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방법 논문

유도성 FRET 바이오센서를 이용한 미토콘드리아 관련 소포체 막 조회 탐지

132 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67914

⸱

2026년 8월 7일

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

이 논문에서

요약

우리는 시험 관 내에서 소변소국(CFP 태그) 또는 미토콘드리아(YFP 태그)를 표적으로 하는 유도성 FRET 바이오센서의 FRET 값을 측정하여 미토콘드리아 관련 소포국막(MAMs)의 조밀도를 평가하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 Aβ 생성에 영향을 미치는 합성 또는 천연 MAM 조절제의 초기 스크리닝에 활용될 수 있습니다.

초록

여러 연구에서 ER-미토콘드리아 접촉체 또는 미토콘드리아 연관막(MAMs)의 수, 길이, 간격(두께)이 이들의 생물학적 역할에 영향을 미친다는 것이 입증되었습니다. 이전 연구에서는 약 7nm 간격의 타이트한 MAM의 안정화가 아밀로이드 β(Aβ) 수치를 증가시키는 반면, 약 40nm의 간격을 가진 느슨한 MAM의 존재는 알츠하이머병(AD)의 3차원(3D) 신경 모델에서 Aβ 생성을 감소시킨다는 것을 보여주었습니다. 서로 다른 간격 폭을 가진 MAM의 효과를 조사하기 위해, ER과 미토콘드리아 표적 FRET(Förster Resonance Energy Transfer) 바이오센서인 ER-CFP(청록색 형광 단백질)와 Mito-YFP(노란색 형광 단백질)가 개발되어 느슨하거나 비MAM과 대조되는 좁은 MAM(<10 nm 간격)을 정량화하였습니다. FRET는 공여 형광체(CFP)와 수용체 형광체(YFP)가 서로 10nm 이내에 있을 때 발생하므로, 이 시스템은 MAM 근접성 평가에 적합합니다. 이 프로토콜은 스펙트럼 비율 FRET 사용으로 MAM 형성의 밀도를 측정하는 방법을 설명합니다.

서론

미토콘드리아 관련 소포체 접촉체(MERCs)는 미토콘드리아 관련 소포체 막(MAMs)으로 생화학적으로 분리되며, 알츠하이머병(AD)을 포함한 여러 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다. 최근 제안된 'MAM 가설'은 MAM이 아밀로이드 β(Aβ) 생성에 중심적 역할을 하며, 이로 인해 AD의 병원성 연쇄 반응을 시작한다고 제안합니다. 이 연쇄 반응에는 신경섬유 얽힘(NFT), 칼슘 상상이상 형성, 신경염증2가 포함됩니다. MAM은 소포체와 외미토콘드리아막(OMM)에 콜레스테롤이 풍부한 지질 뗏목 같은 미세도메인으로 구성되며, 구조적 및 기능적 다양성에 기여하는 특정 결합 단백질로 연결되어 있습니다. ER-미토콘드리아 접촉의 안정화는 ER 칼슘 신호 전달과 세포자사멸사(apoptosis) 등 다양한 세포 과정에 영향을 미칩니다. 미토콘드리아의 5%-20%가 소포체와 물리적 접촉을 하여 MAMs6을 형성하는 것으로 추정됩니다. 여러 연구에서 MAM 부위의 소포체와 미토콘드리아 사이의 개수, 길이, 간격(두께)이 이들의 기능적 역할을 결정하는 중요한 요인임을 밝혔습니다. 냉동 전자현미경과 생체 내 마우스 간 분석 결과, 간세포의 대사 상태가 MAMs7의 두께(14nm에서 20nm 범위)와 길이(145nm에서 270nm)를 모두 조절한다는 것이 밝혀졌습니다.

MAMs는 암과 대사 장애를 포함한 다양한 질환의 잠재적 치료 표적으로 부상하고 있습니다. MAM 두께 또는 간격 폭은 세포 생존을 조절합니다. 구성 MAM 안정제인 MAM 1X와 MAM 9X는 각각 타이트(6 nm ± 1 nm 간격)와 느슨한 MAM(24 nm ± 3 nm 간격)을 안정화하도록 설계되었으며, 이는 새로운 3D AD신경 배양 모델에서 타이트한 MAM의 안정화가 Aβ 생성을 획기적으로 증가시킨다는 것을 입증했습니다. 반면, 느슨한 MAM의 안정화는 효과가없었다. 따라서 조화된 MAM의 안정화를 느슨한 MAM으로 전환하는 것은 아밀로이드 병리를 낮추는 데 도움이 될 수 있습니다. 구조적·기능적 복잡성과 MAM 안정화 정도에 대한 정확한 정량 분석 부족으로 인해 신약 개발을 위한 MAM의 표적 지정이 어렵습니다. 소체에 결합된 미토콘드리아의 축삭 속도에 대한 새로운 생세포 영상 및 키모그래피 기반 분석은 소포체에 더 밀착될 경우 미토콘드리아 축삭 속도가 MAM 안정화를 정량적으로 측정하는 지표로 사용될 수 있음을 보여주었는데, 이는 소포체와의 더 밀접한 접촉이 자유 미토콘드리아에 비해 미토콘드리아 축삭 속도를 현저히 감소시켰기 때문입니다. hAPP 발현 신경 2A(N2AAPP) 세포에서 MAM의 유도 안정제를 사용해8, MAM 간격 폭을 좁히면 Aβ 생성이 선량 의존적으로 증가한다는 것을 발견했습니다8. 유도성 MAM 안정제는 CFP(청색 형광 단백질) 에피토프 표지 ER 표적 및 YFP(노란 형광 단백질)-에피토프 표지 미토콘드리아 표적 생물센서를 암호화하는 발현 플라스미드로, 라파마이신 유도 FK506 라파마이신 결합(FRB) 또는 12-kDa FK506 결합 단백질(FKBP) 도메인과 융합합니다. 바이오센서는 각각 ER-CFP와 미토-YFP로 명명되었습니다. CFP는 수용체 형광체 YFP가 >10 nm 떨어져 있을 때 에너지를 전달하는 공여 형광체입니다. 유도성 바이오센서를 발현하는 세포(N2AAPP)는 라파마이신8 처리 후 Aβ 생성을 증가시켰으며, MAM의 조밀화가 Aβ 생성을 증가시킨다는 것을 시사합니다. 이 방법들은 MAM의 소분자 조절자와 그 유효 농도를 스크리닝하는 데 유용할 것입니다. 이는 병원성 MAM을 치료적("Aβ 증가")으로 전환하면서도 ER과 미토콘드리아 접촉을 완전히 불안정하게 하지 않고, 세포 생존에 중요한 최적의 조밀 MAM의 안정화를 달성하는 데 도움이 될 것입니다.

실험모델
이 연구는 APP751 (N2AAPP)을 구성적으로 발현하는 Neuro2A(N2A) 세포를 사용하였습니다. 이 세포들은 순진한 N2A 세포와 비교해 조건 배지(CM)에 검출 가능한 Aβ 수치를 방출합니다. N2AAPP 세포는 DMEM에서 유지되었으며, 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타메이트에 200 μg/mL G418을 보조하여 보조하였으며, 앞서 설명한 대로10.

발현 플라스미드
포유류 A-키나제 앵커 단백질 1 의 YFP(노란 형광 단백질) 표지 미토콘드리아 표적 서열(AKAP1(34-63)과 포스 파티딜리노시톨-3-포스파타제 Sac1 인산효소의 CFP(청록색 형광 단백질) 표적 ER 표적 서열(Sac1(521-587)과 EGRGSLLTCGDVEENPGP 펩타이드 서열을 암호화하는 자기 절단 서열인 Tav2A 서열(pYFP-AKAP1-Tav2A-Sac1-CFP8)을 융합하여 발현 플라스미드를 생성했습니다. Tav2A로 융합된 발현 플라스미드는 또한 FK506 라파마이신 결합(FRB) 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(EMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPL HAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNV (K 2095P)DLTQAWDLYYHVFRRISKQ] 또는 12-kDa FK506 결합 단백질(FKBP) 도메인(MGVEKQVIRPGNGPPPGQTVTVHCTGFGKD GDLSQKFFQIGKGAVIKGWDEGVIGMQ IGEVARLRCSSDYAYGGGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 둘러싸여 있습니다. 융합 플라스미드 FRB-YFP-AKAP1(34-63)-Tav2A-Sac1(521-587)-CFP-FKBP, 여기서 MAM-Tav2A로 표기)는 FRB-YFP-AKAP1(34-63)와 Sac1(521-587)-CFP-FKBP의 등몰 발현 수준을 얻기 위해 생성되었습니다. Sac1(521-587)-CFP-FKBP(ER-CFP로 표기)는 기증자 형광체이며, Mito-YFP-FRB는 ~10 nm8 간격으로 분리될 때 FRET를 생성하는 수용체 형광체입니다. 따라서 FRET 기반 바이오센서는 6-10 nm 간격의 좁은 MAM을 감지합니다. FRB와 FKBP는 라파마이신 첨가 시 MAM 갭 폭이 용량 의존적으로 조여지도록 유도하기 위해 도입되었으며, 이는 증가된 FRET 신호8을 측정하여 정량화할 수 있습니다.

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프로토콜

이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 변환

  1. MAM-Tav2A 발현 플라스미드를 가진 N2AAPP 세포 형질전환(14-18시간).
    1. 시작 전에 6웰 플레이트 중 유리 커버슬립을 포함해 1× 10개의6 N2AAPP세포를 배지 내에 유지하고 12-16시간 동안 세포를 배지 내에 유지합니다.
    2. 제조사 프로토콜에 따라 리포펙타민 형질전환 시약을 사용한 MAM-Tav2A 플라스미드 트랜스펙트 1-3 μg MAM-Tav2A 플라스미드 (보충 파일 1).
    3. 12-16시간 후 약물 치료를 시행하세요.
      참고: FRET 배경으로 사용할 세포는 항상 기증자(ER-CFP) 또는 수용체(Mito-YFP)만 암호화하는 발현 플라스미드를 포함해 트랜스펙션되어야 합니다.

2. 약물 치료

  1. MAM-Tav2A 발현 N2AAPP 세포를 라파마이신(Rapa) 또는 라팔로그(Log)로 처리합니다(3-6시간).
    1. 처리 전에 라파와 로그 용액(10 mM) 스톡 용액을 준비하세요.
    2. 0 nM, 100 nM 또는 250 nM 라파 또는 로그 등 새로운 배지로 교환하세요.
    3. 3시간 치료 후에는 세포를 고정하기 위해 3.3% 파라포름알데히드(PFA)를 첨가하세요.
    4. 형광 공초점 현미경 슬라이드를 준비하려면 안티페이드 시약 한 방울을 떨어뜨립니다.
    5. 커버슬립을 물방울 위에 걸고 겸자로 부드럽게 누르세요.
      참고: 유리 커버슬립은 깨지기 쉬워 주의가 필요합니다. 유리 커버슬립 대신 유리 바닥판을 사용하세요. 유리 바닥판을 사용할 때의 주요 단점은 안티페이드 시약을 사용할 수 없어 형광체의 표백으로 인해 영상이 어렵다는 점입니다. DAPI(4′,6-디아미디노-2-페닐린돌)가 포함된 안티페이드 시약은 사용하지 마세요. 그 청색 형광이 CFP와 YFP 사이의 FRET에 간섭할 수 있기 때문입니다.

3. 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 위한 정초점 현미경

  1. 슬라이드를 역현미경 아래에 놓고 현미경의 초점을 조절하여 세포가 보이게 됩니다.
  2. 440nm 레이저로 형광체를 여기시키고, 공여 CFP(FKBP-CFP-ER)는 468-503nm 방출, YFP는 수용체(FRB-YFP-MITO)는 525-565nm 방출로 이미지를 포착합니다.
  3. 내장 형광 필터를 사용해 신호 세기를 조절하여 배경 신호가 사라질 때까지 조절하세요(거의 검은색이어야 합니다).
    참고: NIS Element AR 소프트웨어를 사용해 형광 이미지를 캡처하기 위해 공초점 현미경을 사용했습니다. 60배 배율로 512픽셀 해상도로 사용되었습니다.
  4. 이미지를 .nds 파일로 저장하세요.
  5. 스펙트럼 비율 FRET 분석을 수행하세요.

4. 비뇨 FRET 분석 (6 - 12시간)

참고: 공초점 현미경을 사용하여 공공 초점 현미경을 사용하여 공여 기관 ER-CFP(468-503 nm)와 수용체 Mito-YFP(525-565 nm)에서 방출되는 형광 방출을 검출했습니다. ImageJ 소프트웨어를 사용해 배경 감산 후 평균 픽셀 형광 강도를 정량화했습니다. YFP와 CFP 방출 강도의 비율을 계산하여 스펙트럼 FRET 분석의 표시값으로 사용했습니다.

  1. 오픈 이미지 J (피지).
  2. .nds 파일을 이미지 J로 드래그하거나, 파일 -> 열기 버튼을 누르고 이미지를 선택하세요.
  3. 다음 화면에서 분할 채널 박스를 선택하세요.
  4. C = 0 패널을 클릭하세요.
  5. 분석 -> 측정을 클릭하세요.
    참고: 나중에 계산할 수 있도록 평균값을 적어두세요.
  6. 프로세스 클릭 -> 수학 -> 빼기.
  7. 여기서 평균 값이 등장합니다.
  8. C = 1 패널에 대해 4단계를 반복합니다.
  9. 자유손 선택 도구를 클릭하세요.
  10. 관심 있는 셀을 동그라미 치고 Ctrl+T 를 눌러 ROI에 기록하세요.
  11. ROI 하단의 ' 모두 보기 '를 클릭하면 이미 선택한 항목을 확인할 수 있습니다.
  12. 선택한 모든 셀을 선택하고 측정을 클릭해 이 값을 엑셀에 기록하세요.
  13. C = 1 패널을 클릭하고 모두 보기를 클릭하세요.
  14. 모든 셀을 선택하고 다시 측정을 클릭 한 뒤, 이 값들을 엑셀의 별도의 열에 기록하세요.
  15. 엑셀에서 기증자 신호의 값을 수신자 위에 표시하는 함수(C0/C1)를 생성합니다. 이것이 바로 FRET 비율입니다.

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결과

FACS에 의해 풍부한 N2AAPP 세포가 MAM-Tav2A를 발현한 Ratiometric FRET 분석은 라파마이신 치료 후 Aβ40 수치가 용량 의존적으로 증가하는 것으로 나타났습니다. 라파마이신은 포유류의 라파마이신 표적(mTOR) 신호 전달 경로를 억제하여 작용하여, 미세아교세포 내 TREM2(골수세포 발현 2호 유발 수용체) 발현을 하향 조절하여 알츠하이머병 5XFAD 마우스 모델에서 Aβ 플라크 제거 감소를 초래합니다11. 라파마이신 유사체 AP21967, 일반적으로 라팔로그(로그)라고 불리며, mTOR에 대한 친화도가 낮아 세포에 상대적으로 무독성입니다. 그러나 FRB 도메인12에 보상성 공동형성 돌연변이(K2095P)가 도입됨에 따라 라파마이신과 동일...

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토론

MAMs의 조절은 암, 대사 장애, 신경퇴행성 질환 등 다양한 질환에 잠재적 영향을 미칠 수 있는 신흥 연구 분야입니다. 다이닌길항제인 LDC-3/다이나레스틴, 항당뇨제인 메트포르민, 항암제인 설포라판 등 많은 약리학적 약물들이 MAMs를 교란시키며, 현재 암 및 대사 질환에 대한 전임상 및 임상시험이 진행 중입니다. 이 약리학적 제제들은 PTPIP51, VAPB, VDAC1, PACS2, MFN2, VDAC1, IP3R3 14,15,16,17,18,19,20과 같은 MAM 테더 단백질 간의 상호작용을 조절하여 ER-미토콘드리아 접촉 또는 MAM 접촉 폭을 조절합니다.

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감사의 글

매사추세츠 종합병원(MGH) 교수인 루돌프 E. 탄지 박사께서 원고에 대한 통찰력 있는 의견을 진심으로 감사드립니다. FLIM 분석법에 대한 전문 지식을 공유해 주신 MGH 조교수인 마사토 마에사코 박사께 감사드립니다. 필라델피아 토머스 제퍼슨 대학교 교수인 Gyorgy Hajnoczky 박사께서 ER-CFP 또는 Mito-YFP를 암호화하는 발현 플라스미드를 아낌없이 제공해 주셔서 감사드립니다. 이 연구는 Cure Alzheimer's Fund의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BSAFisher Scientific501781532
Confocal microscope Olympus FV3000RS (Tokyo, Japan)N/A
DMEM with GlutaMAX supplementGibco/Thermo Fisher Scientific10564011
EDTA  Life Technologies41116134
Falcon 6 Well Plates VWR International41122107
GAPDH Polyclonal AntibodyThermo Fisher ScientificPA1-988
Gelatin VWR International9000-70-8
Geneticin (G418 Sulfate)Gibco/Thermo Fisher Scientific10131035
GFP monoclonal AntibodyInvitrogenMA5-15256
Graphpad Prism N/APrism 9, version 9.5.0N/A
HeparinSigma-Aldrich H0200000
ImageJ Software ImageJ 1.53aN/A
Inverted confocal microscope Nikon (C2 Eclipse Ti2)N/A
Lipofectamine2000Invitrogen11668027
MS Excel  Microsoft Excel, version 2302N/A
NaCl  Fisher Scientific7647145
NuPAGE 4–12% Bis-Tris gel  InvitrogenNP0321BOX
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Tris-HCL, pH 7.6  Boston BioProducts42000000
Triton X-100  Sigma-AldrichT8787
Trypsin-EDTAGibco/Thermo Fisher Scientific25200056
Tween 20Fisher Scientific501657287

참고문헌

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