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방법 논문

Clostridioides difficile에 대한 생물막 분석과 약물 발견을 위한 응용 분야

988 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67913

⸱

2025년 7월 8일

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology and The South Texas Center for Emerging Infectious Diseases (STCEID), The University of Texas at San Antonio

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

박테리아 병원균 Clostridioides difficile 의 생물막과 질병에서의 중요성은 잘 알려져 있지 않습니다. 최근의 연구 결과는 재발의 역할을 시사하며 그 중요성을 강조하고 있습니다. 여기에서는 생물막에 대한 약물 발견을 위한 응용 프로그램과 함께 대사 판독과 결합된 생물막 분석의 적응에 대해 설명합니다.

초록

클로스트리디오이데스 디피실(Clostridioides difficile )은 위장관 세균 병원체로, dysbiotic 미생물군 환경을 이용하여 증식하고 독소를 분비하며 장 상피를 손상시킬 수 있습니다. C. 디피실 감염(CDI) 환자의 하위 집합은 항생제(15%-30%) 또는 분변 미생물군 이식(FMT)(<10%)의 치료 실패를 경험합니다. 따라서 추가적인 치료 개입의 개발이 매우 중요합니다. 재발에서 C. difficile 생물막의 역할은 불분명합니다. 그러나 다른 유기체의 생물막은 만성 및 재발성 질병의 원인이 되며, 이는 재발성 CDI에서도 발생할 수 있음을 시사합니다. 우리는 C. difficile 의 생물막이 가치 있는 치료 표적을 제시한다는 가설을 세웁니다. 여기에 제시된 프로토콜의 목표는 확립된 C. difficile 생물막에 대한 활성을 가진 재배치 가능한 화합물의 식별을 위해 생물막 형성 분석을 조정하는 것입니다. 이 프로토콜은 생물막 형성을 위한 강력하고 재현 가능한 분석을 개선하고, 이를 대사 분석에 결합하고, 약물 발견에 적용합니다. 이 프로토콜은 생물막 형성 분석, 바이오매스 및 대사 활성 판독, 약물 감수성 검사, 재배치 라이브러리의 약물 스크리닝 및 대표 결과를 간략하게 설명합니다.

서론

클로스트리디오이데스 디피실(Clostridioides difficile)은 독소를 생성하여 인간의 위장관(GI)에 심각한 손상을 입힐 수 있는 포자 형성 혐기성 박테리아 병원체입니다. C. difficile은 매년 거의 50 만 건의 사례를 일으키고 ~ 30,000 명의 사망자를 발생시킵니다 (CDC, 2015). C. 디피실 감염(CDI) 치료는 이미 경색된 의료 시스템(~48억 달러)에 상당한 비용을 추가합니다1,2,3. 가장 위험성이 높은 개인은 면역 억제, 항생제 노출 및/또는 노인이며, 모두 미국과 전 세계에서 계속 크게 증가하고 있습니다 4,5,6,7.

C. difficile은 숙주 GI 미생물총(GI microbiota)의 상태에 크게 의존하기 때문에 항생제 치료는 CDI의 주요 소인 인자입니다. C. difficile의 항생제 내성 임상 분리물의 확인은 치료를 더욱 복잡하게 만듭니다 8,9,10. 더욱이, CDI에 대한 항생제 치료를 받은 환자의 15%에서 30% 사이가 초기 치료에 실패한다 5,11,12,13,14,15,16. 환자가 재발 에피소드를 경험하면 재발 가능성은 45%-64%(재발 에스컬레이터)로 증가하고 추가 치료 실패 위험이 증가합니다16,17. 중요한 것은, CDI의 대부분의 재발 사례는 숙주에서 첫 번째 감염 에피소드를 확립한 원래 균주에 의해 발생한다는 것입니다 18,19, 성공적인 치료 후에도 C. difficile에 의한 지속적인 집락화를 시사합니다. 포자는 위장관에 잔류하고 생체 외 및 쥐 모델에서 재발을 유발하는 것으로 나타났지만,20, C. 디피실 생물막과 질병 및 재발에서의 역할은 충분히 연구되지 않았습니다. 생물막은 자가 생산된 세포외 기질에 의해 보호되는 미생물 군집으로, 항생제 치료 및 면역 반응과 같은 환경적 모욕에 매우 저항하는 특성입니다21. 또한, 생물막 형성은 중요한 독성 인자 22,23,24,25 이며 황색포도상구균 및 녹농균에 의한 것과 같은 박테리아 감염에서 생물막은 재발 및 만성 증상26,27의 핵심입니다. 최근에, C. difficile biofilms는 재발성 감염28,29,30 의 저장소로 제안되었으며 따라서 CDI 재발의 치료 및/또는 예방을 위한 고부가가치 표적을 나타냅니다.

C. difficile 생물막을 연구하기 위한 현재 모델에는 콜로니 생물막 모델(31,32), 미세발효기(33), 화학요법 내장 모델(34,35) 및 플라스크 또는 웰 플레이트(well-plate)를 사용하는 액체 배양 시스템(36,37)이 포함됩니다. 이러한 모든 모델은 뚜렷한 발달 단계와 뚜렷한 환경에서 C. difficile 생물막에 대한 주요 정보를 산출했습니다. 그러나 이러한 모델 중 일부(즉, 미세발효기, 화학발효기 장내 모델, 콜로니 생물막)는 약물 발견 노력에 적합하지 않습니다. 현재까지 약물 발견 노력과 관련된 대부분의 연구는 C. difficile 38,39,40,41의 플랑크톤 생활 방식에 초점을 맞추었습니다. 따라서 여기에 설명된 프로토콜은 확립된(24시간 된) C. difficile 생물막을 사멸할 수 있는 능력을 가진 재배치 가능한 분자를 식별하기 위해 라이브러리를 스크리닝하기 위한 플랫폼을 개발하는 것을 목표로 기존 96웰 플레이트 생물막 모델을 조정, 표준화 및 검증하는 것을 목표로 합니다. 프로토콜의 검증은 실험실에서 적응된 균주(630 Δerm)와 전염병 임상 분리물(2006년 영국 스토크-맨더빌 병원에서 발병 시 분리된 UK1 균주42) 간의 생물막 형성 능력을 비교하여 수행되었습니다. 생물막 형성은 바이오매스를 측정하기 위해 고전적인 Crystal Violet Assay를 사용하여 정량화하고 생물막의 생존력을 측정하기 위해 대사 분석을 사용하여 정량화되었습니다. 균주 간의 생물막 형성 능력에서 상당한 차이가 확인되었으며, 이는 잠재적인 임상적 함의를 시사합니다. 또한, 이 분석법은 확립된 생물막의 항생제 감수성 프로파일을 결정하는 데 활용되었습니다. 마지막으로, 개념 증명으로, 말라리아와 같은 소외된 질병에 대한 새로운 치료법을 발견하는 데 중점을 둔 비영리 단체인 MMV(Medicines for Malaria Venture)의 Global Health Priority 상자를 스크리닝하여 C. difficile의 기존 생물막에 대한 활성을 가진 화합물을 식별했습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 성숙한 생물막을 표적으로 하는 약물 스크리닝 플랫폼으로 사용하기 위해 고전적인 생물막 분석을 조정하고 검증합니다.

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프로토콜

1. 생물막 분석을 위한 세포 준비

주의: 클로스트리디오이데스 디피실(Clostridioides difficile )은 인간 병원체이며 BSL-2 격리가 필요합니다.

참고: 이 연구에 사용된 포자는 Tufts University School of Medicine의 Carol Kumamoto 박사로부터 획득했습니다. C. difficile 포자 스톡은 앞서 설명한 바와 같이 제조하였다 43,44,45. 그런 다음 포자는 플레이트를 줄무늬로 만들기 위해 PCR 튜브에 10μL 부피로 분주됩니다. 실험에 필요한 모든 배지 및 인산염 완충액 식염수(PBS)는 사용 24시간 전에 혐기성 챔버에서 사전 환원되어야 합니다. 이것은 챔버 내부의 미디어 또는 PBS가 들어 있는 병의 뚜껑을 풀어서 수행됩니다.

  1. 무산소 챔버에서 0.1%(w/v) 타우로콜레이트와 0.1%(w/v) L-시스테인(BHIS)이 보충된 Brain Heart Infusion 한천 플레이트를 가급적 하룻밤 또는 최소 3시간 동안 완전히 줄일 수 있도록 미리 줄입니다. 혐기성 챔버의 온도를 37°C로 설정합니다.
  2. 10μL의 포자가 들어 있는 PCR 튜브를 70°C에서 20분 동안 가열합니다. 이것은 수조 또는 열순환기에서 수행할 수 있습니다.
  3. 포자를 혐기성 챔버로 가져오고, 5x-6x를 부드럽게 피펫팅하여 혼합한 다음, 사전 감소된 BHIS 플레이트에서 10 μL를 피펫팅합니다. 앞서 설명한 대로46개의 사분면 줄무늬를 수행하고 37°C(혐기성 챔버의 온도)에서 밤새 플레이트를 배양합니다.
  4. 24시간 동안 성장하면 고립된 군체가 보여야 합니다. 단일 콜로니를 선택하고 일회용 루프를 사용하여 10mL의 BHIS 액체가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 하룻밤 동안 배양하십시오 (14-18 시간).
  5. 챔버에서 하룻밤 배양을 연속적으로 희석하여 세포 밀도를 측정합니다.
    1. 하룻밤 배양을 10배 희석합니다. 103 희석은 이 프로토콜에 사용된 각 균주에 대해 계산 가능한 샘플을 생성합니다. 그러나 성장 차이가 있는 임상 분리체의 경우 이 단계의 표준화가 필요할 수 있습니다.
    2. 혐기성 챔버에서 튜브를 꺼내 각 샘플 10μL를 혈구계에 넣고 혈구계 제조업체에서 설명한 대로 명시야 현미경을 사용하여 계수합니다.
    3. 계수 후 세포 농도를 결정하기 위해 제조업체의 지침에 따르십시오.

2. 생물막 형성

참고: 이 프로토콜은 고유한 웰 크기에 맞게 조정할 수 있지만 96웰 플랫폼에 최적화되었습니다. 웰 크기가 수정되면 웰의 표면적에 따라 세포 농도를 조정해야 합니다.

  1. 하룻밤 배양에서 세포 농도를 측정한 후 BHIS에서 세포 농도를 1 x 107 cells/mL로 조정합니다(10%(w/v) L-시스테인 및 0.1M 포도당 보충).
    참고: 0.1M 포도당 보충제는 이전에 C. difficile 630 Δerm 균주47에 의해 생물막 형성을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜의 경우, 1 x 107 cells/mL의 농도는 뚜렷한 시작 농도를 테스트한 후 선택되었습니다(그림 1). 포도당 보충 없이도 강력한 생물막 형성을 달성할 수 있습니다.
  2. 100μL의 세포를 96웰 마이크로타이터 플레이트(바닥이 평평하고 조직 배양 처리)의 웰에 분주하고 대조군(세포만) 컬럼과 공백(배지만) 컬럼을 남겨둡니다. 혐기성 챔버 (37 ° C)에서 24 시간 동안 배양합니다.
    1. 매체 증발이 문제가 되는 경우 바이오필름 플레이트를 가열 장치에서 멀리 두십시오. 또는 추가 용기 내부에 생물막을 넣거나 투과성 96웰 플레이트 멤브레인으로 덮습니다.
  3. 블랭크부터 시작하여 모든 웰에서 매체를 부드럽게 제거합니다. 이렇게 하면 부착되지 않은 세포가 제거되고 생물막이 남게 됩니다. 이 단계는 생물막 내의 세포만 관심을 끌기 때문에 중요합니다.
  4. 200μL의 사전 환원된 PBS로 바이오필름을 2x로 부드럽게 세척합니다. 이 세척을 부드럽게 수행하려면 96웰 플레이트를 약간 기울이고 파이펫 팁을 웰 벽에 삽입하고 바닥을 긁지 않고 팁을 웰 바닥 가까이로 밀어 천천히 흡인합니다. PBS가 맨 아래에 남아 있으면 프로세스를 다시 반복합니다. 이 단계에서 비부착 세포를 제거할 수 있으며 이는 정상입니다. 혐기성 챔버에서 플레이트를 꺼내기 전에 PBS를 제거하십시오.
  5. 이 시점에서 다음을 위해 생물막을 사용하십시오: 바이오매스 측정(3단계 참조). 대사 활동 측정(4단계 참조); 약물 감수성 및 약물 스크리닝 분석(5단계 참조).
    참고: 이 프로토콜은 실험실에서 적응된 630 Δerm 균주 및 전염병 UK1 균주에 대해 검증되었습니다. 뚜렷한 임상적 분리물과 균주는 약한 생물막 형성 능력을 나타낼 수 있습니다. 생물막 파괴를 최소화하려면 2x 대신 PBS 1x로 세척하고 세척량을 100μL로 줄이십시오.

3. Crystal Violet assay를 이용한 생물막 바이오매스 측정

참고: 크리스탈 바이올렛 염색은 앞서 설명한 프로토콜48을 기반으로 했습니다.

  1. 혐기성 챔버에서 생물막을 세척한 후(2.4단계 참조) 플레이트를 제거하고 화학 흄 후드로 옮깁니다.
  2. 생물막을 고정하려면 각 웰에 150μL의 메탄올을 부드럽게 첨가합니다. 접시를 뚜껑으로 10분 동안 덮습니다.
  3. 메탄올을 제거하고 뚜껑을 제거한 상태에서 웰이 완전히 건조되도록 합니다. 이 작업은 30분에서 45분 정도 소요됩니다.
  4. 모든 웰에 0.3% 크리스탈 바이올렛 100μL를 추가하고 10분 동안 염색합니다. 크리스탈 바이올렛은 판독에 영향을 줄 수 있으므로 웰 테두리와 벽의 얼룩을 방지하기 위해 조심스럽게 제거합니다.
  5. 뚜껑을 제거한 상태에서 접시를 건조시킵니다. 이 작업은 30분에서 45분 정도 소요됩니다.
  6. 증류수 200μL로 웰을 3번 세척하고 플레이트를 완전히 건조시킵니다. 30분에서 45분 정도 걸립니다.
  7. 건조되면 명시야 현미경을 사용하여 생물막을 이미지화합니다(그림 2A). 이 단계는 선택 사항이지만 생물막의 세포를 보다 철저히 관찰할 수 있습니다.
    1. 플레이트 어댑터를 사용하여 도립 명시야 현미경에 96웰 플레이트를 놓습니다. 테스트된 각 균주에 대한 대표 웰을 식별합니다.
    2. 원하는 배율로 각 웰에 대한 이미지를 촬영합니다. 이 프로토콜에 제시된 이미지는 40배 배율로 촬영되었습니다.
  8. 원하는 이미지를 획득하면 탈색을 위해 플레이트를 화학 흄 후드로 다시 옮깁니다.
  9. 생물막의 얼룩을 제거하려면 150μL의 33% 아세트산을 넣고 중간 속도로 셰이커에 10분 동안 놓습니다.
  10. 각 웰에서 90μL를 제거하고 새로운 96웰 플랫 바닥 플레이트로 옮깁니다. 플레이트 리더를 사용하여 595nm에서 흡광도를 판독합니다(그림 2B).

4. 대사성 염료 PrestoBlue를 이용한 생물막 생존율 측정

  1. 주요 수정을 사용하여 분석에 대한 제조업체의 프로토콜에 따라 대사 활성을 측정합니다. 분석을 위해 생물막을 준비하기 전에 플레이트 리더를 37°C로 가열합니다. 형광을 측정할 수 있는 플레이트 리더를 사용하는 것이 좋습니다.
    참고: 대안적으로, 대사 활성은 OD600에서 읽을 수 있습니다. 그러나 이러한 접근 방식이 이러한 분석에 대해 충분히 민감하다는 것을 발견하지 못했습니다. 사용자는 제조업체의 프로토콜을 검토하고 필요한 경우 표준화하는 것이 좋습니다.
  2. 상기한 바와 같이 혐기성 챔버에서 PBS로 바이오필름을 세척한 후(단계 2.4 참조) 챔버에서 플레이트를 제거합니다.
  3. 플레이트와 함께 사전 환원된 BHIS 9mL(10%(w/v) L-시스테인 및 0.1M 포도당 보충)를 제거합니다.
  4. Pre-reduced BHIS 및 vortex 9mL에 PrestoBlue 시약 1mL를 빠르게 첨가할 수 있습니다. 시약 착색에 영향을 줄 수 있으므로 시약을 미리 줄이지 마십시오(토론 참조).
  5. 각 웰에 100μL의 BHIS-PrestoBlue 혼합물을 추가합니다. 다음 설정으로 플레이트를 플레이트 리더에 놓습니다: 37°C의 온도, Kinetic의 분석 유형; 읽기 시간은 30분입니다. 2분마다 읽기 빈도; 사용 가능한 플레이트 리더의 유형에 따라 형광 강도. 이 프로토콜에 설명된 측정은 각각 560nm/590nm의 여기/방출 파장을 사용하여 수행되었습니다.
  6. 읽은 후에는 플레이트를 버리십시오.
  7. 플레이트 판독값에서 형광 값을 획득하면 블랭크(매체만 해당) 웰을 사용하여 모든 샘플 웰에서 노이즈를 제거합니다. 그 후, 각 화합물로 처리된 생물막 웰을 처리되지 않은(100%) 생물막을 함유하는 대조 웰로 분할하여 대사 활성을 얻습니다.

5. 생물막에 약물 첨가

참고: 아래에 설명된 설정은 약물 감수성 분석 및 고정 농도 약물 스크리닝을 위해 수정할 수 있습니다. 아래에 설명된 두 가지 방법 모두에 대해 PrestoBlue 분석이 권장됩니다.

  1. 개별 항생제의 최소 억제 농도(MIC) 측정
    참고: 생물막은 48시간 동안 처리되므로 오염 가능성이 높아집니다. 빈 우물을 먼저 처리하고 무균 절차를 따르는 것이 매우 중요합니다. 다른 C. difficile 균주 및 테스트 용량 반응 분석에 대해 문헌에 보고된 MIC 값은 이 프로토콜에 제시된 MIC 분석에 대한 시작 항생제 농도를 알리는 데 사용되었습니다. 이 접근법은 임상 분리물로 작업할 때 시작하는 항생제 농도를 결정하는 데 유용합니다.
    1. 위에서 설명한 바와 같이 혐기성 챔버에서 PBS로 성숙한(24시간 된) 생물막을 세척합니다(2.4단계 참조).
    2. 플레이트의 대조군(세포만) 및 블랭크(배지만) 컬럼을 제외한 각 웰에 테스트용 항생제의 2배 희석액을 포함하는 200μL의 사전 환원된 BHIS(10%(w/v) L-시스테인 및 0.1M 포도당이 보충됨) 배지를 추가합니다.
    3. 추가로 24시간 동안 배양합니다. 본 연구에서는 반코마이신(시작 농도 200μg/mL), 메트로니다졸(시작 농도 16μg/mL) 및 피닥소마이신(시작 농도 4μg/mL)을 사용하여 분석을 검증했습니다. MIC 값은 표 1에 보고되어 있습니다.
    4. 플레이트의 건조를 방지하려면 혐기성 챔버의 가열 장치에서 멀리 두거나 가스 투과성 멤브레인을 사용하십시오.
      참고: 또는 사전 감소된 PBS 또는 매체 해자(300μL)를 플레이트의 외부 웰에 사용할 수 있습니다.
    5. 약물로 24시간 배양 후 매체를 제거하고 PBS로 바이오필름을 1x 부드럽게 세척합니다. Crystal Violet assay 또는 PrestoBlue assay를 사용하여 바이오필름을 처리합니다.
  2. 약물 라이브러리 스크리닝
    1. 위에서 설명한 바와 같이 혐기성 챔버에서 PBS로 성숙한(24시간 된) 생물막을 세척합니다(2.4단계 참조).
    2. 고정된 농도의 약물 라이브러리 화합물을 포함하는 200μL의 배지를 플레이트의 대조군(항생제가 없는 배지의 세포) 및 블랭크(항생제가 없는 배지) 열을 제외한 각 웰에 추가합니다. 추가로 24시간 동안 배양합니다. 플레이트의 건조를 방지하려면 혐기성 챔버의 가열 장치에서 멀리 두십시오.
    3. 약물로 24시간 배양 후 매체를 제거하고 PBS로 바이오필름을 1x 부드럽게 세척합니다. Crystal Violet assay 또는 metabolic assay를 사용하여 생물막을 처리합니다.

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결과

위에서 설명한 프로토콜의 목적은 C. difficile의 확립된 생물막에 대한 활성을 가진 재배치 가능한 화합물을 식별하기 위한 약물 스크리닝 플랫폼으로 96웰 플레이트 생물막 형성 모델을 조정하고 검증하는 것입니다. 뚜렷한 세포 밀도(104, 105, 106 및 107 cells/mL)가 생물막 형성에 미치는 영향을 측정하고, 앞서 설명한 바와 같이 결정 바이올렛 염색에 의해 생물막 형성을 정량화했습니다48. 이 연구의 결과는 C. difficile 630 Δerm (실험실 적응 균주)에 의한 생물막 형성이 모든 시작 세포 밀도 간에 비슷하다는 것을 시사합니다. 이러한 연구를 위해 1 x 107 cells/mL의 세포 밀도가 선택되었습니다.

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토론

C. difficile 생물막 형성과 질병에서 수행하는 역할은 잘 알려져 있지 않습니다. 최근의 발견은 질병 재발에 있는 biofilms를 위한 역할을 건의한다 28,34. 생물막 형성은 중요한 독성 인자 22,23,24,25 이며 황색포도상구균 및 녹농균에 의한 것과 같은 박테리아 감염에서 생물막은 재발 및 만성 증상26,27의 핵심이며, 이는 CDI의 경우에도 발생할 수 있음을 시사합니다.

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공개 사항

저자는 공개할 충돌이 없습니다.

감사의 글

J.A.R.은 연구와 프로토콜을 설계하고 원고를 썼습니다. A.S.와 P.Z.는 실험을 수행하고 프로토콜을 개선하는 데 도움을 주었습니다. 이 작업은 UTSA(University of Texas at San Antonio)에서 J.A.R.에 이르는 창업 자금으로 지원되었으며, A.S.는 UTSA MARC 프로그램(T34GM145507)의 지원을 받았습니다. 저자는 Global Health Priority Box 라이브러리를 제공한 Medicines for Malaria Venture(MMV, 스위스)에 감사의 뜻을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세트산 SAF-CT ACS 500ML피셔 사이언티픽A38S500
한천 세균 GR 1KG피셔 사이언티픽AC443570010
BioTek Synergy H1 플레이트 리더피셔 사이언티픽BTH1MG
병 효모 추출물 500G피셔 사이언티픽DF0127179
뇌 심장 주입 국물피셔 사이언티픽CM1135R
크리스탈 바이올렛 USP 등급 100GVWR97061-850바이오매스 분석용 생물막 염색용
CytoOne 96-well TC 플레이트, 평평한 바닥, 투명, 개별 포장 withlids, 50/케이스USA ScientificCC7682-7596
D-(+)-포도당, 무수Fisher Scientific50712744
분자 생물학용 디메틸 설폭사이드(DMSO)Millipore SigmaD8418-250ML
FIDAXOMICIN 250MGFisher ScientificAC468312500
L-CYSTEINE 98+% 1KGFisher ScientificAAA104350BC. difficile media
메탄올 99.8 ACROSEAL 1LTFisher ScientificAC364390010
METRONIDAZOLE, 99% 5GRFisher ScientificAC210340050
인산염 완충 식염수 (PBS) 10XFisher ScientificBP3991
PrestoBlue 세포 생존율 시약Fisher ScientificA13262
SILVERSEAL OPAQUE ADHES 100/CSFisher Scientific7000379보관 전에 모녀 약물 플레이트를 밀봉하는 데 사용됩니다
트륨 타우로콜레이트 100MG VWR100291-598
반코마이신피셔 사이언티픽BP29581
. 나

참고문헌

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