방법 논문

행동 관찰을 위한 제브라피시 유충에 대한 휘발성 마취제 투여

DOI:

10.3791/67896

⸱

2025년 6월 6일

 ,  , 
1Perelman School of Medicine, Department of Anesthesiology and Critical Care, University of Pennsylvania

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 행동 실험을 위해 유충 제브라피시에게 휘발성 마취제를 투여할 수 있는 기밀 환경을 조성하기 위한 접근 가능한 방법을 제공합니다.

초록

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이 연구는 행동 실험 중에 유충 제브라피쉬에게 이소플루란 및 세보플루란과 같은 휘발성 마취제를 투여하는 독특한 방법을 설명합니다. 제브라피시는 척추동물 모델 유기체로서 복잡한 행동, 유전적 다루기, 투명한 배아, 빠른 발달 등 많은 이점을 제공하지만, 휘발성 마취제를 연구하는 데 사용되는 용도는 제한적입니다. 휘발성 마취제의 투여에는 일반적으로 접근할 수 없는 복잡하거나 번거로운 장치가 필요한 경우가 많아 수성 모델 유기체에서 휘발성 마취제에 대한 약리학적 연구에 장벽이 생깁니다. 이 방법은 접착 실리콘 시트를 사용하여 유리 96웰 플레이트에 기밀 밀봉을 생성하는 간단한 기술을 제공합니다. 검증은 자발적인 움직임에 대한 평가를 통해 수행되었으며, 90분 동안 밀폐된 우물과 열린 우물 간에 큰 차이가 없는 것으로 나타났습니다. 또한 마취제 농도는 HPLC로 측정한 바와 같이 시간이 지남에 따라 안정적으로 유지되었습니다. 대표적인 결과로는 세보플루란에 대한 유효농도 중앙값(EC50)의 실험적 측정이 있습니다. 이 연구는 휘발성 마취제를 사용하는 약리학적 실험에 대한 간단하고 접근 가능한 접근 방식을 제공하며, 이는 다른 휘발성 물질 및 실험 종점을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

서론

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비수생 동물 모델(벌레, 파리, 설치류, 토끼, 영장류 등)은 역사적으로 마취 약리학을 연구하는 데 가장 일반적으로 사용되는 모델이었습니다. 이러한 각 종에서 휘발성 마취제(가스 흡입을 통해 투여)는 정맥 마취제(정맥 주사 또는 복강 내 경로로 투여)보다 훨씬 덜 까다롭습니다1. 단순히 정맥 주사를 투여하는 기술적 어려움 외에도, 휘발성 약물을 사용하면 정맥 주사제보다 안정적인 마취 상태를 유지하는 것이 훨씬 쉽다2.

유충 수생 종에 대한 정맥 마취제의 투여는 주변 수성 매질 3,4로부터의 확산에 의해 달성될 수 있으며, 따라서 비수성 종에 대한 휘발성 마취제의 투여와 더 유사합니다. 수년 동안 올챙이(Xenopus laevis)는 인공 연못 물 5,6에 마취제의 간단한 목욕 첨가에 의해 달성된 약물 투여 및 정상 상태 약동학의 용이성으로 인해 마취제를 연구하기 위한 선택 모델이었습니다. 그러나, 이 모델에서는 휘발성 마취제에 대한 연구의 예가 상대적으로 적은데, 이는 종종 특수 목적에 맞게 제작되고 사용하는 것이 번거로울 수 있는 기밀 장치의 요구 사항 때문입니다 7,8.

최근 몇 년 동안 제브라피쉬는 잘 설명된 복잡한 거동 및 이러한 거동을 관찰할 수 있는 상용 장치의 가용성과 같은 다른 이점 외에도 약물 투여의 용이성으로 인해 정맥 마취제 연구에 선호되는 모델이 되었습니다9. 최근의 많은 연구에서는 제브라피시 유충의 행동을 정량화하기 위해 96웰 및 24웰 플레이트 형식을 사용하여 마취제를 포함한 신경 활성 화합물을 스크리닝하기 위해 상업적으로 이용 가능한 관찰 장치를 사용했습니다 4,10,11,12,13,14,15 . 유충 단계는 많은 행동 반응을 평가할 수 있는 능력, 작은 크기, 높은 처리량 호환성 및 잘 특성화된 신경 회로 9,16,17로 인해 약리학 연구에 특히 적합합니다. 그러나 제브라피시 모델의 마취제에 대한 이러한 연구에서 한 가지 중요한 한계는 휘발성 마취제 투여가 상대적으로 어렵다는 것입니다. 이러한 한계로 인해 휘발성제와 정맥주사제를 비교하는 사례가 거의 없었다 4,15,18. 단일 동물 모델에서 두 종류의 마취제를 쉽게 연구하고 비교할 수 있다는 것은 모든 등급에 걸쳐 마취 약리학 연구를 용이하게 하는 중요한 도구를 추가합니다.

전통적으로 수생 종의 정맥 마취제 연구에는 사용하기 어렵거나 실험 기간 동안 마취제 손실을 방지할 수 있을 만큼 충분히 가스가 밀폐되지 않을 수 있는 특수한 맞춤형 장비가 필요했습니다. 여기에 설명된 절차는 상업용 관찰 장치를 사용하여 유충 제브라피시 행동을 관찰하는 데 적합한 유리 챔버에서 기밀 밀봉을 생성하는 쉽게 접근할 수 있는 대체 수단을 제시합니다( 재료 표 참조).

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프로토콜

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모든 제브라피시 실험은 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 동물 사용 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 성체 제브라피쉬는 University Laboratory Animal Resources(ULAR)의 감독하에 University of Pennsylvania의 수생 시설에서 유지되었습니다. 튀빙겐 롱핀 야생형 제브라피쉬는 모든 실험을 위해 사내에서 사육되었으며 수정 후 5일(dpf)에 도달할 때까지 13/11시간 명암 주기로 표준 축산 조건에서 유지되었습니다. 실험은 적절한 생물학적 다양성을 보장하기 위해 별개의 짝짓기 쌍에서 파생된 클러치와 함께 생물학적 복제품을 사용하여 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 접착 실리콘 시트 제작

참고: 이 재료와 동등한 재료(실리콘 시트와 접착제)는 상업적으로 조달할 수 있지만 종종 비용이 더 많이 들고 가용성이 적습니다.

  1. 깨끗하고 평평한 표면에 0.5mm 실리콘 시트를 놓습니다.
  2. 시트에 주름이 있는지 검사하고 가능하면 피하십시오.
    알림: 주름이 있는 실리콘 시트는 테이프에 적절하게 부착되지 않을 수 있으며 웰의 부적절한 밀봉 및/또는 제브라피쉬의 시각화가 좋지 않을 수 있습니다.
  3. 70% 알코올로 시트를 청소하여 기름이나 부스러기를 제거하고 건조시킵니다.
  4. 페인트 브러시와 같은 어플리케이터를 사용하여 실리콘 시트에 접착 프라이머를 얇고 균일하게 코팅합니다. 과도한 적용을 방지하려면 접착제 프로모터가 빠르게 건조될 때(1-5초 안에 설정) 더 작은 섹션에서 작업하십시오.
    알림: 이 접착 촉진 모터가 없으면 테이프가 실리콘 시트에 적절하게 부착되지 않습니다.
  5. 접착 프로모터가 적용되면 양면 코팅 테이프를 종이 뒷면이 위를 향하도록 하여 실리콘 시트와 정렬합니다.
  6. 롤러를 사용하여 실리콘에 테이프를 점차적으로 적용하여 표면을 매끄럽게 하고 기포를 제거합니다(초기 적용 후 실리콘 면이 위로 향하게 작업하면 기포를 시각화하고 제거하는 데 도움이 됩니다).
  7. 접착 촉진제가 평평한 표면에서 24시간 동안 완전히 경화되도록 합니다.
  8. 접착 실리콘을 최소 10mm 너비(웰 직경 7.5mm와 각 면에 겹침)의 스트립으로 자릅니다.
    참고: 웰 플레이트의 다른 모든 행을 사용할 때 스트립의 더 넓은 편차는 인접한 행의 웰에 부정적인 영향을 미치지 않으며, 이는 적용을 더 쉽게 만들 뿐만 아니라 웰의 전체 둘레를 밀봉하는 데 필요할 수 있습니다.
    1. 스트립이 웰 플레이트의 한 줄 너비를 덮을 수 있을 만큼 충분히 긴지 확인하십시오.
      알림: 24웰 또는 48웰 플레이트와 같이 96웰이 아닌 웰 플레이트를 사용하는 경우 플레이트의 특정 치수에 맞게 스트립 크기를 조정하거나 절단할 수 있으므로 플레이트 크기에 관계없이 적절한 적용 범위를 보장할 수 있습니다.

2. 용액 준비

참고: 휘발성 마취제의 모든 원액 및 분석 용액은 휘발성 화합물 농도의 손실을 피하기 위해 실험 직전에 만들어졌습니다.

  1. 각 용액(스톡 용액 또는 작업 용액)에 대해 HPLC 또는 섬광 바이알에 일정 량의 비휘발성 용매(E3 배아 물, DMSO 등)를 첨가하여 휘발성 마취제의 최종 희석액과 결합할 때 총 부피가 바이알을 충분히 채우고 최소한의 헤드 스페이스를 남깁니다( 그림 1A 참조).
  2. Hamilton 기밀 주사기로 휘발성 마취제를 추가하고 바이알을 빠르게 밀봉합니다.
    참고: 격막 뚜껑이 있는 바이알의 원액은 기밀 주사기로 용액을 이동 시켜 추가 희석을 용이하게 하는 데 사용할 수 있습니다.
  3. 그런 다음 필요에 따라 바이알(와류, 초음파 처리)을 혼합하고 제브라피시 플레이트를 준비하는 동안 임시로 보관합니다.

3. 행동 실험의 설정

참고: 프로토콜의 이 단계에서는 몇 가지 연습이 필요할 수 있습니다. 기술에 익숙해질 때까지 물고기나 귀중한 재료가 포함된 용액 없이 작업하는 것이 좋습니다.

  1. 애벌레 제브라피시 한 마리(5dpf)를 유리 96웰 플레이트의 다른 모든 줄로 옮깁니다.
    참고: 다른 모든 행을 비워 두면 3.4단계에서 우물이 밀봉되므로 유출로 인한 인접 우물의 오염 가능성을 줄일 수 있습니다.
  2. 각 웰에서 E3 용액을 조심스럽게 제거합니다. 이것은 한 번에 한 줄씩 또는 빠르게 작동할 수 있는 경우 전체 플레이트에서 수행할 수 있습니다.
    참고: 유충이 용액에서 벗어나는 기간을 최소화하여 잠재적인 스트레스를 줄였습니다. 스트레스를 최소화하기 위해 약물 함유 용액을 첨가하기 전에 용액을 부분적으로만 제거하는 것을 포함하여 다양한 실험 요구에 따라 대체 절차를 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 잠재적 스트레스를 보상하기 위해 동물에게 주어진 평형 시간, 용액 혼합 효율 및 작업 용액을 추가하기 전에 모든 E3를 제거하지 않은 경우 약물 함유 용액의 농도 정확도를 포함하여 실험의 요구에 맞게 조정되어야 합니다.
  3. 다음으로, 전사 피펫을 사용하여 행의 각 웰을 실험 용액으로 채웁니다. 거품이 생기지 않도록 주의하세요. 각 웰을 과도하게 채웁니다(그림 1B).
  4. 1단계에서 만든 접착 실리콘 스트립을 사용하여 스트립을 빠르게 아래쪽으로 누릅니다(그림 1C). 이것은 거품 형성을 방지하고 물고기가 인접한 우물로 넘치는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.
  5. 접시 상단을 단단히 눌러 각 웰이 밀봉되었는지 확인합니다.
  6. 용액이 교환되고 웰 플레이트의 다른 모든 행에 대한 웰이 밀봉될 때까지 2-5단계를 반복합니다(그림 1D).
  7. 접시를 부드럽게 뒤집어 기포가 있는지 검사합니다.
    참고: 기포가 있으면 제브라피시의 움직임을 시각화할 수 없습니다.
  8. 플레이트를 행동 관찰 장치(실리콘 접착제 면이 아래를 향함)에 놓고 행동 실험을 수행합니다(자세한 내용은 결과 섹션 참조).

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결과

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기존의 노천-우물 관찰과 비교
접착 밀봉이 자발적인 움직임에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해 개방형 우물과 밀봉된 우물의 대조군을 비교했습니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이, 이 기사에 설명된 실험에 사용된 표준 ~30분 동안 이러한 그룹 간에 통계적으로 유의미한 움직임 차이가 관찰되지 않았습니다. 다른 실험 패러다임은 더 긴 실험적 노출이 필요할 수 있음을 인식하고, 2시간 시간 과정을 수행하여 2시간 표시까지 움직임에 통계적 차이가 없음을 보여주었습니다( 그림 2B 참조). 실험 기간이 길수록 움직임의 차이가 더 커질 수 있습니다. 이전 연구에서는 저산소증이 수영 행동에 미치는 악영향을 정량화했으며,19 이는 궁극적으로 실험 결과의 무결성을 손상시켰다. 따라서, 저산소증 및/또는CO2 생성이 open-well cont...

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토론

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이 논문은 야생형 어류의 휘발성 마취 효능을 정량화하는 데 사용된 유충 제브라피쉬에 세보플루란과 같은 휘발성 마취제를 쉽게 투여하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 개념적으로 간단하지만, 휘발성 물질의 손실을 최소화하기 위해 짧은 시간 내에 적절하게 밀봉되고 기포가 없는 웰 열을 보장하기 위해서는 연습이 필요할 수 있습니다. 이 방법은 휘발성 화합물을 위한 것이기 때문에 웰 플레이트에 실리콘 접착제를 신중하게 도포해야 할 뿐만 아니라 휘발성 화합물 농도의 정확도를 최적화하기 위해 실험 용액을 신중하게 준비해야 합니다.

공기가 갇히면 정확한 시각화 및 추적이 방해받을 수 있습니다. 밀봉을 연습하는 것 외에도 밀봉 전에 존재하는 기포가 밀봉 과정에서 제거될 가능성이 낮기 때문에 각 웰을 주의 깊게 채우고 검사하는 것이 중요합니다. 또한 우물을 과도하게 채우면 각 우물에 공기가 갇히는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 그러나 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 충돌이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 마취 교육 및 연구 재단(FAER)의 자금 지원을 받았습니다. 그림 1 은 BioRender.com 에서 만든 것입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
96웰 유리 마이크로플레이트Zinsser 북미3600500"이 유리 마이크로플레이트는 특수 고순도, 내열성 붕규산 유리로 만들어졌으며 표면은 산성 광택 처리되어 있습니다. 플레이트는 표준 SBS 마이크로플레이트 풋프린트(85 x 127mm)에서 직사각형입니다. 이 유리 반응기 마이크로플레이트는 주로 화학 응용 분야에 사용하도록 설계되었으며 최대 530도의 온도에 내성이 있습니다. C. 고압멸균할 수 있습니다. 균질한 유리 시트로 가공되며 균일한 형상과 모양이 특징으로 유정에서 유정까지 일관된 온도(일반적으로 섭씨 0.2도 이내)를 제공합니다."
2.0 mL 투명, 대형 개구부, 9 mm 스레드 바이알 켐글래스 생명과학CV-1150-1232"입구가 40% 더 큰 이 바이알은 로봇 팔 자동 시료 주입기에서 작동하도록 특별히 설계되었습니다. 또한 제한된 용량의 인서트를 바이알 목의 중앙에 정확하게 배치하는 고유한 Step Vial 디자인을 통합합니다. "
3M 양면 테이프 9490LE애브비 Inc24WG90"3M 라미네이팅 접착제 300LSE가 포함된 3M 이중 코팅 테이프 9490LE는 폴리프로필렌 및 분말 코팅 페인트와 같은 많은 저표면 에너지 플라스틱을 포함하여 대부분의 표면에 높은 접착 강도를 제공합니다. 아크릴 접착제는 또한 일반적으로 기계 부품에 사용되는 오일로 가볍게 오염된 표면에 탁월한 접착력을 제공합니다. 3M 양면 코팅 테이프 9490LE는 한쪽 면에 3M 라미네이팅 접착제 300MP의 추가 기능을 제공하여 다양한 폼 및 직물 재료(6인치 x 5야드)에 탁월한 접착 강도를 제공합니다."
DanioVision 관측실놀두스DVOC-0041"DanioVision은 멀티웰 플레이트에서 제브라피쉬 유충의 고처리량 테스트를 위해 설계된 완벽한 시스템입니다. 여기에는 Observation Chamber와 유명한 EthoVision XT 비디오 추적 소프트웨어가 포함됩니다."
DanioVision 온도 제어 장치놀두스DVTCU-0011"DanioVision 온도 제어 장치는 유동 시스템으로, 물이 선택한 온도에서 웰 플레이트 아래로 고르게 흐릅니다. 온도는 웰 플레이트 전체에서 동일합니다."
Ethovision XT16 소프트웨어놀두스NSE-EV-기반"EthoVision XT는 Noldus가 상표로 등록한 모든 동물의 행동, 움직임 및 활동을 추적하고 분석하는 가장 널리 적용되는 비디오 추적 소프트웨어입니다."
이소플루란피라말 중환자 치료NDC # 66794-017-10흡입용 액체, 불연성 비폭발성 흡입 마취제, 100mL 이소플루란을 함유하고 있습니다. 제어된 실온 20°m에서 보관; 25º까지; C
Scotch-Weld 순간 접착제 프라이머 AC79 클리어3분"62-3916-0860-1 (제품 ID) C2103N (로트)""3M Scotch-Weld 순간 접착제 프라이머 AC79는 EPDM, 실리콘 및 기타 고무와 같이 접착하기 어려운 낮은 표면 에너지 엘라스토머에 사용하도록 설계되었습니다. 표면 준비 및 도포가 간단하며 접착 프라이머는 빠르게 건조되어 작업을 빠르게 진행할 수 있습니다."
0.5mm 두께의 실리콘 시트다양한 공급업체해당 사항 없음반투명 실리콘 시트는 여러 공급업체로부터 구입했습니다.
플라스틱 프레임이 있는 Speedball Pop-in Hard Rubber Brayer, 4인치"스피드볼793728"Speedball Pop-In Hard Brayer에는 쉽게 청소할 수 있도록 스냅 아웃되는 롤러가 있습니다. 플라스틱 일체형 프레임과 분리 가능한 4인치 너비의 롤러. 순수 천연 고무로 제작되었으며 접지 마감 처리가 되어 있습니다. 단단한 고무 브레이어는 견고한 플라스틱 프레임으로 너비가 4인치이며 접착제 도포에 적합합니다."
SureSTART 9mm 스크류 캡, 레벨 2 고처리량 애플리케이션, 유형: AVCS 스크류 캡 검정색 PP, 흰색 실리콘/빨간색 PTFE 셉타 1.0mm써모 사이언티픽6ASC9ST1B"Thermo Scientific SureSTART 9mm 스크류 캡을 9mm 개구부가 있는 스크류 바이알과 함께 사용하십시오. 성능 레벨 2 캡은 y 일상적인 GC-MS 및 LC-MS 분석에 대한 결과의 저번출, 견고성 및 재현성을 보장하기 위해 제조 및 테스트되었습니다. 자동 시료 주입기 바늘 문제를 줄이기 위해 설계된 다양한 경도 값의 다목적 실리콘/PTFE 격막이 있는 폴리프로필렌 캡 중에서 선택하십시오. 당사의 AVCS 캡은 고급 바이알 폐쇄 시스템 기술을 통합하여 바이알을 닫을 때 최적의 밀봉 압축을 보장합니다."
울탄 세보플루란애브비 IncNDC # 0074-4456-04흡입용 휘발성 액체는 250mL 세보플루란이 들어 있는 호박색 병에 포장되어 있습니다. 통제된 실온 15º에서 보관; 30º까지; C
휘튼 액체 신틸레이션 바이알, 바이알에 부착된 캡, 유리, 금속 호일/펄프, 24-400, 20 mL DWK 생명 과학986561Type I 붕규산 유리관, PET 또는 HDPE에서 변환된 20mL 섬광 바이알. 캡이 부착된 상태로 사용할 수 있습니다.

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