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방법 논문

확장 현미경 검사법에 의한 Proteus mirabilis 생물막의 초고해상도 이미징

1.4K 조회수

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DOI:

10.3791/67932

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2025년 7월 18일

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1Laboratory for Scientific Image Analysis SCIAN-Lab, Integrative Biology Program, Centro de Informática Médica y Telemedicina CIMT, Institute of Biomedical Sciences ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile, 2Biomedical Neuroscience Institute BNI, 3Advanced Center for Chronic Diseases ACCDiS, 4Laboratorio de Biofilms Microbianos, Departamento de Microbiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 5Red de Equipamiento Científico Avanzado REDECA, Institute of Biomedical Sciences ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile, 6National Center for Health Information Systems CENS, 7Centro de Modelamiento Matemático, Universidad de Chile

이 논문에서

요약

이 논문은 Proteus mirabilis 생물막을 위해 특별히 설계된 확장 현미경 기술인 PmbExM에 대한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. PmbExM은 생물막 샘플의 단계적 효소 처리를 활용하여 등방성, 4.3배 팽창을 달성함으로써 이러한 고착 미생물 군집 내 세포 및 세포 내 구조의 공간 조직에 대한 초해상도 분석을 가능하게 합니다.

초록

기존의 광학 현미경을 사용하여 미생물 샘플의 자세한 시각 정보와 정량적 데이터에 액세스하는 것은 회절 장벽에 의해 제한됩니다. 해상도를 향상시키는 한 가지 솔루션은 샘플을 원래 크기의 약 4배까지 물리적으로 확대하는 혁신적이고 비용 효율적인 초해상도 기술인 확장 현미경(ExM)입니다. 성공적인 확장을 위해서는 생물학적 물질의 기계적 특성을 균질화하는 것이 필수적입니다. 생물막은 박테리아 군집으로, 표면에 부착되어 그들이 생산하는 세포 외 기질에 내장되어 있습니다. 그들은 ExM 프로토콜이 고유한 구조적 구성 요소를 수용할 수 있도록 조정되어야 합니다. 이 기사에서는 48시간 동안 성장한 P. mirabilis 생물막의 초해상도 시각화를 가능하게 하는 ExM의 특수 변형인 Proteus mirabilis 생물막 ExM(PmbExM)을 제시합니다. 이 프로토콜은 이론적 조건에 가깝게 최적화된 연속 효소 분해를 통해 샘플의 주요 구조 성분을 표적화하여 분해하는 데 중점을 둡니다. PmbExM은 다당류 가수분해를 위해 α-아밀라아제, 셀룰라아제 및 리티카제 배당체-가수분해효소를 포함한 효소의 조합을 사용합니다. 펩티도글리칸 가수분해를 위한 뮤탄올리신; 단백질 가수분해를 위한 proteinase K. 이러한 분해 절차는 겔화 공정과 독립적이므로 다양한 생물막 모델에서 특정 균질화 요구 사항을 충족하도록 수정할 수 있습니다. 이러한 적응성은 다양한 박테리아 종 및 성장 조건에 적용할 수 있는 큰 잠재력을 제공합니다. ExM은 전반적으로 차선의 팽창 계수를 가진 다양한 생물막 종에 적용되었습니다. 대조적으로, PmbExM은 형태 또는 토폴로지의 심각한 왜곡 없이 표준 아크릴아미드-아크릴레이트 ExM 하이드로겔의 이론적 최대 팽창 계수를 달성합니다. 이 연구의 목적은 P. mirabilis 생물막의 구조, 조립, 세포 및 세포 내 기능을 시각화하기 위한 접근 가능한 초해상도 프로토콜을 제공하는 것입니다.

서론

형광 현미경 검사는 생물막 구조, 구성 및 기능1을 연구하는 데 널리 사용되는 도구입니다. 그러나 생물막의 구조적, 세포적, 세포적 특성을 해결하는 광학 현미경의 능력은 회절 장벽에 의해 제한됩니다. 팽창 현미경(ExM)은 혁신적이고 접근하기 쉬우며 사용하기 쉬운 초고해상도 기술로, 회절 한계 2,3을 넘어 생물막 구조를 밝힐 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. ExM은 생물학적 표본을 원래 크기의 약 4배로 등방성으로 확장하여 해상도를 향상시킵니다. 이 방법은 시료 전체에 걸쳐 팽창성 이온 하이드로겔의 현장 중합을 포함하며 주의해서 적용할 때 분자 표적의 상대적인 공간 배열을 보존합니다 4,5.

ExM이 제대로 작동하려면 생물학적 물질의 기계적 특성을 균질화하는 것이 중요한6단계입니다. 표준 ExM 변이체는 포유류 세포 배양 및 조직에서 개발되었으며, proteinase K 단백질 분해 4,5 또는 세제 및 오토클레이빙7을 사용한 연질 단백질 변성을 통해서만 효율적으로 균질화를 달성하여 등방성 4배 팽창을 생성했습니다. 그러나 박테리아 및 박테리아 생물막의 경우 펩티도글리칸 세포벽과 구조적 다당류와 같은 EPS 매트릭스 요소는 팽창을 방해하는 장애물입니다 2,3,8,9.

이 논문은 높은 항생제 내성 및 카테터 관련 요로 감염과 관련된 임상적으로 관련된 그람 음성 간균인 P. mirabilis의 생물막을 확장하도록 설계된 맞춤형 ExM 변형인 Proteus mirabilis 생물막 확장 현미경(PmbExM)의 절차를 설명합니다10. PmbExM은 펩티도글리칸 세포벽, 다당류 및 단백질을 각각 가수분해하기 위해 뮤α올리신, -아밀라아제, 셀룰라아제, 리티카제 및 단백질분해효소 K 효소 처리의 조합을 사용합니다. 결과는 이 방법이 48시간 된 P. mirabilis 생물막의 4.3배 등방성 팽창을 달성한다는 것을 보여줍니다. 이 기술은 이중 염색3을 통해 P. mirabilis 생물막 구조, 조립 및 세포 내 특징의 초해상도 시각화를 가능하게 합니다. 또한 PmbExM은 종 특이적 생물막 구성 요소를 표적으로 하도록 효소 처리를 조정하여 다른 생물막 모델에 적용할 수 있습니다.

이 기사의 목적은 PmbExM에 대한 생물막 샘플의 겔화, 분해, 확장 및 장착과 관련된 절차에 대한 자세한 설명을 제공하는 것입니다. 또한 이 연구는 저자가 사용한 박테리아 성장 조건, 샘플 형식 및 형광 염색 기술과 함께 이미지 처리 경험이 부족한 연구자가 쉽게 적용할 수 있는 데이터 처리 및 분석 루틴을 간략하게 설명합니다. 이미지 처리 및 분석에 대한 보다 포괄적이고 심층적인 가이드는 Castagnini, D. et al.3을 참조하십시오.

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프로토콜

PmbExM의 전체 프로세스는 그림 1에 요약되어 있습니다. 이 작업에 사용된 모든 명명된 용액(즉, 단량체 용액, proteinase K 분해 용액 등)의 조성을 찾기 위해 보충 파일 1 을 참조하십시오. 마찬가지로, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4 를 참조하여 이미지 처리 경험이 많지 않은 연구자도 사용할 수 있는 간소화된 데이터 처리 및 분석 루틴을 제공합니다. 프로토콜은 2.5-3 주에 걸쳐 편안하게 수행 할 수 있습니다 : 첫 번째 주에는 커버 슬립 세척 및 살균, 생물막 성장 및 샘플 고정에 전념합니다. 두 번째 주는 샘플 염색 및 PmbExM 프로토콜 자체에 대한 연구이고, 세 번째 주에는 시료 장착 및 이미지 획득에 대한 연구입니다. 또한 필요한 재료 및 용액에 대한 1주일의 사전 준비를 고려하십시오. 이 연구에 사용된 시약, 재료, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

figure-protocol-1
그림 1: P. mirabilis 생물막의 성공적인 확장, 관찰 및 분석을 위한 PmbExM 프로토콜의 앵커링, 중합, 분해 및 투석. 왼쪽 열은 확장 프로토콜 동안 선택한 단계에서 샘플의 6개 상태를 식별합니다. 고정, 투과성 및 염색된 생물막 샘플에서 시작하여 최종 겔화 및 팽창 상태까지 4가지 중간 상태를 따라 초고해상도에 대한 현미경 및 이미지 분석을 준비합니다. 생물막의 EPS 매트릭스는 녹색으로, 박테리아 세포벽은 보라색 선으로, 일반적인 단백질 세포 구조는 회색으로, 아크릴아미드-아크릴레이트 ExM 폴리머는 물결 모양의 파란색 선으로 표시됩니다. 이 과정에 관련된 모든 효소는 Pac-Man 기호로 표시됩니다 : 외다당류 가수 분해를위한 3 개의 배당체 가수 분해 효소 (녹색) : α-아밀라아제, 셀룰라아제 및 리티 아제; Peptidoglycan 세포벽의 분해를 위한 Mutanolysin (보라색); 및 일반적인 단백질 소화를 위한 proteinase K(회색). Pac-Man 기호의 색상은 각 대상 구조와 일치합니다. 낮은 불투명도 또는 파선 테두리로 표시된 모든 개체는 효소 분해 상태를 나타냅니다. 이 그림은 Castagnini, D. et al.3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 생물막 형성을 위한 유리 커버슬립의 세척 및 살균

  1. 초음파로 12mm 유리 커버슬립을 실온에서 20분 동안 1M 수산화나트륨에 넣은 다음 풍부한 탈이온수로 헹굽니다.
  2. 커버슬립을 실온에서 70%(v/v) 에탄올에 15분 동안 초음파로 처리한 다음 95%(v/v) 에탄올로 헹굽니다.
  3. 커버슬립을 실온에서 자연 건조시키십시오.
  4. 오토클레이빙으로 살균하십시오.

2. Proteus mirabilis 생물막 성장

  1. P. mirabilis를 Luria Bertani (LB) 육수 10mL에 넣고 흔들지 않고 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
    참고: 이 연구에서는 상업적으로 이용 가능한 P. mirabilis 유형 균주( 재료 표 참조)를 획득하여 사용했지만 쉽게 구할 수 있는 P. mirabilis 균주를 사용하는 것이 좋습니다.
  2. 배양액에서 1mL를 취하여 신선하고 멸균된 LB 육수 9mL에 첨가하여 1:10 희석의 박테리아 현탁액을 생성합니다.
  3. 1:10 박테리아 현탁액의 600nm에서 광학 밀도(OD)가 0.1인지 확인합니다. 필요한 경우 OD600 = 0.1에 도달할 때까지 소량의 신선한 LB 또는 P. mirabilis 배양을 추가하여 조정합니다.
  4. 12mm 유리 커버슬립(이전에 세척 및 멸균)을 멸균 폴리스티렌 24웰 플레이트(웰당 하나의 커버슬립)에 넣습니다.
    알림: 전체 커버슬립 표면이 웰 바닥에 닿는지 확인하십시오. 생물막은 위쪽을 향하는 커버슬립 측면에 형성됩니다.
  5. 플레이트의 웰에 OD600 = 0.1 박테리아 현탁액 350μL를 파종합니다.
    알림: 플레이트의 내부 웰에만 파종하고 외부 웰(즉, A와 D행, 1열과 6열의 웰)에 멸균수 또는 LB 육수를 채우는 것이 좋습니다. 이는 외부 웰이 내부 웰보다 액체 증발 속도가 더 빠르기 때문에 생물막 성장에 영향을 미치기 때문입니다.
  6. 파종된 플레이트를 인큐베이터 내부에 놓고 45도 경사로 배치합니다.
    참고: 50mL 원심분리기 튜브 또는 마이크로피펫 팁 박스와 같은 일반적인 실험실 재료를 사용하십시오. 기울어진 위치는 P. mirabilis 생물막이 가장 두꺼운 영역을 형성하는 커버슬립 표면에 공기-액체 계면을 형성할 수 있도록 합니다.
  7. 흔들림 없이 37°C에서 48시간 동안 생물막이 형성되도록 합니다.
    참고: 이 생물막 성장 설정은 배지의 증발로 인한 생물막 건조로 인해 48시간 이상의 배양 시간에는 적합하지 않습니다.

3. 생물막 시료 정착 및 보관

  1. 웰에서 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 매우 약한 교반으로 실온에서 5분 동안 300μL 멸균 인산염 완충액 식염수(PBS)로 바이오필름이 함유된 커버슬립을 두 번 부드럽게 세척합니다.
    참고: 배양 또는 세척을 위해 소량을 사용하여 반복적인 유체 교환으로 인한 생물막의 파괴를 피하십시오. 300-400μL의 액체는 24웰 플레이트에 바이오필름을 담가두기에 충분합니다. 느리고 체계적인 피펫팅을 강력히 권장하며, 교환된 용액으로 생물막에 직접 부딪히는 것을 피하는 것이 좋습니다.
  2. PBS를 조심스럽게 제거하고 PBS에 400μL의 4%(w/v) 파라포름알데히드(PFA)로 교체하여 실온에서 20분 동안 생물막 고정을 수행합니다.
  3. PFA를 제거하고 세포 투과화를 위해 300μL의 1% PBST(PBS에서 1% v/v Triton X-100)로 교체합니다. 실온에서 20분 동안 배양합니다.
  4. 1% PBST 용액을 300μL의 0.3% PBST(PBS에서 3% V/V Triton X-100)로 교체합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  5. 0.3% PBST를 제거하고 샘플 탈수를 위해 300μL의 50:50 메탄올과 0.3% PBST로 교체합니다. 실온에서 5분 동안 배양한 다음 혼합물을 1mL의 절대 메탄올로 대체합니다.
    참고: 메탄올 1mL를 천천히 첨가하여 우물 벽에 대고 있습니다. 이 더 많은 양의 메탄올은 샘플 보관 중 완전한 증발을 방지하는 데 사용됩니다.
  6. 샘플을 -20°C에서 최소 1일에서 최대 한 달 동안 보관하십시오.
    알림: 유연한 왁스 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하는 것은 샘플의 메탄올 증발 및 건조를 지연시키는 것이 좋습니다.
  7. 사용 시 메탄올을 300μL의 50:50 혼합물 메탄올과 0.3% PBST로 교체한 다음 실온에서 300μL 0.3% PBST로 교체하여 샘플을 순차적으로 재수화합니다.

4. 생물막 형광 염색

  1. 세포벽/캡슐/외다당류 염색을 위해 실온에서 20분 동안 PBS에서 300μL의 50μg/mL 밀-배아 응집소 응집소 형광 렉틴 접합체(이하 WGA 접합체라고 함, 재료 표 참조)로 재수화된 생물막 샘플을 배양합니다.
    참고: 토론 섹션에서 형광 염색에 대한 관련 주제를 참조하십시오. 이제부터 빛을 피해 샘플을 보호하십시오.
  2. WGA 접합체 용액을 제거하고 실온에서 300μL PBS로 10분 동안 두 번 부드럽게 세척합니다.

5. PmbExM 단계

  1. MA-NHS 앵커링 및 아크릴아미드-아크릴레이트 중합
    1. 착색된 생물막 샘플을 PBS의 1mM 메타크릴산 N-하이드록시숙시미딜 에스테르(MA-NHS) 400μL로 실온에서 약한 교반과 함께 1시간 동안 배양합니다.
      참고 : MA-NHS는 수성 매질에서 가수 분해되기 쉬운 활성 에스테르이므로 PBS 용액에서 1mM을 준비 한 후 즉시 샘플을 처리하십시오.
    2. 실온에서 300μL의 PBS로 10분씩 3회 부드럽게 세척합니다.
    3. PBS를 제거하고 300μL의 단량체 용액으로 교체합니다. 4 °C에서 하룻밤(O.N.) 배양합니다.
    4. 겔화 사전 챔버를 구성합니다. 유리 슬라이드를 베이스로 사용하고 그 위에 접힌 양면 테이프 두 개를 올려 400μm 스페이서 역할을 합니다. 스페이서를 서로 8-10mm 간격으로 배열합니다.
      참고: 겔화 사전 챔버를 구성하는 방법에 대한 자세한 내용은 그림 2A 를 참조하십시오. 여기에 사용된 양면 테이프는 두께가 약 100μm였기 때문에 3mm x 5mm x 0.4mm 스페이서를 만들기 위해 자체적으로 트리밍하고 접었습니다. 사용 가능한 양면 테이프의 두께를 측정하고 그에 따라 배열합니다. 테이프 스페이서에 의한 겔화 용액의 흡수는 무시할 수 있습니다. 양면 테이프의 대안으로 12mm 원형 유리 커버슬립을 물방울로 접착하고 필요한 높이까지 쌓을 수 있습니다.
    5. 습식 챔버를 배치하여 중합 중 시료가 건조되는 것을 방지합니다.
      알림: 마이크로피펫 팁의 일반적인 상자는 팁의 플라스틱 비계를 제거하고 젖은 종이 타월로 교체하여 젖은 챔버로 쉽게 변환할 수 있습니다.
    6. 부피의 단량체 용액, 10 % (w/v) N, N, N', N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED), 0.5 % (w/v) 4-하이드록시-TEMPO (4-HT) 및 10 % (w/v) 과황산암모늄(APS)을 각각 47:1:1:1 비율로 철저히 혼합하여 겔화 용액의 새로운 스톡 볼륨을 준비합니다. 최대 5.1.5 단계가 완료된 경우에만 APS를 나머지 겔화 용액 시약과 혼합합니다.
      참고: 준비할 스톡 겔화 용액의 총량은 처리되는 생물막 샘플의 양에 따라 달라집니다. 예를 들어, 3개의 생물막 샘플을 처리하려면 846μL의 단량체 용액을 18μL의 10%(w/w) TEMED, 18μL의 0.5%(w/w) 4-HT 및 18μL의 10%(w/w) APS와 혼합하여 900μL의 겔화 용액을 준비합니다. 조기 중합을 방지하기 위해 APS는 샘플, 겔화 사전 챔버 및 습식 챔버를 사용할 준비가 된 경우에만 혼합물에 마지막으로 추가해야 합니다. 이 단계에서 언급된 모든 시약과 최근에 준비된 겔화 용액을 냉각된 상태로 유지합니다.
    7. 겔화 용액을 준비한 직후, 단량체 용액을 부드럽게 제거하고 300μL의 전자로 교체하십시오. 4 °C에서 5 분 동안 배양하십시오.
    8. 5.1.7단계가 진행되는 동안 유리 슬라이드에 배치된 양면 테이프 줄무늬의 나머지 보호 덮개를 제거하고 그 사이의 공간에 40μL의 겔화 용액을 놓습니다.
    9. 5.1.7단계가 완료된 후 웰에서 각 생물막이 함유된 커버슬립을 제거하고 이전에 유리 슬라이드에 놓인 40μL 방울의 겔화 용액 위에 놓습니다. 커버슬립의 방향을 정하여 표면의 생물막이 겔화 용액과 접촉하도록 합니다.
    10. 양면 테이프 스페이서에 대한 접착을 고정하기 위해 핀셋을 사용하여 생물막이 포함된 커버슬립을 부드럽게 눌러 겔화 챔버의 구성을 마칩니다.
      참고: 이 샌드위치 같은 설정은 겔화 챔버라고 하는 것으로 구성됩니다(그림 2B).
    11. 샘플을 습식 챔버 내부에서 중합시키고 교반 없이 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
    12. 팽창 전 이미지 캡처를 위해 겔화 챔버를 분해하지 않고 형광 현미경 검사(단계 6.2.1 참조)로 샘플을 시각화합니다.
      참고: 미리 팽창된 겔은 건조되기 쉬워 샘플을 사용할 수 없게 되므로 겔화된 샘플을 습식 챔버 밖으로 한 시간 이상 방치하지 마십시오. 관련 확장 전 인수 절차는 SF2.3 단계(보충 파일 2)를 참조하십시오.
    13. 겔화 챔버를 분해하고 수술용 블레이드를 사용하여 생물막 샘플의 관심 영역 주위의 여분의 겔을 다듬습니다.
      참고: 확장된 샘플의 취급 및 장착을 용이하게 하기 위해 젤을 트리밍하는 것이 좋습니다. 또한 샘플 내 관심 영역의 공간 방향을 추적하려면 겔을 비대칭 모양으로 자르거나 올바른 방향을 쉽게 인식할 수 있도록 겔에 특징적인 컷아웃을 남겨 둡니다.
    14. 트리밍된 젤이 들어 있는 커버 슬립을 젤이 위쪽을 향하도록 새 24웰 플레이트 안에 넣습니다.
      참고: 이 단계에서 겔화된 샘플은 원래의 유리 커버슬립을 고착된 상태로 유지해야 합니다.
  2. 효소 분해 I-III 및 DNA 염색
    참고: P. mirabilis 생물막 샘플의 기계적 특성의 균질화는 저자가 분해 대상이 되는 생물학적 구조에 따라 다당류 가수분해(Digestion I), peptidoglycan 가수분해(Digestion II) 및 단백질 가수분해(Digestion III)의 3단계로 분류한 일련의 효소 분해를 따릅니다.
    1. 소화 I
      1. 샘플을 α-amylase 분해 용액 1mL에 담그십시오. O.N.을 50 °C에서 배양합니다.
        참고: 높은 배양 온도로 인한 시료 건조를 방지하기 위해 대용량(즉, 0.5-1mL)의 효소 용액이 사용됩니다.
      2. α-아밀라아제 용액을 제거하고 300μL의 셀룰라아제 분해 완충액으로 실온에서 5분 동안 겔을 세척합니다.
      3. 셀룰라아제 분해 버퍼를 제거하고 500μL의 셀룰라아제 분해 용액으로 교체합니다. 45 °C에서 2 시간 동안 배양합니다.
      4. 셀룰라아제 분해 용액을 제거하고 300μL의 리티아제 분해 완충액으로 실온에서 5분 동안 겔을 세척합니다.
      5. lyticase 분해 완충액을 제거하고 500μL의 lyticase 분해 용액으로 교체합니다. 30 °C에서 2 시간 동안 배양합니다.
    2. 소화 II
      1. lyticase 분해 용액을 제거하고 300μL의 mutanolysin 분해 완충액으로 실온에서 5분 동안 겔을 세척합니다.
      2. mutanolysin 분해 버퍼를 제거하고 1mL의 mutanolysin 분해 용액으로 교체합니다. O.N.을 55 °C에서 배양합니다.
    3. 소화 III
      1. mutanolysin 분해 용액을 제거하고 300μL의 proteinase K 분해 완충액으로 실온에서 5분 동안 겔을 세척합니다. proteinase K 분해 완충액을 제거하고 500μL의 proteinase K 분해 용액으로 교체합니다. 37 ° C에서 2 시간 동안 배양하십시오.
    4. (선택 사항) DNA 염색
      1. proteinase K 용액을 제거하고 실온에서 5분 동안 300μL의 10x PBS로 겔을 세척합니다.
      2. 10x PBS를 제거하고 실온에서 30분 동안 10x PBS에 300μL의 5μM 적색 형광 핵산 염색으로 교체합니다.
        참고: ExM 절차의 DNA 염색에 대한 설명은 토론 섹션을 참조하십시오.
  3. 확장
    1. proteinase K 용액(또는 옵션 단계 5.2.4가 수행된 경우 DNA 염색 용액)을 제거하고 겔을 60mm 페트리 접시에 옮깁니다. 페트리 접시당 하나의 젤을 놓습니다.
      알림: 작은 납작한 페인트 브러시를 사용하여 젤을 유리 커버 슬립에 밀어 넣습니다. 실험실용 핀셋을 사용하여 유리 커버슬립을 잡고 젤을 위한 플랫폼으로 사용합니다. 플레이트의 우물에서 젤을 들어 올릴 때 브러시를 사용하여 커버 슬립에서 젤이 떨어지는 것을 방지하십시오. 젤이 저절로 접히지 않도록 하십시오.
    2. 페트리 접시에 여분의 탈이온수를 채우고 젤을 완전히 담근 다음 실온에서 20분 동안 부드럽게 저어주면서 배양합니다. 물을 4-5회 교환합니다.
      참고: 팽창하는 젤은 물에 담그면 거의 보이지 않게 됩니다. 페트리 접시를 빛에 대고 배치하여 물을 교환하는 동안 파스퇴르 피펫 또는 마이크로피펫의 흡입으로 젤이 손상되지 않도록 젤을 쉽게 찾을 수 있습니다.

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그림 2: 겔화 챔버 및 시료 장착. (A) 사전 겔화 챔버. 슬라이드에서 2개의 양면 테이프 스페이서(노란색)를 배치합니다. 유리 커버슬립(figure-protocol-3 = 12mm)은 거리 참조로 상단에 있습니다. (B) 겔화 챔버. 박테리아 생물막(녹색)은 하부 커버슬립 표면에 형성됩니다. 400μm 두께의 스페이서(주황색)는 100μm 두께의 양면 테이프 컷아웃으로 만들어집니다. 스페이서를 사용하면 겔이 전체 샘플을 내장하고 챔버 가장자리에서 겔화 용액이 넘치는 것을 방지하여 샘플이 슬라이드와 커버슬립 사이에 찌그러지는 것을 방지할 수 있습니다. (C) 3D 프린팅 이미징 챔버(.stl 파일 https://github.com/scianlab/ExM 에 액세스하려면 다음 링크를 방문하십시오). 팽창된 겔 샘플(왼쪽)과 탈이온수에 담근 팽창된 겔 샘플(오른쪽). 팽창된 젤은 담그면 거의 보이지 않게 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 관찰 및 분석

  1. 확장된 샘플 장착
    1. 이미징 중 샘플 고정을 위해 폴리-라이신 코팅이 된 이미징 챔버 준비11: 이미징 챔버의 유리 표면( 재료 표 참조)을 0.1%(w/v) 폴리-L-라이신으로 실온에서 20분 동안 담급니다.
    2. 폴리-L-라이신 용액을 제거하고 과도한 탈이온수로 두 번 세척합니다. 건조 과정을 가속화하기 위해 1시간 동안 자연 건조하거나 37°C의 인큐베이터 내부에 두십시오.
    3. 5.3.2단계에서 5번째 투석 주기 후 젤을 덮고 있는 물을 제거하고 작은 납작한 브러시를 사용하여 샘플을 24mm x 50mm 유리 커버슬립에 밀어 넣습니다. 직사각형 커버슬립을 젤의 플랫폼으로 사용하고 페트리 접시에서 들어 올립니다.
    4. 티슈 페이퍼를 사용하여 젤에서 과도한 수분을 제거하여 젤 표면과 이미징 챔버의 유리 표면에 있는 폴리-라이신 코팅 사이의 직접적인 접촉을 물이 막지 않도록 합니다.
    5. 젤과 유리 사이에 기포가 머무르지 않도록 이미징 챔버의 유리 표면에 젤을 조심스럽게 놓습니다.
      참고: 이미징 챔버의 유리 표면은 완전히 건조되어야 합니다. 팽창 전 이미지를 촬영한 경우, 사전 팽창된 샘플에서 이전에 캡처된 시야를 쉽게 찾을 수 있도록 팽창된 겔의 올바른 방향을 고려하십시오.
    6. 겔이 완전히 잠길 때까지 탈이온수를 추가합니다( 그림 2C 참조).
      참고: 팽창된 겔은 캡처 중 수축을 방지하기 위해 이미징 프로세스 내내 수화 상태를 유지해야 합니다.
  2. 이미지 획득
    1. 사용 가능한 회절 제한 형광 현미경에서 샘플의 이미지를 시각화하고 캡처합니다.
      참고: 저자는 1.2 개구수(NA)의 63x 침수 대물렌즈와 함께 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용했습니다. 형광단 여기를 위해 488 및 647 nm의 고체 레이저 라인이 사용되었습니다. 캡처는 독점 소프트웨어로 제어되는 16비트 디지털 CMOS 카메라로 이루어졌습니다( 자료 표 참조). 복셀 크기는 64.4mm x 64.4mm x 200nm(XYZ 축)로 설정되었습니다.
  3. 이미지 처리
    1. 박테리아의 분할(섹션 SF2.1), 세포 폭 측정(섹션 SF2.2), EF 결정(섹션 SF2.3) 및 사전 확장 및 확장 조건(섹션 SF2.4)에 대한 이미지 일치를 위한 디지털 이미지 처리 루틴을 찾으려면 보충 파일 2 를 참조하십시오.

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결과

PmbExM은 P. mirabilis 생물막을 4.3배 확장하고 형태 및 토폴로지를 보존했습니다.
그림 3A-D는 P. mirabilis 생물막 세포의 물리적 확대와 이 기술에 의해 제기된 증가된 해상도를 입증합니다. 더욱이, 이것은 세포가 단층과 같은 레이아웃으로 조직하는 얇은 생물막 영역뿐만 아니라 박테리아의 2 또는 3 단계 층의 조밀하게 채워진 배열의 두꺼운 영역에서도 관찰되었습니다 (그림 3G, H). 정량적 형태학적 분석에 따르면 PmbExM은 박테리아의 최대 너비를 0.7μm± 0.07μm에서 3.0μm± 0.22μm(평균 SD)± 증가시켰으며(그림 3E<...

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토론

PmbExM의 중요한 단계
모든 ExM 변형과 마찬가지로 프로토콜의 가장 중요한 단계 중 하나는 샘플의 기계적 특성을 균질화하는 것입니다. PmbExM의 경우, 이는 일련의 효소 처리를 통해 달성됩니다. 불충분한 분해는 낮은 EFs와 생물막 형태 및/또는 토폴로지에 잠재적인 손상을 초래하여 최적이 아닌 분해능과 신뢰할 수 없는 결과를 초래할 수 있습니다. 반대로, 과도하게 공격적인 소화, 특히 단백질 분해 처리는 상당한 형광 손실을 유발하고 생물막의 형태와 구조를 손상시킬 수 있습니다. 구조와 구성 모두에서 생물막의 복잡성을 감안할 때 PmbExM은 효과적인 균질화를 보장하기 위해 거의 최적의 조건(보고된 기사 12,13,14,15 기준)에서 소화 효소를 활용하도록 특별히 설계되었습니다.

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공개 사항

저자는 이 작업과 관련된 재정적 또는 개인적 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 SCIAN-Lab의 확장 기술 구현에 기여한 Juan Eduardo Rodríguez 박사와 Ulrich Kubitschek 교수(U-Bonn)에게 감사를 표합니다. 이 작업은 ANID 프로젝트 ICM P09-015-F (SH, DC, KP, JJW), FONDECYT 1211988 (SH, DC, KP), FONDECYT 3220832 (JJW), FONDEQUIP EQM210020 (DC, KP, JJW, JT, NCH, PS, SH)에 의해 자금 지원을 받았습니다. Núcleo SELFO NCN2024_068 (SH, KP, JJW), CORFO 16CTTS- 66,390, MINEDUC grant RED 21994 (SH), BASAL FB210005 (SH), DAAD 57519605 (SH, NC), Centro CTI230006 (SH), FONDEF ID 23I10337 (SH) 및 Regional Binational Project Cooperación SUR-SUR AUCI / AGCID BIL-URY-2019-661 (SH, NCH, PS, MJG).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
&알파;-Bacillus sp.Sigma-Aldrich 10070다당류 분해
0.1%(w/v) 폴리-L-라이신 수용액 Sigma-AldrichP8920이미징용 샘플 고정
12mm 유리 커버슬립 ChemglassLife SciencesCLS-1760겔화 챔버 구성 요소
16비트 C13440-20CU 카메라Hamamatsu Photonics이미지 획득용 CMOS 디지털 카메라사용 불가
24mm x 50mm 유리 커버슬립 ChemglassLife SciencesCLS-1764샘플 조작/취급
3D 프린팅 이미징 챔버사내 설계-이미징 챔버 옵션
4-하이드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실(4-하이드록시-템포)시그마-알드리치176141겔화 용액 성분
검은색 벽이 있는 6-웰 유리 바닥 플레이트CelVisP06-1.5H-N이미징 챔버 옵션
아세트산 Sigma-Aldrich818755효소 완충 성분
아크릴아미드 Sigma-AldrichA4058단량체 용액 성분
과황산암모늄Sigma-AldrichA3678겔화 용액 성분
Axiovert 200 현미경Zeiss사용할 수 없음공초점 현미경
염화칼슘Sigma-AldrichC8106효소 완충액 성분
C-Apochromat 63x 1.2 NA 수침 대물렌즈Zeiss사용할 수 없음미경 대물렌즈
셀룰라아제 Aspergillus nigerSigma-Aldrich 22178다당류 분해
Chamlide CMB 35mm 접시 자기 이미징 챔버살아있는 세포 기기사용할 수 없음이미징 챔버 옵션
Dimethyl sulfoxideSigma-Aldrich472301MA-NHS 앵커링 시약 원액 
인산이나트륨Sigma-AldrichS3264효소 완충액 성분
에탄올Sigma-AldrichE7023세척 및 살균
에틸렌디아민테트라아세트산Merck324503효소 완충액 성분
Falcon 폴리스티렌 24웰플레이트Corning351147일반 절차 플랫폼
FIJI 소프트웨어국립 보건원이미지처리 소프트웨어
GlycerolSigma-AldrichG7893효소 완충 성분
구아니딘 염산염Thermo Scientific24115효소 완충 성분
Huygens 소프트웨어과학 볼륨 이미징-디콘볼루션 소프트웨어
산Supelco1.00317완충액 준비
Kimwipes 티슈 페이퍼Fisher Scientiffic06-666과도한 수분 제거
실험실 핀셋전자 현미경 과학M5E일반 샘플 조작/취급
Luria Bertani 국물Invitrogen12795-027생물막 성장 배지
Arthrobacter luteus시그마-알드리치 L4025다당류 소화
마그네슘시그마-알드리치D5652효소 완충액 성분
메타크릴산 N-하이드록시숙신이미딜 에스테르시그마-알드리치730300고정 시약
메탄올시그마-알드리치32213샘플 탈수 및 보관
미생물J --이미지 처리 소프트웨어 플러그인
현미경 유리 슬라이드Chemglass Life SciencesCG-8221겔화 챔버 성분
인산나트륨Sigma-AldrichS9638소 완충액 성분
Streptomyces globisporusSigma-Aldrich M990펩티도글리칸 소화
N, N, N', N'-테트라메틸에틸렌디아민Sigma-AldrichT7024겔화 용액 성분
N,N′-메틸렌비사크릴아미드Sigma-AldrichM1533단량체 용액 성분
Nunc 40.4mm 유리 바닥 페트리 접시Thermo Fisher12-567-400이미징 챔버 옵션
파라포름알데히드Sigma-Aldrich158127샘플 고정
인산염 완충액 식염수Sigma-Aldrich79383단량체 용액 성분, 세척, 효소 완충액
Engyodontium albumInvitrogen25530-031단백질 분해
Proteus mirabilis ATCC 12453미생물제0440P연구 주제
작은 플랫 페인트 브러시지역 철물점-샘플 조작/취급
아세트산나트륨시그마-알드리치241245효소 완충액 성분
아크릴산나트륨시그마-알드리치408220단량체 용액 성분
중탄산나트륨시그마-알드리치S5761효소 완충액 성분
염화나트륨Sigma-AldrichS9888단량체 용액 성분, 효소 완충액 성분
수산화나트륨Sigma-Aldrich221465슬라이드 세척
고체 레이저 라인Omicron사용할 수 없음488, 568 및 647nm 여기 레이저 라인
SYTO 61 핵산 염색InvitrogenS11343형광 염료
Tris(하이드록시메틸)아미노메탄 염산염SAFC108219효소 완충액 성분
Triton X-100Sigma-AldrichX100시료 투과화, 효소 완충액 성분
Volocity 7.0.0 캡처 소프트웨어QuorumTechnologies-Microscoy 획득 컨트롤러 소프트웨어
Volocity ViewVox 스피닝 디스크 시스템Perkin-Elmer사용할 수 없음공초점용 스피닝 디스크 시스템 현미경
밀배아 응집소 – Alexa Fluor 488 형광 렉틴 접합체InvitrogenW11261형광 염료
의 아밀라아제; 현 이미지 복원을 위한 염 염화 효의 Mutanolysin;제 유리

참고문헌

  1. Franklin, M. J., Chang, C., Akiyama, T., Bothner, B. New technologies for studying biofilms. Microbiol Spectr. 3 (4), 10(2015).
  2. Valdivieso González, D., Jara, J., Almendro-Vedia, V. G., Orgaz, B., López-Montero, I. Expansion microscopy applied to mono- and dual-species biofilms. NPJ Biofilms Microbiomes. 9 (1), 92(2023).
  3. Castagnini, D., et al. Proteus mirabilis biofilm expansion microscopy yields over 4-fold magnification for super-resolution of biofilm structure and subcellular DNA organization. J Microbiol Methods. 220, 106927(2024).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging- Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  5. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nat Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  6. Gao, R., Asano, S. M., Boyden, E. S. Q&A: Expansion microscopy. BMC biology. 15 (1), 50(2017).
  7. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nat Biotechnol. 34 (9), 987-992 (2016).
  8. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLoS biology. 17 (10), e3000268(2019).
  9. Kunz, T. C., et al. The expandables: Cracking the staphylococcal cell wall for expansion microscopy. Front Cell Infect Microbiol. 11, 644750(2021).
  10. Jacobsen, S. M., Shirtliff, M. E. Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections. Virulence. 2 (5), 460-465 (2011).
  11. Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: Protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. 80 (1), e56(2018).
  12. Yokogawa, K., Kawata, S., Nishimura, S., Ikeda, Y., Yoshimura, Y. Mutanolysin, bacteriolytic agent for cariogenic streptococci: partial purification and properties. Antimicrob Agents Chemother. 6 (2), 156-165 (1974).
  13. Hurst, P. L., Nielsen, J., Sullivan, P. A., Shepherd, M. G. Purification and properties of a cellulase from Aspergillus niger. Biochem J. 165 (1), 33-41 (1977).
  14. Scott, J. H., Schekman, R. Lyticase: Endoglucanase and protease activities that act together in yeast cell lysis. J Bacteriol. 142 (2), 414-423 (1980).
  15. Bano, S., Qader, S. A. U., Aman, A., et al. Purification and characterization of novel α-amylase from Bacillus subtilis KIBGE HAS. AAPS PharmSciTech. 12, 255-261 (2011).
  16. Kaplan, J. B., et al. Genes involved in the synthesis and degradation of matrix polysaccharide in Actinobacillus actinomycetemcomitans and Actinobacillus pleuropneumoniae biofilms. J Bacteriol. 186 (24), 8213-8220 (2004).
  17. Kaplan, J. B., et al. Recombinant human DNase I decreases biofilm and increases antimicrobial susceptibility in staphylococci. J Antibiot. 65 (2), 73-77 (2012).
  18. Schlapp, G., Scavone, P., Zunino, P., Härtel, S. Development of 3D architecture of uropathogenic Proteus mirabilis batch culture biofilms: A quantitative confocal microscopy approach. J Microbiol Methods. 87 (2), 234-240 (2011).
  19. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nat Cell Biol. 21 (1), 72-84 (2019).

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