구조는 다능성 줄기세포(PSCs)에서 유래했으며, 뚜렷한 뇌 영역 형성, 세포 다양성, 복잡한 신경망 등 뇌 발달의 다양한 측면을 복제합니다 16,18,19. 연구자들이 실시간으로 발달 단계를 관찰하고 주요 조절 메커니즘을 연구할 수 있게 함으로써, 이 오르가노이드는 정상적인 뇌 발달에 대한 깊은 통찰을 제공합니다. 뇌 오가노이드는 또한 신경발달19와 신경퇴행성 질환20, 예를 들어 소두증16,21, 지카 바이러스 감염22, 자폐 스펙트럼 장애23 등 모델링을 가능하게 하며, 질병 기전을 밝히고 잠재적 치료 표적을 식별합니다. 또한, 뇌 오가노이드는 약물 시험 및 개발을 위한 귀중한 플랫폼으로서 인간 뇌와 유사한 환경에서 약물 효능과 독성 평가를 용이하게 하고 맞춤형 의학 접근법을 가속화합니다. 더불어, 유전자-환경 상호작용을 연구할 수 있는 통제된 환경을 제공하여 유전적 요인과 환경적 요인의 상호작용으로 발생하는 복잡한 질병에 대한 이해를 높입니다. 그러나 신경 오가노이드는 뇌 오가노이드처럼 일반적으로 세포 집합체로 형성되기 때문에, 실험 결과에서 상당한 세포 이질성과 변이를 보이는 경우가 많으며, 이는 생성된 데이터의 해석 가능성에 영향을 미쳐 연구자들에게 상당한 도전 과제를 안겨줍니다17. 이러한 이유로, 생체 내 상태를 적절히 나타내는 가치 있는 데이터의 감쇠를 위해서는 프로토콜 최적화와 정밀한 품질 관리 기준이 매우 중요합니다.

마인하르트와 동료들(24)은 단일 배아 줄기세포(ESC)에서 형성된 초기 신경관 발달을 모방한 클론 신경 오가노이드 프로토콜을 처음으로 보고함으로써 중요한 영향을 미쳤습니다. 이는 오가노이드 간 이질성을 극적으로 최소화합니다. 이 혁신은 연구자들이 발달 과정과 메커니즘, 신경 패턴을 탁월한 해상도로 정밀하고 정의된 환경에서 연구할 수 있게 합니다. 지금까지 많은 연구실에서 주로 쥐나 인간에서 유래한 신경관 오가노이드를 개발했으며, 이는 신경관의 여러 부위와 그 발달을 모방하는 것으로요약되었습니다. 그러나 이용 가능한 정보에 따르면, Meinhardt 등이 확립한 프로토콜은 NTO가 단일 세포에서 신뢰성 있게 형성되고, 단일 전역 레티노산(RA) 펄스 후 배복측 운명으로 효율적으로 패턴화되며, Sonic Hedgehog Agonist(SAG)와 같은 다른 복측 인자를 추가하지 않는 유일한 방법이다26또는 기울기 형성에 의해 공간 정보를 제공하는 마이크로플루이딕 챔버의 사용. 여기서 제공된 프로토콜은 Krammer 등(26)에서 제공된 Meinhardt 등.24에서 수정된 것입니다. 이 프로토콜에서는 단일 마우스 ESC를 세포 배양 매트릭스에 시딩하고 정의된 신경분화 조건에 노출시킵니다. 이틀 이내에 이 세포들은 클론적으로 확장되어 상피화되어, 단일 내강과 그 주변을 둘러싼 끝부분 기저 층층 세포를 가진 3D 원형 타원체 구조를 형성합니다. 2일째에는 전 세계적으로 18시간 동안 신호 전달 분자 RA를 투여하여 신경 분화를 촉진하고, NTOs를 중뇌에서 후뇌/경추 척수 수준으로 후방화하며, 6일째에는 단일 기능적 바닥판이 형성되어 NTO를 복측에서 배측으로 패턴화합니다.

최적화된 프로토콜은 여러 가지 주요 장점을 제공합니다. 이 방법은 처음 3일 이내에 견고한 상피화를 가능하게 하며, 직경 약 200 μm의 비교적 작은 구형 조직을 생성하며, 각 조직은 단일 내강을 포함합니다. 오가노이드는 단일 세포에서 클론적으로 생성되며, 혈청이 없는 화학적으로 정의된 배양 배지에서 유지됩니다. 6일 이내에 다능성 배양으로부터 점진적인 신경 분화가 이루어져, 6일째에는 전측 중뇌 동일성을 보이는 오가노이드와 전역 RA 펄스26 후에는 배복부 패턴의 후뇌 또는 경추 척수 유사 구조가 나타납니다.

재현성과 처리량을 높이기 위해 원래 프로토콜22,25와 다른 여러 측면이 조정되었습니다. 여기에는 수정된 ESC 배양 조건, 입력 세포 수 감소, 개선된 분화 배지, 그리고 0-2일째 노긴 보충제를 생략한 조정된 분화 프로토콜(이미26일에 사용됨)이 포함됩니다. 또한, 96웰 플레이트에 최적화된 시딩 밀도가 최적화되어 고처리량 분석이 가능합니다. 이러한 개선을 통해 NTO 형성 및 패턴 효율이 초기 ~40%에서 업데이트 버전에서는 ~80%로 40% 증가했습니다.

여기(그림 1)에서는 세포 배양 행렬에서 NTO를 견고하고 재현 가능하게 생성할 수 있는 최적화된 프로토콜에 대한 상세한 설명이 제공됩니다. 프로토콜은 분별 분석을 위한 ESC의 초기 시딩부터 이후 유지보수, 고정, 분석까지 NTO 취급의 모든 단계를 포함합니다. 또한 NTO 형태의 일일 시각적 평가를 통한 품질 관리 지침과, 올바른 패턴 및 신경 분화를 검증하기 위해 항체 염색을 이용한 오가노이드 동일성의 핵심 특성 규명도 포함하고 있습니다. 또한, 프로토콜의 모든 단계에서 비판적인 평가를 가능하게 하는 포괄적인 문제 해결 접근법이 제공되며, 이는 실험 프로토콜의 재현성과 신뢰성을 보장하는 데 필수적입니다. 이러한 상세한 지침은 잠재적 문제를 식별하고 해결하며, 오류를 최소화하며 결과를 최적화하는 데 도움을 줍니다. 이는 과학 실험의 신뢰성을 유지하고, 다른 과학자들이 연구를 성공적으로 재현하며 생성된 데이터로부터 포괄적인 결론을 도출하여 분야를 발전시키는 데 매우 중요합니다.

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그림 1: 프로토콜 개요. (A) ESC 통과 (1.1 단계 참조). (B) 세포 배양 기질 분할과 단일 ESC를 시딩하여 NTO로 분화하는 방법(1.2단계 참조). (C) 류마티스 관절염과 RA 치료를 구분하기(2단계 참조). (D) RA 제거 및 매일 중간 용량 대체 루틴(3단계 참조). 이 인형은 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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프로토콜

참고: 추가 시술(배지 교체, 치료, 고정 등) 전에 매일 세포와 NTO를 점검하여 품질 평가를 실시하세요. 세포를 직접 공기에 노출시키는 모든 절차는 멸균을 보장하고 배양물 오염을 방지하기 위해 생물안전 캐비닛 내에서 수행되어야 합니다.

1. NTO 분화를 위한 마우스 ESC의 유지, 통과 및 시딩

  1. 통과
    1. 세포 배양 접시나 0.15% 젤라틴이 미리 코팅된 6웰 플레이트의 웰에 ESC를 37°C에서 30분간 유지하세요.
    2. 2-3일마다 통과 ESC, 2일차부터는 매일 중간 교체 검사를 합니다.
    3. 사용 전 모든 시약(미디엄, PBS, 효소 용액)을 최소 21 °C, 최대 37 °C로 예열하세요.
    4. 위상 차이 현미경으로 세포를 검사합니다(대표적인 이미지 참조, 그림 2). 군체가 적절한 크기와 형태를 갖추었는지(그림 2A)를 가지며, 접시 바닥에 붙어 있는지 확인하세요.
      참고: 쥐 ESC의 10% 이상이 분화된 경우(그림 2B), 새로 해동한 배양물을 준비하되, 분화 분석을 위해 ESC를 시딩하기 전에 최소 두 번 이상 배출해야 합니다. 경험 많은 연구자들은 시각적 평가(Mulas 등, 28 참조) 또는 항체 염색(예: OCT4, Ying et al.29 참조)을 통해 표지 발현을 판단할 수 있습니다.
    5. 배양 접시/플레이트 뚜껑을 열고 살짝 기울인 후 조심스럽게 배지를 흡입하세요. 세포는 가능한 한 짧은 시간 동안 인큐베이터 밖에 두세요. 배양물이 건조해지지 않도록 배지 없이 가능한 한 짧게 세포를 보관하세요.
    6. 500 μL 미리 가열된 PBS로 군집을 세척하고(6웰 플레이트의 단일 웰에 추가), 즉시 다시 흡인합니다.
      참고: 이 단계는 다음과 같은 이유로: i) 분화 분석법 전에 ESC 배지(2iLIF) 전달을 피해야 하며(그렇지 않으면 NTO 형성이 방해됨), ii) 배양 배지 내 FBS 또는 BSA가 해리를 멈출 수 있기 때문입니다. 이는 FBS 또는 BSA를 포함하는 다른 ESC 배양 배양에 적용됩니다.
    7. 500 μL 미리 가열된 효소 용액을 추가하고 세포를 인큐베이터로 다시 옮깁니다.
    8. 37°C에서 타이머를 사용해 세포를 3분간 배양합니다.
    9. 배양 시간이 끝난 후, 플레이트를 꺼내 위상 대비 현미경으로 세포를 확인합니다.
      참고: ESC는 배양판에서 분리되어야 하며; 만약 그렇지 않다면, 접시나 접시를 단단하지만 조심스럽게 두드리세요(그림 2C).
    10. 세포에 직접 피펫으로 옮겨 1mL의 N2B27 배지를 추가합니다(표 1).
      참고: 배지(N2B27) 제조 시 글루타민은 37°C에서 최대 5-10분간 보관하며, 가능하면 상온에서 보관합니다. ESC는 배양 접시에서 씻어내어 배양 접시에 '빈' 공간을 남겨야 합니다.
    11. P1000 피펫을 사용해 플레이트를 약간 기울여 배양 접시에 붙은 모든 콜로니를 씻어내세요.
    12. 세포 덩어리를 분리하려면 플레이트를 약간 기울이고, 피펫 팁(P1000)을 접시 중앙에 두고, 팁을 접시 바닥에 대지만 약간 수직 축에서 벗어나게 하여 세포를 세척합니다. 세포 덩어리를 깨기 위해 5번에서 10번 반복하세요.
    13. 위상 대비 현미경(그림 2D)으로 세포가 제대로 분리되었는지 확인하고, 여전히 덩어리가 있으면 반복합니다.
    14. 완전한 해리 후에는 세포 현탁물을 깨끗한 멸균 15 mL 원뿔 원심분리관으로 옮기고, 세포가 배양된 빈 웰을 1 mL의 N2B27 배지로 세척한 후 세포 현탁액이 있는 동일한 원뿔형 원심분리관으로 옮깁니다.
    15. 셀을 453 x g 에서 5분간 초원심분리기에서 돌립니다.
    16. 상정액을 조심스럽게 흡취하세요.
    17. 세포를 적절한 양의 N2B27 배지(예: 1 mL)에 재현탁하고 세포를 계수합니다(분화 분석에 권장되는 세포 수는 표 2 참조).
  2. ESC가 신경관 오가노이드(NTOs)로 분화되는 과정
    1. 세포 배양 행렬 분할 분석
      1. 세포 배양 매트릭스 병은 4°C에서 얼음 위에 하룻밤 해동하세요(실온이나 손으로 해동하지 않음). 세포 배양 매트릭스를 4 °C에 필요 이상으로 오래 두지 마세요; 기능을 유지하기 위해 가능한 빨리 얼리콥터로 얼려 두세요.
      2. 생물안전 캐비닛에는 1.5-2 mL 마이크로 원심분리기 튜브를 얼음 위에 올려 미리 냉각시키고, 세포 배양 매트릭스 병은 신선한 얼음 위에 두세요.
      3. 녹인 세포 배양 기질을 조심스럽게 섞어 기포 형성을 방지하세요. 거품은 젤리화 후 웰/접시에서 떨어져 나갈 수 있습니다.
      4. 원하는 부피(권장 0.5-1 mL)로 세포 배양 기질을 분리한 후 -20 °C에서 냉동하여 추가 사용. 알리코트 사이의 팁을 교체하는 것은 피해야 합니다. 상온에서 사용하는 팁은 세포 배양 매트릭스가 내부에서 굳어져 상당한 손실을 초래할 수 있습니다. 대신 피펫 팁을 냉장고에 보관해 4°C까지 냉각하세요.
    2. 세포 배양 기진에 단일 세포를 시딩하기
      1. 필요한 세포 수를 정량화하세요(100 cells/μL 세포 배양 매트릭스, 표 2 참조).
      2. 적절한 세포 번호(세포 현탁액)를 깨끗한 15 mL 원뿔 원심분리관에 옮기고 1 mL의 N2B27을 보충합니다.
      3. 원심분리기에서 453 x g 에서 셀을 5분간 돌립니다.
      4. 상청액을 흡인하고 원뿔형 원심분리기를 얼음 위에 올려놓으세요.
      5. 세포 펠릿을 적절한 양의 해동 및 액체 세포 배양 매트릭스에 얼음 위에 조심스럽게 재현탁하되, 기포 형성을 방지하세요.
      6. 적정량의 세포 배양 기질-세포 현탁액을 얇은 층으로 유리 바닥 또는 플라스틱 바닥 접시에 발라, 이미징에 최적의 환경(표 2, 그림 3A-C 참조)에 다중웰 플레이트 벽에 닿지 않게 합니다. 표면장력이 높아 세포 배양 기질 방울이 이전에 접촉된 경우 웰 중심에서 벽으로 이동할 수 있어 세포/NTO의 분포가 불충분해집니다.
        참고: 다중 웰 플레이트를 사용할 경우: 먼저 P20(96웰 플레이트) 또는 P200 피펫 팁으로 세포 배양 매트릭스를 원형으로 그려 후 세포 배양 기질-세포 현탁액으로 '채우기' 합니다(그림 3B).
      7. 다웰 플레이트/접시를 인큐베이터에 37°C에서 놓아 세포 배양 기질이 굳어지도록 하세요. 소량의 경우 세포 배양 기진당 1분, 40 μL 이상은 최대 15분으로 추정합니다.
      8. 배양 시간이 끝난 후에는 플레이트를 꺼내 적절한 양의 배지를 추가합니다( 표 2 참조). 세포 배양 매트릭스 내 ESC는 분화 분석이나 배지 교체 시 건조해서는 안 됩니다. 젤리화 후에는 매개체를 가능한 한 빨리 적용해야 합니다. 젤리화는 일반적으로 37°C에서 1 μL 세포 배양 기질 1분 만에 완료되며, 얇은 층으로 펼쳐진 40-100 μL 세포 배양 기질은 최대 15분 만에 완료됩니다.
        참고: 세포 배양 기질 내 ESC가 건조해지는 것을 피하려면, 멀티채널 피펫으로 96웰 플레이트의 최대 8웰 웰 또는 다른 멀티웰 플레이트의 35mm 유리 바닥 접시/웰 1개를 사용하세요. 세포는 가능한 한 짧은 시간 동안 인큐베이터 밖에 두세요.
      9. 위상 대비 현미경으로 세포 배양 기질 내 씨앗 밀도와 세포 분포를 확인하세요(그림 3C,D). 최적의 파종 밀도가 권장됩니다(표 2 및 그림 3). 하지만 초기 분석과 같은 특정 응용 분야에서는 최대 10배까지 높은 시딩 밀도가 유리할 수 있습니다.
        참고: 분화 분석법을 시딩하기 전에 세포 배양 기질-세포 현탁액을 P300 또는 P1000 피펫 팁으로 재현탁하여 신중하게 혼합하여 웰/접시에 따른 세포 수 변동을 방지하세요. 세포 배양 기질 손실을 방지하기 위해 모든 웰을 시딩하기 전에 이 단계는 권장되지 않습니다. 세포 배양 매트릭스가 굳어져 피펫 끝에 달라붙을 수 있기 때문입니다.

표 1: 매질 성분 (N2B27 염기, 2iLIF, N2B27diff). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 2: 접시당 세포 수, 세포 배양 매트릭스 양, 배양액, 젤리 형성 시간에 관한 정보. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

2. 신경 분화 증진과 후방화 및 복측화 유도를 위한 NTOs의 RA 치료

  1. 레티노산(RA) 알리쿼트
    1. 올-트랜스 RA 파우더는 실온(-20°C에서 보관)으로 옮기세요.
    2. 적절한 부피의 DMSO에 분말을 재구성하여 최종 농도인 100 mM에 도달합니다.
    3. 100 mM RA 1 μL 각각 1.5mL 나사형 뚜껑 바이알에 분할 투여합니다.
    4. 튜브가 '가득 찰' 때까지 아르곤 가스를 추가하세요.
      참고: 아르곤 가스는 산소보다 무거워서 RA를 공기 중에서 덮고 보존하기 위해 튜브 바닥으로 가라앉습니다. 관이 가득 찼을 때 새어나올 때 손에 이 느낌이 느껴집니다.
    5. 병을 꽉 닫아. RA는 빛과 공기에 매우 민감합니다.
    6. 알리코트는 -80°C에서 어두운 곳에 보관하다가 추가 사용 후에야 보관됩니다. 또는 재구성된 RA는 액체N2에 1.5mL 마이크로 원심분리관에 저장할 수 있습니다.
      참고: 재구성되고 희석된 RA는 호일로 덮어 냉장고에 최대 2일간 보관할 수 있습니다.
  2. NTOs에 대한 RA 치료 18시간 (그림 4A)
    1. -80 °C에서 100 mM 농도의 알리코트 1 μL를 꺼내 실온에서 해동할 때까지 어둠 속에 보관하세요(예: 손바닥에 쥐거나 조명이 켜지지 않은 생물안전 캐비닛의 튜브 랙 등).
      참고: RA 알리코트가 액체 N2에 저장되어 있을 경우, 즉시 마이크로 원심분리기 튜브의 뚜껑을 열어 튜브 폭발을 막은 후 다시 닫고 2.2.2단계로 진행하세요.
    2. 해동 후에는 P1000 피펫을 사용해 250 μM 농도로 미리 가열한 N2B27diff 배지 400 μL를 추가합니다. 균질성을 위해 충분히 섞으세요.
      참고: 또는 RA를 N2B27diff 배지 대신 순수 DMSO에서 재구성하여 희석할 수 있으나, 이는 배양 내 DMSO 농도를 증가시킵니다. 배지(N2B27diff)를 준비할 때는 37°C에서 최대 5-10분간 보관하며, 가능하면 상온에서 보관합니다.
    3. 인큐베이터에서 NTO를 키우는 접시/접시를 꺼내 멸균된 생물안전 캐비닛에 넣으세요.
    4. 위상차 현미경으로 성장하는 NTO를 관찰하세요. NTO의 형태학은 배양의 생존 가능성과 실험의 효능에 관한 정보를 제공하는 데 매우 중요합니다(그림 4B-D).
    5. 접시나 접시의 뚜껑을 열고 접시를 약간 옆으로 기울이세요. 배지를 P200 피펫이나 흡입기를 사용해 세포 배양 기질을 방해하지 않고 조심스럽게 흡입하세요. 배양액이나 세포 배양 혼합물이 건조해지지 않도록 배지 없이 NTO를 가능한 한 짧게 보관하세요.
    6. 적절한 양의 N2B27diff에 250 nM RA 용액을 보충하여 추가하고( 표 2 참조), 뚜껑을 덮은 후 NTO를 다시 인큐베이터로 옮깁니다.
      참고: 특히 RA가 완전히 혼합되지 않은 경우, 일반 N2B27 diff에서는 녹기 어려운 침전물이 형성될 수 있습니다. 이 경우 알리코트를 버리고 새로운 RA 알리코트를 만드세요. 이 침전물들은 RA의 농도가 알려지지 않고 통제되지 않기 때문입니다.

3. RA 제거 및 NTO의 일일 중간 교체

  1. 배양판을 인큐베이터에서 멸균 생물안전 캐비닛으로 옮기세요.
  2. 뚜껑을 열고 접시를 약간 옆으로 기울이세요.
  3. RA가 포함된 N2B27diff는 P200 피펫이나 흡인기를 사용해 세포 배양 기질에 닿지 않고 조심스럽게 흡인하십시오.
  4. 미리 예열한 PBS를 추가(세포 배양 매트릭스 방울을 덮을 만큼 충분한 부피를 사용하거나 표 2에 언급된 것처럼), 다시 한 번 플레이트를 기울이고 조심스럽게 제거하여 남은 RA를 씻어냅니다.
  5. 적절한 양의 N2B27diff( 표 2에 참조됨)를 웰/접시 벽을 따라 피펫팅하여 세포 배양 기질 방울을 손상시키지 않도록 추가합니다.
  6. 3.1-3.3단계를 따라 매일같이 미디엄을 교체한 후, 웰/접시 벽에 미디엄을 피펫으로 부드럽게 넣은 후 NTO를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 세포 배양 기질 방울에 직접 강하게 피펫팅하거나 냉 배지/PBS를 첨가하면 배양 기질 방울이 플레이트/접시에서 분리되고 파손될 수 있습니다.
    참고: 소분자나 재조합 단백질을 사용해 경로를 교란시킬 때는 매개체를 매일 교체하는 것이 중요합니다. 약물을 하루 이상 적용할 경우, 단백질/약물의 안정성과 올바른 농도의 지속을 보장하기 위해 신선하게 매일 또는 최소 이틀에 한 번씩 약물 용액을 준비해야 합니다.

4. NTO의 고정

참고: NTO는 Krammer 등에서 설명한 대로 고정됩니다. 이후 사용할 항체에 따라 다양한 출처(상점에서 구입한 것, 자체 구매 등)에서 PFA를 요구할 수 있습니다.

  1. PFA 알리코트를 4°C에서 하룻밤 해동하세요.
  2. 사용 전에 PFA를 실온으로 옮기세요.
  3. PFA의 농도가 높은 경우, 화학 후드에서 N2B27diff 배지 또는 PBS에서 PFA를 4%로 희석하세요.
  4. 인큐베이터에서 NTO를 꺼내 화학 후드로 옮기세요.
  5. 뚜껑을 열고 1:1 비율로 4% PFA를 NTOs에 직접 첨가하여 최종 농도가 2%로 만듭니다(예: 96웰 플레이트의 100 μL N2B27diff에 4% PFA 100 μL 첨가).
  6. 뚜껑을 다시 덮고 상온에서 30분간 배양하세요. 타이머를 설정하세요. 긴 고정 시간은 특정 항체 치료의 효과를 저하시킬 수 있습니다.
    참고: PFA는 독성이 있으므로 흡입해서는 안 됩니다. 화학 처리막 아래에서 조심스럽고 조심스럽게 작업하세요. 일부 항체는 특정 PFA를 사용하거나 더 짧고 최적화된 고정 시간이 필요합니다.
  7. 30분 후 뚜껑을 열고 접시를 약간 옆으로 기울인 후 3.3-3.4단계를 따라 하세요.
  8. 미리 가열한 PBS를 조심스럽게 추가하고(표 2에 언급된 대로 세포 배양 매트릭스 방울을 덮을 만큼 충분한 부피를 사용), 실온에서 5분간 배큐합니다. 이 과정을 3번 반복해서 남은 PFA를 모두 제거합니다.
  9. 최종 세척 후에는 적절한 양의 PBS( 표 2 참조)를 추가하고, 파라필름으로 플레이트를 밀봉한 후 4 °C에서 보관하여 추가 사용 시까지 보관합니다.

5. NTO의 항체 염색

  1. 항체 염색은 NTO의 정확한 정체와 검사/실험의 성공 여부를 평가하는 데 매우 유용한 도구입니다. 항체 염색은 Meinhardt 등24 편과 Krammer 등26편에 설명된 대로 수행할 수 있습니다.
    참고: NTO가 최적이 아니거나 시공간 마커 표현이 맞지 않는 경우(그림 5부터 그림 7까지), 품질 기준을 충족하지 못하므로 해당 물질을 폐기하십시오.
  2. 블록/투과성 용액(1x PBS 1% BSA와 0.5% Triton-X)을 4°C에서 유지하고 실온에 적응한 후 사용 하세요.
  3. 완전한 3D 재구성 및 분석을 위해서는 항체(1차 와 2차)를 최소 1, 가능하면 2-3일 정도 4°C에서 유지하여 항체 침투를 원활하게 해야 합니다.
    참고: Alexa Fluor 항-561 2차 항체는 분화 분석의 첫 3일 동안 세포 배양 기질에서 더 강한 배경 신호를 제공할 수 있습니다.

6. NTO의 청산

  1. 26번 정리 준비
    1. 제거 절차를 시작하기 전에 항체 염색 과정을 완료하세요(1차 및 2차 항체 모두 배양하여 완전히 세척하세요).
    2. 투명 용액에 프로필갈레이트(투명화 용액당 2mg)를 첨가하여 NTO의 광표백을 최소화합니다.
      참고: 투명화 제거는 영상 촬영 1-2시간 전에 수행하여 산화(액체가 연한 노란색/크림색에서 밝은 노란색 또는 갈색으로 변함)나 투명화 용액의 결정화를 방지하세요. 결정화가 발생하면 PBS를 웰에 첨가하여 용해합니다.
  2. 용액 pH 및 혼합 주의사항
    1. 빠른 산화나 세포 배양 기질 용해를 방지하기 위해 투명 용액의 적절한 pH를 유지하세요.
    2. 공기 방울 형성을 막기 위해 용액을 격하게 흔들거나 격하게 섞지 마세요.

7. NTO 분석

  1. 현미경 준비
    1. 항체 염색과 전체 조직 제거가 완료된 후, 10-40배 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용해 영상을 촬영하세요.
  2. 시각적 평가
    1. 시각적 평가와 수동 정량화를 통해 NTO가 적절한 신경 표지 발현과 배복측 조직을 보인는지 효율적으로 판단하세요.
  3. 3D 분석 소프트웨어
    1. 3D 분석을 위해서는 CellProfiler28, 29, Imaris(파일 변환기 및 뷰어) 등 유사한 소프트웨어를 사용하여 공간 마커와 구조적 세부 사항을 평가하세요.
  4. NTO 신원 확인
    1. 신경 표지자의 시간적 발현과 특정 배복측 패턴 표지자의 시공간적 발현을 평가하여 NTO의 올바른 정체를 확인한다. 이 단계는 추가 연구 전에 분별 분석이 성공적이었는지 확인하는 데 필수적입니다.
  5. 특성화 측면: 다음 문화 성공의 중요한 측면을 확인하려면 그림 4뿐만 아니라 그림 6 , 그림 7 도 참고하세요:
    1. 성공적인 상피화 및 내강 형성을 확인하려면 그림 4 와 Meinhardt 등(24 )에 나타난 ZO-1 염색을 참고하세요.
    2. 성공적인 신경 분화는 OCT4의 하향 조절과 SOX1의 상향 조절, 그리고 β3TUBULIN 발현(24에 상세 설명)으로 특징지어집니다. 성공적인 신경 분화를 확인하려면 그림 6 과 그림 7 을 참고하세요.
    3. 배측 패턴은 복측 FOXA2+/SHH+ 바닥판과 반대편 등극의 PAX3+ 발현으로 확인된다(상세한 복측 패턴26). 성공적인 배복부 패턴을 확인하려면 그림 6 과 그림 7 을 참고하세요.

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결과

이 원고에 제시된 모든 대표적인 예시에는 R1 마우스 ESC가 사용되었습니다. 언급한 다른 마우스 ESC들은 NTOs에 시딩되었을 때 상피화 시기, 신경 분화 또는 패턴 효율에서 약간의 차이를 보일 수 있으나, 결과는 여기 제시된 데이터와 크게 다르지 않을 것입니다.

적절한 셀 밀도에 시딩된 고품질 ESC(그림 2A)만(그림 3)이 고품질 NTO를 형성합니다(그림 4B). 적절한 밀도(그림 3)로 양질의 ESC(그림 2)를 세포 배양 기질에 시딩하면, 이 단일 세포들은 2일 이내에 클론적으로 확장되고 상피화됩니다(그림 ...

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토론

여기서는 고품질 NTO를 생성하기 위한 원래 프로토콜에 대한 여러 최적화 및 개선 사항을 소개하여 실험실 간 표준화를 촉진합니다. 주요 수정 사항으로는 다양한 ESC 배양 조건, 입력 세포 수 감소, 개선된 분화 배지, 수정된 분화 프로토콜, 그리고 다중 웰 플레이트를 이용한 고처리량 분석을 위한 씨앗 밀도 조정이 있습니다. 프로토콜의 여러 측면은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻기 위해 특히 중요합니다. 먼저, 적절한 단백질 농도와 올바른 세포 배양 기진을 사용해야 하며, 부적절한 농도는 NTO 패턴화 효율에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다( 표 3 참조). 둘째, 세포는 적절한 밀도로 단일 세포로 시딩되어야 합니다; 씨앗 덩어리가 '포도와 같은' 형성과 다중 내강을 가진 비상피화된 NTO를 만들 수있습니다. 셋째, 씨앗 전에 ESC 유지 배양지에서 2iLIF를 완전히 제거하는 것이 필수적...

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공개 사항

저자들은 이해 충돌이 없음을 선언한다.

감사의 글

이 프로토콜 개발에 참여한 현재와 과거 다나카 연구실 구성원들께 감사드립니다. 특히, 원고를 비판적으로 읽고 의견을 내며 설계도를 도와준 A. 펠츨과, 원고를 비판적으로 읽고 편집하며 설계도 지원을 제공한 E. 하치다키에게 감사드립니다. 또한 Juergen A. Knoblich와 함께 PUD 25 자금을 확보해 주셨습니다. 이 출판물은 오스트리아 과학 기금(FWF)의 지원을 받았습니다: "독립 출판 프로젝트 번호 PUD 25". 또한 이 프로젝트는 유럽연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램(보조금 계약 ERC AdG 742046)과 오스트리아 과학기금(FWF) [10.55776/ F7803-B](줄기세포 조절)으로부터 자금을 지원받았습니다. 오픈 액세스의 목적을 위해, 저자들은 이 제출에서 발생하는 모든 저자 수용 원고(AAM) 버전에 대해 CC BY 공공 저작권 라이선스를 적용하였습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
35 mm 접시 | No. 1.5 커버슬립 | 14 mm 유리 직경 | 코팅되지 않은 상태맷텍 코퍼레이션Cat# P35G-1.5-14-C
아큐타제인비트로젠캣# 00-4555-56
알부민(BSA) fraction V (pH 7.0)판리악 AppliChem카탈로그# A1391
올-트랜스 레티노산머크캐트#R2625
B-27 보충제(50X), 혈청 무첨가깁코캣# 17504044
기저막 매트릭스 (마트리젤)코닝캣# BDL354234단백질 농도 10 mg/ml;
셀캐리어-96 울트라 마이크로플레이트퍼킨엘머캣# 6055302
셀프로파일러 4Stirling 외 2021https://cellprofiler.org
CHIR 99021토크리스카탈로그# 4423
CUBIC-R+(N)Matsumoto 외, 2019해당 없음
디메틸설폭시드시그마 올드리치카테고리# D2650
DMEM/F-12, 글루타민 없음깁코캣# 21331020
둘벡코 s 인산염 완충 식염수 (DPBS, 1X)깁코캣# 14190144
에펜도르프 원심분리기 5810 R에펜도르프캣# 5811000015
에펜도르프 마이크로튜브 3810X머크캣# EP0030125150
팔콘 원뿔 원심분리관코닝캣# 352095
젤라틴머크카테고리# G2500
L-글루타민 (200 mM)깁코캣# A2916801
HeracellVIOS 160i CO2 인큐베이터, 165L서모피셔 사이언티픽캣# 51033557
이마리스옥스퍼드 인스트루먼츠https://imaris.oxinst.com
역방향 LED 위상 대비 현미경 (CKX53)올림포스
2-머캅토에탄올 (50 mM)깁코캣# 31350010
단클론 마우스 항OCT-3/4산타크루즈 바이오테크놀로지캐트# sc-5279; RRID:AB_6280511:200 사용
단클론 마우스 항-PAX3DSHB카테고리# PAX3-C; 리드:AB_5284261:100 사용
단클론 토끼 항SHH세포 신호 전달 기술Cat#2207; 리드:AB_21881911:300 사용
단클론 토끼 항-베타; 3-튜불린세포 신호 전달 기술카탈로그#5568; RRID:AB_106945051:500 사용
단클론 마우스 항-ZO-1인비트로젠카탈로그# 33-9100; 리드:AB_25331471:200 사용
마우스 LIFQkineCat# Qk018-1000
N-2 보충 (100배)깁코캣# 17502048
신경기저 매질깁코캣# 21103049
파라포름알데히드, 시약등급, 결정질머크카탈로그# P6148
경찰 0325901토크리스카탈로그#4192
페니실린-스트렙토마이신 용액깁코캣# 15140130
위상 대비 현미경
폴리클론 염소 항-FOXA2R& DCat# AF2400; 리드:AB_22941041:400 사용
폴리클론 염소 항-SOX1R& D 시스템즈Cat# AF3369; RRID:AB_22398791:200 사용
그림 6과 관련된 RNA-Seq 데이터Ishihara 외, 2022지오: GSE214368
SafeFAST 프리미엄 미생물 안전 캐비닛다싯 그룹 더 패스더캣# F00025200000
피루베이트 나트륨 (100 mM)깁코캣# 11360070
회전 원반 공초점 역현미경 (IX3)올림포스
트리톤 X-100시그마 올드리치캣#9036-19-5

참고문헌

  1. Hiiragi, T., Solter, D. First cleavage plane of the mouse egg is not predetermined but defined by the topology of the two apposing pronuclei. Nature. 430 (6997), 360-364 (2004).
  2. Louvet-Vallée, S., Vinot, S., Maro, B. Mitotic spindles and cleavage planes are oriented randomly in the two-cell mouse embryo. Curr Biol. 15 (5), 464-469 (2005).
  3. Sagner, A., Briscoe, J. Morphogen interpretation: concentration, time, competence, and signaling dynamics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 6 (4), e271(2017).
  4. Anlaş, A. A., Nelson, C. M. Tissue mechanics regulates form, function, and dysfunction. Curr Opin Cell Biol. 54, 98-105 (2018).
  5. Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape: mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. J Cell Sci. 131 (6), jcs214015(2018).
  6. Lajtha, L. G. Stem cell concepts. Differentiation. 14 (1-3), 23-33 (1979).
  7. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  8. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  9. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: modeling development and the stem cell niche in a dish. Dev Cell. 38 (6), 590-600 (2016).
  10. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  11. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  12. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Park, G., Rim, Y. A., Sohn, Y., Nam, Y., Ju, J. H. Replacing animal testing with stem cell-organoids: advantages and limitations. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1375-1386 (2024).
  14. Xu, Z., et al. Merits and challenges of iPSC-derived organoids for clinical applications. Front Cell Dev Biol. 11, 1188905(2023).
  15. Phipson, B., et al. Evaluation of variability in human kidney organoids. Nat Methods. 16 (1), 79-87 (2019).
  16. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  17. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  18. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nat Biotechnol. 35 (7), 659-666 (2017).
  19. Eichmüller, O. L., et al. Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects. Science. 375 (6579), eabf5546(2022).
  20. Reumann, D., et al. In vitro modeling of the human dopaminergic system using spatially arranged ventral midbrain-striatum-cortex assembloids. Nat Methods. 20 (12), 2034-2047 (2023).
  21. Esk, C., et al. A human tissue screen identifies a regulator of ER secretion as a brain-size determinant. Science. 370 (6519), 935-941 (2020).
  22. Krenn, V., et al. Organoid modeling of Zika and herpes simplex virus 1 infections reveals virus-specific responses leading to microcephaly. Cell Stem Cell. 28 (8), 1362-1379.e7 (2021).
  23. Li, C., et al. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature. 621 (7978), 373-380 (2023).
  24. Meinhardt, A., et al. 3D reconstitution of the patterned neural tube from embryonic stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 987-999 (2014).
  25. Wu, Y., Peng, S., Finnell, R. H., Zheng, Y. Organoids as a new model system to study neural tube defects. FASEB J. 35 (4), e21545(2021).
  26. Krammer, T., et al. Mouse neural tube organoids self-organize floorplate through BMP-mediated cluster competition. Dev Cell. 59 (15), 1940-1953.e10 (2024).
  27. Ishihara, K., Ranga, A., Lutolf, M. P., Tanaka, E. M., Meinhardt, A. Reconstitution of a patterned neural tube from single mouse embryonic stem cells. Organ Regen. 1597, 43-55 (2017).
  28. Mulas, C., et al. Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells. Development. 146 (6), dev173146(2019).
  29. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  30. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  31. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  32. Ishihara, K., et al. Topological morphogenesis of neuroepithelial organoids. Nat Phys. 19, 177-183 (2023).
  33. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
  34. Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  35. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).
  36. Robanus-Maandag, E., et al. p107 is a suppressor of retinoblastoma development in pRb-deficient mice. Genes Dev. 12 (11), 1599-1609 (1998).
  37. Smith, A. G., Hooper, M. L. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells. Dev Biol. 121 (1), 1-9 (1987).
  38. Kuehn, M. R., Bradley, A., Robertson, E. J., Evans, M. J. A potential animal model for Lesch-Nyhan syndrome through introduction of HPRT mutations into mice. Nature. 326 (6110), 295-298 (1987).
  39. Doetschman, T., et al. Targeted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells. Nature. 330 (6148), 576-578 (1987).
  40. Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).
  41. Ranga, A., et al. Neural tube morphogenesis in synthetic 3D microenvironments. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), (2016).

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