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방법 논문

Development of human renal tubular epithelial cell primary cultures in monolayers and three-dimensional conditions(단층 및 3차원 조건에서의 인간 신장 세뇨관 상피 세포 1차 배양 개발)

905 조회수

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DOI:

10.3791/67920

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2025년 6월 13일

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1Laboratorio de Fisiología Renal, Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Buenos Aires (UBA), 2Instituto de Fisiología y Biofísica Bernardo Houssay (IFIBIO Houssay), Universidad de Buenos Aires – Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET), 3Servicio de Nefrología, Hospital General de Niños Pedro de Elizalde, 4Laboratorio de Fisiopatogenia, Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

이 논문에서

요약

여기에서는 신장 피질에서 인간 신장 세뇨관 상피 세포(HRTEC)의 1차 배양을 얻어 세포외 기질(3D-HRTEC)에서 단층 및 3차원 배양을 개발하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

인간 신장 세뇨관 상피 세포(HRTEC) 1차 배양은 아르헨티나 부에노스아이레스에 있는 Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde의 소아 신장내과 병동에서 지시한 신장 절제술을 받는 소아 환자의 신장에서 제거한 신장에서 분리합니다. 거시적으로 정상적인 신장 피질은 신장 수질에서 절개되어 조각으로 절단됩니다. 그런 다음 피질 단편을 0.1% 콜라겐분해효소 유형 1이 보충된 행크 용액에서 소화하고 70μm 공극 크기의 메쉬를 통해 여과하여 사구체에서 신장 세뇨관을 분리합니다. 신세뇨관은 상피 세포를 분리하기 위해 콜라겐 분해 효소로 두 번째 소화를 거칩니다. 마지막으로, 효소 분해가 중단되고 상피 세포가 합류할 때까지 37°C에서 5% CO2미만의 보충제와 함께 RPMI 1640을 함유한 플라스크에서 성장합니다. HRTEC 세포는 96웰 플레이트에서 단층으로 성장하거나, 24웰 플레이트로 유리 커버슬립으로 성장하거나, 콜라겐으로 코팅된 세포 배양 홀더로 성장할 수 있습니다. 또한 기저막(BM) 매트릭스에 파종된 HRTEC 세포에서 3차원 인간 신장세뇨관 상피 세포(3D-HRTEC) 배양을 얻습니다. 세포 응집과 관 모양 구조의 형성이 모니터링됩니다. 당사는 수년 동안 HRTEC 1차 배양을 사용하여 소아 신장에서 시가 독소로 인한 세포 독성 작용을 연구해 왔으며, 이는 용혈성 요독 증후군(HUS)을 초래하는 병태 생리학적 변화를 유발합니다. HRTEC 및 3D-HRTEC 배양은 다양한 독소, 합성 약물, 생물학적 요인, 호르몬 등이 특히 인간 신장 근위세뇨관 상피에 미치는 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

우리 그룹에서는 단층 및 3차원(3D-HRTEC) 조건에서 개발된 인간 신세뇨관 상피 세포(HRTEC)의 1차 배양을 사용하여 소아 신장에서 시가 독소 생성 대장균 (STEC)에 의한 위장관 감염 후 발생하는 시가 독소 2형(Stx2)의 세포 독성 작용을 연구했습니다.

Stx1 및 Stx2(Stxs)는 설사 후 용혈성 요독 증후군(HUS)을 유발할 수 있는 STEC의 주요 독성 인자입니다1. HUS는 STEC에 감염된 소아의 약 5-10%에 영향을 미치는 전신 합병증으로, 용혈성 빈혈, 혈소판 감소증, 소아 급성 신장 손상(AKI)으로 구성되어 지지 치료가 필요합니다2. 아르헨티나에서 STEC-HUS는 5세 미만 아동 100,000명당 연간 6.52명의 발병률(전 세계에서 가장 높음)을 기록하는 풍토병으로, 급성 신장 손상의 주요 원인중 하나입니다 3. 사망률은 4% 미만이지만3 환자의 약 50%가 신장 후유증을 앓고 있으며, 이는 미국에서 두 번째로 빈번한 신장 이식 원인입니다 4,5.

Stx2는 내재화되어 세포독성 작용을 발휘하기 전에 표적 기관의 세포 표면에 발현되는 당지질 글로보트리아오실세라마이드(Gb3) 수용체에 특이적으로 결합합니다6. 신장은 신장 상피 세포와 내피 세포에서 다량의 생물학적 활성 Gb3 수용체를 발현하는 Stx에 민감한 세포의 존재로 인해 Stxs에 의해 손상된 주요 기관입니다 7,8.

단층으로 배양된 HRTEC에서 수행된 이전 연구에서는 Stx2가 단백질 합성을 억제하고 세포 생존력 및 세포 증식을 감소시키며 세포사멸 및 괴사를 유도하는 것으로 나타났습니다 9,10,11,12. 또한, 3D-HRTEC을 Stx2에 노출시키면 세포 이동과 신장 근위세뇨관의 특성을 가진 세뇨관 구조의 발달이 억제되었습니다12,13.

HRTEC 및 3D-HRTEC 배양의 1차 배양은 또한 세포주기14의 S기에서 세포의 DNA에 5-브로모-2-데옥시우리딘(BrdU)의 통합을 측정하여 세포 증식에 대한 에스트라디올의 효과를 평가하는 데 사용되었습니다.

상피 세포를 분리하기 위해 우리는 비뇨기과 질환 교정을 위해 표시된 소아 신장 절제술에서 얻은 신장 조각에서 시작합니다.

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프로토콜

Pedro de Elizalde 병원 윤리 위원회는 연구 목적의 1차 세포 배양 개발을 위해 인간 신장 조직의 사용을 승인했습니다. 연구를 위한 신장 샘플 사용에 대해 어린이를 대신하여 가장 가까운 친척 또는 보호자의 서면 동의서를 받았습니다.

참고: 인간 신세뇨관 상피 세포(HRTEC)의 1차 배양은 아르헨티나 부에노스아이레스의 Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde에서 비뇨기과 질환 또는 종양 절제술을 위해 신장 절제술을 받는 소아 환자에서 유래합니다.

1. 인간 신세뇨관 상피세포의 1차 배양물 개발(HRTEC)

참고: 피질 신장 조각은 병원에서 신장 절제술을 받는 소아 환자의 신장에서 절제합니다. HRTEC의 1차 배양은 앞서 설명한 방법에 따라 수행한다11.

프로토콜은 다음 단계에 설명되어 있습니다.

  1. 신장 조각은 실험실에서 처리될 때까지 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 행크스 균형 소금 용액(Hanks)에 넣어 냉장 보관하십시오.
  2. 집게로 신낭을 절개합니다. 수질에서 신장 피질을 분리하고 약 1mm의 작은 조각으로 자릅니다.
  3. 소화를 수행하려면 신장 조각을 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 멸균 행크스 용액에 넣고 0.1% 콜라겐분해효소 I형을 보충합니다.
    1. 신장 단편을 37°C에서 30분 동안 흔들면서 배양합니다.
  4. 소화를 멈추려면 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유한 PBS 1부피를 첨가하고 4°C에서 냉장 원심분리기에서 160×g에서 각각 10 분 동안 원 심분리하여 샘플을 3회 세척합니다. 각 원심분리에서 상등액을 버리고 펠릿을 동일한 용액에 재현탁합니다.
  5. 70μm 공극 그물망을 통해 분해 산물을 통과시켜 세뇨관을 여과하고 필터에 남아 있는 사구체를 버립니다.
  6. 여과된 세뇨관을 4°C에서 160× 10 분 동안 원 심분리하고, 상층액을 버리고, 0.2% 콜라겐분해효소 I형이 보충된 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 멸균 행크스 용액에 펠릿을 재현탁합니다.
    1. 진탕과 함께 37°C에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.
  7. 소화를 멈추려면 10% 소 태아 혈청(FBS)이 함유된 PBS 1부피를 첨가하십시오.
    1. 4°C에서 냉장 보관된 원심분리기에서 160× g씩 각각 10분씩 원심분리하여 샘플을 세 번 세척합니다. 각 원심분리에서 상등액을 버리고 펠릿을 동일한 용액에 재현탁합니다.
  8. 마지막 원심분리 후, 세포 펠렛을 5mL의 완전 배양 배지(5% FBS, L-글루타민[2mmol/L], 페니실린[100U/mL], 스트렙토마이신[100μg/mL] 및 내피 세포 성장 보충제[ECGS, 1%])로 보충합니다.
    1. 통풍구 뚜껑이 있는 25cm2 배양 플라스크에 세포 현탁액을 파종합니다.
    2. 습한 분위기에서 37 ° C와 5 % CO2에서 세포를 배양하십시오.
  9. 다음날 세포 배양을 3회 세척하고 플라스크에서 액체를 버리고 PBS를 각각 5mL씩 첨가하고 플라스크에 5mL의 완전 배양 배지를 추가합니다. 이러한 세척은 완전히 소화되지 않고 배양 플라스크에 부착되지 않은 적혈구와 관형 조각을 제거합니다.
  10. 세포 배양 인큐베이터에서 상피 세포를 37°C에서 배양하여 단층에서 성장하여 합류할 수 있도록 합니다.
  11. 3일마다 새로운 완전 배양 배지로 배지를 교체하고 도립 현미경으로 매일 세포 배양을 관찰합니다.

2. 3차원 HRTEC 배양 개발(3D-HRTEC)

참고: 이 섹션에서는 3차원 배양(3D-HRTEC)을 개발하는 단계를 제공합니다. 3D-HRTEC 배양은 앞서설명한 방법 12에 따라 수행된다.

  1. Engelbreth-Holm-Swarm 쥐 육종의 BM 매트릭스를 사용합니다. 이 BM 매트릭스는 동결된 상태로 배송되며 이 상태에서는 견고하게 유지됩니다. BM 매트릭스 용액을 제조업체에서 표시한 대로 4°C의 냉장고에 있는 얼음 수조에서 밤새 해동합니다.
  2. BM 매트릭스를 놓기 전에 냉동실의 팁을 식히고 멀티 웰 플레이트를 얼음 위에 두어 프로세스 중 매트릭스가 응고되는 것을 방지하십시오.
  3. 액체 BM 매트릭스(150mL/cm2)의 분취액을 취하여 플레이트의 각 웰에 넣어 웰 바닥을 덮습니다. 37°C의 세포 배양기에서 플레이트를 1시간 동안 배양하여 BM 매트릭스를 겔 상태로 전환합니다.
  4. 한편, HRTEC 1차 배양액이 합류하는 것을 분리하려면 플라스크에서 배양 배지를 버리고 0.25% 트립신 1mL와 0.02% EDTA 용액 1mL를 추가합니다.
    1. 플라스크의 전체 표면에 액체를 펴고 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
    2. 도립 현미경으로 모든 세포가 분리되었는지 관찰합니다.
  5. 10mL의 배양 배지 또는 PBS에 세포를 재현탁시키고 15mL 튜브에 전달한 다음 4°C에서 10분 동안 160× g 으로 원심분리합니다.
    1. 상등액을 버리고 HRTEC 1차 배양에 사용된 것과 동일한 보충제를 함유한 완전한 배양 배지에 세포 펠렛을 재현탁합니다.
    2. Neubauer 챔버에 있는 세포의 수를 세어 보십시오.
  6. 웰당 4개 ×10개 4개 셀/150μL를 BM 매트릭스에 시딩합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C의 습한 분위기와 5 %CO2에서 며칠 동안 세포 배양을 배양합니다.
  7. 2일마다 새로운 배지로 배지를 교체하십시오.
  8. 도립 광학 현미경(inverted optical microscope)에서 세포 응집과 관 모양 구조의 형성을 모니터링합니다.

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결과

Confluent HRTEC 1차 배양은 광학 현미경 검사에서 관찰된 유사한 형태를 보여주었습니다(그림 1). 세포는 아쿠아포린 1(AQP1) 및 PECAM CD31에 대한 항체를 사용하여 이전 간행물에서 설명한 바와 같이 면역형광을 특징으로 했습니다 9,12,13. 면역형광 연구에 따르면 HRTEC의 90% 이상이 AQP1에 양성이었으며, 이는 이들의 기원이 인간 신장 근위세뇨관에 있음을 보여줍니다. 게다가, 내피 항체 PECAM CD319에 대해 양성인 세포는 없었습니다.

그림 2에서 볼 수 있듯이 HRTEC은 인간 신장의 원래 세뇨관과 유사한 세뇨관 구조(세뇨관...

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토론

1차 배양은 신장 절제술 당일에 시행해야 합니다. HRTEC 1차 배양은 세포의 형태 유전학적 안정성을 보장하기 위해 1-5개의 계대 사이에 사용할 수 있습니다. 다섯 번째 통로 후 세포는 형태를 바꾸기 시작하여 섬유아세포와 같은 모양을 보이거나 액포가 증가하며 정지 상태가 될 수 있습니다.

더 큰 신장 조각을 사용하면 소화 후 세포 용해에 의해 방출되는 DNA가 세척 과정을 방해할 수 있습니다. 이 경우 더 많은 양의 소화 및 세척 용액을 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 0.04% DNase IV도 소화액6에 첨가할 수 있습니다.

HRTEC의 1차 배양은 이전에 AQP1에 대한 면역형광으로 특성화되었으며, 이는 세포의 90% 이상이 AQP1에 대해 양성임을 입증했으며, 이는 HRTEC 1차 배양이 신장 근위세뇨관 기원을 가지고...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

아르헨티나 부에노스아이레스에 위치한 "Sección de Cirugía Pediátrica, Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde"의 소아 비뇨기과 팀에게 신장 샘플을 제공해 주신 데 감사드립니다. 이 연구는 부에노스아이레스 대학(UBACYT20020190100072BA)의 C. Silberstein과 National Scientific and Technical Research Council(CONICET: PUE 0041)의 C Ibarra 및 C Silberstein에 대한 보조금의 지원을 받았습니다. 이 작업은 CYTED(Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo)의 일부 지원을 받았습니다(Red STEC/SUH Nº 224RT0152를 통해).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
콜라게나제 유형 ISigma Merck, 미국 미주리주 세인트루이스637958
내피 세포 성장 보충제Sigma Merck, 미국 미주리주 세인트루이스E2759
Matrigel 기저막 매트릭스BD 바이오사이언스, 미국; Sigma Merck, 미국 미주리주 세인트루이스356234
70 & 무; M 기공 메쉬 필터BD Bioscience, 매사추세츠, 미국css010070
L-글루타민 가 함유된 RPMI 1640 배지;Sigma Merck, 미국 미주리주 세인트루이스R8758-500ml
행크스' 균형 잡힌 소금 용액  Ca2+ 및 Mg2+ 무함유Gibco Invitrogen, 뉴욕, 미국14175046
트립신-EDTA 용액Sigma Merck, 미국 미주리주 세인트루이스T4049

참고문헌

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  2. Gianantonio, C. A., Vitacco, M., Mendilaharzu, F., Gallo, G. E., Sojo, E. T. The hemolytic-uremic syndrome. Nephron. 11 (2), 174-192 (1973).
  3. Alconcher, L. F., et al. Hemolytic uremic syndrome associated with Shiga toxin-producing Escherichia coli infection in Argentina: update of serotypes and genotypes and their relationship with severity of the disease. Pediatr Nephrol. 36 (9), 2811-2817 (2021).
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  10. Silberstein, C., Pistone Creydt, V., Gerhardt, E., Nuñez, P., Ibarra, C. Inhibition of water absorption in human proximal tubular epithelial cells in response to Shiga toxin-2. Pediatr Nephrol. 23, 1981-1990 (2008).
  11. Márquez, L. B., et al. Effects of Escherichia coli subtilase cytotoxin and Shiga toxin 2 on primary cultures of human renal tubular epithelial cells. PLoS One. 9, e87022(2014).
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  15. Fernandez Miyakawa, M., Zabal, O., Silberstein, C. Clostridium perfringens epsilon toxin is cytotoxic for human renal tubular epithelial cells. Hum Exp Toxicol. 30, 275-282 (2011).
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  17. Chen, J., et al. Copper toxicity in the liver of broiler chicken: insights from metabolomics and AMPK-mTOR mediated autophagy perspective. Poult Sci. 103 (9), 104011(2024).
  18. Zhang, T., et al. Role of Caveolin-1 on the molybdenum and cadmium exposure induces pulmonary ferroptosis and fibrosis in the sheep. Environ Pollut. 334, 122207(2023).
  19. Fujiki, K., et al. Blockage of Akt activation suppresses cadmium-induced renal tubular cellular damages through aggrephagy in HK-2 cells. Sci Rep. 14, 14552(2024).
  20. Joun, J. I. H., et al. Antioxidative effects of molybdenum and its association with reduced prevalence of hyperuricemia in the adult population. PLoS One. 19 (8), e0306025(2024).

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