확장 현미경 검사법에 의한 Proteus mirabilis 생물막의 초고해상도 이미징

형광 현미경 검사는 생물막 구조, 구성 및 기능¹을 연구하는 데 널리 사용되는 도구입니다. 그러나 생물막의 구조적, 세포적, 세포적 특성을 해결하는 광학 현미경의 능력은 회절 장벽에 의해 제한됩니다. 팽창 현미경(ExM)은 혁신적이고 접근하기 쉬우며 사용하기 쉬운 초고해상도 기술로, 회절 한계 ^2,3을 넘어 생물막 구조를 밝힐 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. ExM은 생물학적 표본을 원래 크기의 약 4배로 등방성으로 확장하여 해상도를 향상시킵니다. 이 방법은 시료 전체에 걸쳐 팽창성 이온 하이드로겔의 현장 중합을 포함하며 주의해서 적용할 때 분자 표적의 상대적인 공간 배열을 보존합니다 ^4,5.

ExM이 제대로 작동하려면 생물학적 물질의 기계적 특성을 균질화하는 것이 중요한⁶단계입니다. 표준 ExM 변이체는 포유류 세포 배양 및 조직에서 개발되었으며, proteinase K 단백질 분해 ^4,5 또는 세제 및 오토클레이빙⁷을 사용한 연질 단백질 변성을 통해서만 효율적으로 균질화를 달성하여 등방성 4배 팽창을 생성했습니다. 그러나 박테리아 및 박테리아 생물막의 경우 펩티도글리칸 세포벽과 구조적 다당류와 같은 EPS 매트릭스 요소는 팽창을 방해하는 장애물입니다 ^2,3,8,9.

이 논문은 높은 항생제 내성 및 카테터 관련 요로 감염과 관련된 임상적으로 관련된 그람 음성 간균인 P. mirabilis의 생물막을 확장하도록 설계된 맞춤형 ExM 변형인 Proteus mirabilis 생물막 확장 현미경(PmbExM)의 절차를 설명합니다¹⁰. PmbExM은 펩티도글리칸 세포벽, 다당류 및 단백질을 각각 가수분해하기 위해 뮤α올리신, -아밀라아제, 셀룰라아제, 리티카제 및 단백질분해효소 K 효소 처리의 조합을 사용합니다. 결과는 이 방법이 48시간 된 P. mirabilis 생물막의 4.3배 등방성 팽창을 달성한다는 것을 보여줍니다. 이 기술은 이중 염색³을 통해 P. mirabilis 생물막 구조, 조립 및 세포 내 특징의 초해상도 시각화를 가능하게 합니다. 또한 PmbExM은 종 특이적 생물막 구성 요소를 표적으로 하도록 효소 처리를 조정하여 다른 생물막 모델에 적용할 수 있습니다.

이 기사의 목적은 PmbExM에 대한 생물막 샘플의 겔화, 분해, 확장 및 장착과 관련된 절차에 대한 자세한 설명을 제공하는 것입니다. 또한 이 연구는 저자가 사용한 박테리아 성장 조건, 샘플 형식 및 형광 염색 기술과 함께 이미지 처리 경험이 부족한 연구자가 쉽게 적용할 수 있는 데이터 처리 및 분석 루틴을 간략하게 설명합니다. 이미지 처리 및 분석에 대한 보다 포괄적이고 심층적인 가이드는 Castagnini, D. et ^al.3을 참조하십시오.

PmbExM의 전체 프로세스는 그림 1에 요약되어 있습니다. 이 작업에 사용된 모든 명명된 용액(즉, 단량체 용액, proteinase K 분해 용액 등)의 조성을 찾기 위해 보충 파일 1 을 참조하십시오. 마찬가지로, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4 를 참조하여 이미지 처리 경험이 많지 않은 연구자도 사용할 수 있는 간소화된 데이터 처리 및 분석 루틴을 제공합니다. 프로토콜은 2.5-3 주에 걸쳐 편안하게 수행 할 수 있습니다 : 첫 번째 주에는 커버 슬립 세척 및 살균, 생물막 성장 및 샘플 고정에 전념합니다. 두 번째 주는 샘플 염색 및 PmbExM 프로토콜 자체에 대한 연구이고, 세 번째 주에는 시료 장착 및 이미지 획득에 대한 연구입니다. 또한 필요한 재료 및 용액에 대한 1주일의 사전 준비를 고려하십시오. 이 연구에 사용된 시약, 재료, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

그림 1: P. mirabilis 생물막의 성공적인 확장, 관찰 및 분석을 위한 PmbExM 프로토콜의 앵커링, 중합, 분해 및 투석. 왼쪽 열은 확장 프로토콜 동안 선택한 단계에서 샘플의 6개 상태를 식별합니다. 고정, 투과성 및 염색된 생물막 샘플에서 시작하여 최종 겔화 및 팽창 상태까지 4가지 중간 상태를 따라 초고해상도에 대한 현미경 및 이미지 분석을 준비합니다. 생물막의 EPS 매트릭스는 녹색으로, 박테리아 세포벽은 보라색 선으로, 일반적인 단백질 세포 구조는 회색으로, 아크릴아미드-아크릴레이트 ExM 폴리머는 물결 모양의 파란색 선으로 표시됩니다. 이 과정에 관련된 모든 효소는 Pac-Man 기호로 표시됩니다 : 외다당류 가수 분해를위한 3 개의 배당체 가수 분해 효소 (녹색) : α-아밀라아제, 셀룰라아제 및 리티 아제; Peptidoglycan 세포벽의 분해를 위한 Mutanolysin (보라색); 및 일반적인 단백질 소화를 위한 proteinase K(회색). Pac-Man 기호의 색상은 각 대상 구조와 일치합니다. 낮은 불투명도 또는 파선 테두리로 표시된 모든 개체는 효소 분해 상태를 나타냅니다. 이 그림은 Castagnini, D. et ^al.3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 생물막 형성을 위한 유리 커버슬립의 세척 및 살균

1. 초음파로 12mm 유리 커버슬립을 실온에서 20분 동안 1M 수산화나트륨에 넣은 다음 풍부한 탈이온수로 헹굽니다.
2. 커버슬립을 실온에서 70%(v/v) 에탄올에 15분 동안 초음파로 처리한 다음 95%(v/v) 에탄올로 헹굽니다.
3. 커버슬립을 실온에서 자연 건조시키십시오.
4. 오토클레이빙으로 살균하십시오.

2. Proteus mirabilis 생물막 성장

1. P. mirabilis를 Luria Bertani (LB) 육수 10mL에 넣고 흔들지 않고 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
   참고: 이 연구에서는 상업적으로 이용 가능한 P. mirabilis 유형 균주( 재료 표 참조)를 획득하여 사용했지만 쉽게 구할 수 있는 P. mirabilis 균주를 사용하는 것이 좋습니다.
2. 배양액에서 1mL를 취하여 신선하고 멸균된 LB 육수 9mL에 첨가하여 1:10 희석의 박테리아 현탁액을 생성합니다.
3. 1:10 박테리아 현탁액의 600nm에서 광학 밀도(OD)가 0.1인지 확인합니다. 필요한 경우 OD₆₀₀ = 0.1에 도달할 때까지 소량의 신선한 LB 또는 P. mirabilis 배양을 추가하여 조정합니다.
4. 12mm 유리 커버슬립(이전에 세척 및 멸균)을 멸균 폴리스티렌 24웰 플레이트(웰당 하나의 커버슬립)에 넣습니다.
   알림: 전체 커버슬립 표면이 웰 바닥에 닿는지 확인하십시오. 생물막은 위쪽을 향하는 커버슬립 측면에 형성됩니다.
5. 플레이트의 웰에 OD₆₀₀ = 0.1 박테리아 현탁액 350μL를 파종합니다.
   알림: 플레이트의 내부 웰에만 파종하고 외부 웰(즉, A와 D행, 1열과 6열의 웰)에 멸균수 또는 LB 육수를 채우는 것이 좋습니다. 이는 외부 웰이 내부 웰보다 액체 증발 속도가 더 빠르기 때문에 생물막 성장에 영향을 미치기 때문입니다.
6. 파종된 플레이트를 인큐베이터 내부에 놓고 45도 경사로 배치합니다.
   참고: 50mL 원심분리기 튜브 또는 마이크로피펫 팁 박스와 같은 일반적인 실험실 재료를 사용하십시오. 기울어진 위치는 P. mirabilis 생물막이 가장 두꺼운 영역을 형성하는 커버슬립 표면에 공기-액체 계면을 형성할 수 있도록 합니다.
7. 흔들림 없이 37°C에서 48시간 동안 생물막이 형성되도록 합니다.
   참고: 이 생물막 성장 설정은 배지의 증발로 인한 생물막 건조로 인해 48시간 이상의 배양 시간에는 적합하지 않습니다.

3. 생물막 시료 정착 및 보관

1. 웰에서 배양 배지를 조심스럽게 제거하고 매우 약한 교반으로 실온에서 5분 동안 300μL 멸균 인산염 완충액 식염수(PBS)로 바이오필름이 함유된 커버슬립을 두 번 부드럽게 세척합니다.
   참고: 배양 또는 세척을 위해 소량을 사용하여 반복적인 유체 교환으로 인한 생물막의 파괴를 피하십시오. 300-400μL의 액체는 24웰 플레이트에 바이오필름을 담가두기에 충분합니다. 느리고 체계적인 피펫팅을 강력히 권장하며, 교환된 용액으로 생물막에 직접 부딪히는 것을 피하는 것이 좋습니다.
2. PBS를 조심스럽게 제거하고 PBS에 400μL의 4%(w/v) 파라포름알데히드(PFA)로 교체하여 실온에서 20분 동안 생물막 고정을 수행합니다.
3. PFA를 제거하고 세포 투과화를 위해 300μL의 1% PBST(PBS에서 1% v/v Triton X-100)로 교체합니다. 실온에서 20분 동안 배양합니다.
4. 1% PBST 용액을 300μL의 0.3% PBST(PBS에서 3% V/V Triton X-100)로 교체합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
5. 0.3% PBST를 제거하고 샘플 탈수를 위해 300μL의 50:50 메탄올과 0.3% PBST로 교체합니다. 실온에서 5분 동안 배양한 다음 혼합물을 1mL의 절대 메탄올로 대체합니다.
   참고: 메탄올 1mL를 천천히 첨가하여 우물 벽에 대고 있습니다. 이 더 많은 양의 메탄올은 샘플 보관 중 완전한 증발을 방지하는 데 사용됩니다.
6. 샘플을 -20°C에서 최소 1일에서 최대 한 달 동안 보관하십시오.
   알림: 유연한 왁스 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하는 것은 샘플의 메탄올 증발 및 건조를 지연시키는 것이 좋습니다.
7. 사용 시 메탄올을 300μL의 50:50 혼합물 메탄올과 0.3% PBST로 교체한 다음 실온에서 300μL 0.3% PBST로 교체하여 샘플을 순차적으로 재수화합니다.

4. 생물막 형광 염색

1. 세포벽/캡슐/외다당류 염색을 위해 실온에서 20분 동안 PBS에서 300μL의 50μg/mL 밀-배아 응집소 응집소 형광 렉틴 접합체(이하 WGA 접합체라고 함, 재료 표 참조)로 재수화된 생물막 샘플을 배양합니다.
   참고: 토론 섹션에서 형광 염색에 대한 관련 주제를 참조하십시오. 이제부터 빛을 피해 샘플을 보호하십시오.
2. WGA 접합체 용액을 제거하고 실온에서 300μL PBS로 10분 동안 두 번 부드럽게 세척합니다.

5. PmbExM 단계

1. MA-NHS 앵커링 및 아크릴아미드-아크릴레이트 중합
   1. 착색된 생물막 샘플을 PBS의 1mM 메타크릴산 N-하이드록시숙시미딜 에스테르(MA-NHS) 400μL로 실온에서 약한 교반과 함께 1시간 동안 배양합니다.
      참고 : MA-NHS는 수성 매질에서 가수 분해되기 쉬운 활성 에스테르이므로 PBS 용액에서 1mM을 준비 한 후 즉시 샘플을 처리하십시오.
   2. 실온에서 300μL의 PBS로 10분씩 3회 부드럽게 세척합니다.
   3. PBS를 제거하고 300μL의 단량체 용액으로 교체합니다. 4 °C에서 하룻밤(O.N.) 배양합니다.
   4. 겔화 사전 챔버를 구성합니다. 유리 슬라이드를 베이스로 사용하고 그 위에 접힌 양면 테이프 두 개를 올려 400μm 스페이서 역할을 합니다. 스페이서를 서로 8-10mm 간격으로 배열합니다.
      참고: 겔화 사전 챔버를 구성하는 방법에 대한 자세한 내용은 그림 2A 를 참조하십시오. 여기에 사용된 양면 테이프는 두께가 약 100μm였기 때문에 3mm x 5mm x 0.4mm 스페이서를 만들기 위해 자체적으로 트리밍하고 접었습니다. 사용 가능한 양면 테이프의 두께를 측정하고 그에 따라 배열합니다. 테이프 스페이서에 의한 겔화 용액의 흡수는 무시할 수 있습니다. 양면 테이프의 대안으로 12mm 원형 유리 커버슬립을 물방울로 접착하고 필요한 높이까지 쌓을 수 있습니다.
   5. 습식 챔버를 배치하여 중합 중 시료가 건조되는 것을 방지합니다.
      알림: 마이크로피펫 팁의 일반적인 상자는 팁의 플라스틱 비계를 제거하고 젖은 종이 타월로 교체하여 젖은 챔버로 쉽게 변환할 수 있습니다.
   6. 부피의 단량체 용액, 10 % (w/v) N, N, N', N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED), 0.5 % (w/v) 4-하이드록시-TEMPO (4-HT) 및 10 % (w/v) 과황산암모늄(APS)을 각각 47:1:1:1 비율로 철저히 혼합하여 겔화 용액의 새로운 스톡 볼륨을 준비합니다. 최대 5.1.5 단계가 완료된 경우에만 APS를 나머지 겔화 용액 시약과 혼합합니다.
      참고: 준비할 스톡 겔화 용액의 총량은 처리되는 생물막 샘플의 양에 따라 달라집니다. 예를 들어, 3개의 생물막 샘플을 처리하려면 846μL의 단량체 용액을 18μL의 10%(w/w) TEMED, 18μL의 0.5%(w/w) 4-HT 및 18μL의 10%(w/w) APS와 혼합하여 900μL의 겔화 용액을 준비합니다. 조기 중합을 방지하기 위해 APS는 샘플, 겔화 사전 챔버 및 습식 챔버를 사용할 준비가 된 경우에만 혼합물에 마지막으로 추가해야 합니다. 이 단계에서 언급된 모든 시약과 최근에 준비된 겔화 용액을 냉각된 상태로 유지합니다.
   7. 겔화 용액을 준비한 직후, 단량체 용액을 부드럽게 제거하고 300μL의 전자로 교체하십시오. 4 °C에서 5 분 동안 배양하십시오.
   8. 5.1.7단계가 진행되는 동안 유리 슬라이드에 배치된 양면 테이프 줄무늬의 나머지 보호 덮개를 제거하고 그 사이의 공간에 40μL의 겔화 용액을 놓습니다.
   9. 5.1.7단계가 완료된 후 웰에서 각 생물막이 함유된 커버슬립을 제거하고 이전에 유리 슬라이드에 놓인 40μL 방울의 겔화 용액 위에 놓습니다. 커버슬립의 방향을 정하여 표면의 생물막이 겔화 용액과 접촉하도록 합니다.
   10. 양면 테이프 스페이서에 대한 접착을 고정하기 위해 핀셋을 사용하여 생물막이 포함된 커버슬립을 부드럽게 눌러 겔화 챔버의 구성을 마칩니다.
       참고: 이 샌드위치 같은 설정은 겔화 챔버라고 하는 것으로 구성됩니다(그림 2B).
   11. 샘플을 습식 챔버 내부에서 중합시키고 교반 없이 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
   12. 팽창 전 이미지 캡처를 위해 겔화 챔버를 분해하지 않고 형광 현미경 검사(단계 6.2.1 참조)로 샘플을 시각화합니다.
       참고: 미리 팽창된 겔은 건조되기 쉬워 샘플을 사용할 수 없게 되므로 겔화된 샘플을 습식 챔버 밖으로 한 시간 이상 방치하지 마십시오. 관련 확장 전 인수 절차는 SF2.3 단계(보충 파일 2)를 참조하십시오.
   13. 겔화 챔버를 분해하고 수술용 블레이드를 사용하여 생물막 샘플의 관심 영역 주위의 여분의 겔을 다듬습니다.
       참고: 확장된 샘플의 취급 및 장착을 용이하게 하기 위해 젤을 트리밍하는 것이 좋습니다. 또한 샘플 내 관심 영역의 공간 방향을 추적하려면 겔을 비대칭 모양으로 자르거나 올바른 방향을 쉽게 인식할 수 있도록 겔에 특징적인 컷아웃을 남겨 둡니다.
   14. 트리밍된 젤이 들어 있는 커버 슬립을 젤이 위쪽을 향하도록 새 24웰 플레이트 안에 넣습니다.
       참고: 이 단계에서 겔화된 샘플은 원래의 유리 커버슬립을 고착된 상태로 유지해야 합니다.
2. 효소 분해 I-III 및 DNA 염색
   참고: P. mirabilis 생물막 샘플의 기계적 특성의 균질화는 저자가 분해 대상이 되는 생물학적 구조에 따라 다당류 가수분해(Digestion I), peptidoglycan 가수분해(Digestion II) 및 단백질 가수분해(Digestion III)의 3단계로 분류한 일련의 효소 분해를 따릅니다.
   1. 소화 I
      1. 샘플을 α-amylase 분해 용액 1mL에 담그십시오. O.N.을 50 °C에서 배양합니다.
         참고: 높은 배양 온도로 인한 시료 건조를 방지하기 위해 대용량(즉, 0.5-1mL)의 효소 용액이 사용됩니다.
      2. α-아밀라아제 용액을 제거하고 300μL의 셀룰라아제 분해 완충액으로 실온에서 5분 동안 겔을 세척합니다.
      3. 셀룰라아제 분해 버퍼를 제거하고 500μL의 셀룰라아제 분해 용액으로 교체합니다. 45 °C에서 2 시간 동안 배양합니다.
      4. 셀룰라아제 분해 용액을 제거하고 300μL의 리티아제 분해 완충액으로 실온에서 5분 동안 겔을 세척합니다.
      5. lyticase 분해 완충액을 제거하고 500μL의 lyticase 분해 용액으로 교체합니다. 30 °C에서 2 시간 동안 배양합니다.
   2. 소화 II
      1. lyticase 분해 용액을 제거하고 300μL의 mutanolysin 분해 완충액으로 실온에서 5분 동안 겔을 세척합니다.
      2. mutanolysin 분해 버퍼를 제거하고 1mL의 mutanolysin 분해 용액으로 교체합니다. O.N.을 55 °C에서 배양합니다.
   3. 소화 III
      1. mutanolysin 분해 용액을 제거하고 300μL의 proteinase K 분해 완충액으로 실온에서 5분 동안 겔을 세척합니다. proteinase K 분해 완충액을 제거하고 500μL의 proteinase K 분해 용액으로 교체합니다. 37 ° C에서 2 시간 동안 배양하십시오.
   4. (선택 사항) DNA 염색
      1. proteinase K 용액을 제거하고 실온에서 5분 동안 300μL의 10x PBS로 겔을 세척합니다.
      2. 10x PBS를 제거하고 실온에서 30분 동안 10x PBS에 300μL의 5μM 적색 형광 핵산 염색으로 교체합니다.
         참고: ExM 절차의 DNA 염색에 대한 설명은 토론 섹션을 참조하십시오.
3. 확장
   1. proteinase K 용액(또는 옵션 단계 5.2.4가 수행된 경우 DNA 염색 용액)을 제거하고 겔을 60mm 페트리 접시에 옮깁니다. 페트리 접시당 하나의 젤을 놓습니다.
      알림: 작은 납작한 페인트 브러시를 사용하여 젤을 유리 커버 슬립에 밀어 넣습니다. 실험실용 핀셋을 사용하여 유리 커버슬립을 잡고 젤을 위한 플랫폼으로 사용합니다. 플레이트의 우물에서 젤을 들어 올릴 때 브러시를 사용하여 커버 슬립에서 젤이 떨어지는 것을 방지하십시오. 젤이 저절로 접히지 않도록 하십시오.
   2. 페트리 접시에 여분의 탈이온수를 채우고 젤을 완전히 담근 다음 실온에서 20분 동안 부드럽게 저어주면서 배양합니다. 물을 4-5회 교환합니다.
      참고: 팽창하는 젤은 물에 담그면 거의 보이지 않게 됩니다. 페트리 접시를 빛에 대고 배치하여 물을 교환하는 동안 파스퇴르 피펫 또는 마이크로피펫의 흡입으로 젤이 손상되지 않도록 젤을 쉽게 찾을 수 있습니다.

그림 2: 겔화 챔버 및 시료 장착. (A) 사전 겔화 챔버. 슬라이드에서 2개의 양면 테이프 스페이서(노란색)를 배치합니다. 유리 커버슬립( = 12mm)은 거리 참조로 상단에 있습니다. (B) 겔화 챔버. 박테리아 생물막(녹색)은 하부 커버슬립 표면에 형성됩니다. 400μm 두께의 스페이서(주황색)는 100μm 두께의 양면 테이프 컷아웃으로 만들어집니다. 스페이서를 사용하면 겔이 전체 샘플을 내장하고 챔버 가장자리에서 겔화 용액이 넘치는 것을 방지하여 샘플이 슬라이드와 커버슬립 사이에 찌그러지는 것을 방지할 수 있습니다. (C) 3D 프린팅 이미징 챔버(.stl 파일 https://github.com/scianlab/ExM 에 액세스하려면 다음 링크를 방문하십시오). 팽창된 겔 샘플(왼쪽)과 탈이온수에 담근 팽창된 겔 샘플(오른쪽). 팽창된 젤은 담그면 거의 보이지 않게 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 관찰 및 분석

1. 확장된 샘플 장착
   1. 이미징 중 샘플 고정을 위해 폴리-라이신 코팅이 된 이미징 챔버 준비¹¹: 이미징 챔버의 유리 표면( 재료 표 참조)을 0.1%(w/v) 폴리-L-라이신으로 실온에서 20분 동안 담급니다.
   2. 폴리-L-라이신 용액을 제거하고 과도한 탈이온수로 두 번 세척합니다. 건조 과정을 가속화하기 위해 1시간 동안 자연 건조하거나 37°C의 인큐베이터 내부에 두십시오.
   3. 5.3.2단계에서 5번째 투석 주기 후 젤을 덮고 있는 물을 제거하고 작은 납작한 브러시를 사용하여 샘플을 24mm x 50mm 유리 커버슬립에 밀어 넣습니다. 직사각형 커버슬립을 젤의 플랫폼으로 사용하고 페트리 접시에서 들어 올립니다.
   4. 티슈 페이퍼를 사용하여 젤에서 과도한 수분을 제거하여 젤 표면과 이미징 챔버의 유리 표면에 있는 폴리-라이신 코팅 사이의 직접적인 접촉을 물이 막지 않도록 합니다.
   5. 젤과 유리 사이에 기포가 머무르지 않도록 이미징 챔버의 유리 표면에 젤을 조심스럽게 놓습니다.
      참고: 이미징 챔버의 유리 표면은 완전히 건조되어야 합니다. 팽창 전 이미지를 촬영한 경우, 사전 팽창된 샘플에서 이전에 캡처된 시야를 쉽게 찾을 수 있도록 팽창된 겔의 올바른 방향을 고려하십시오.
   6. 겔이 완전히 잠길 때까지 탈이온수를 추가합니다( 그림 2C 참조).
      참고: 팽창된 겔은 캡처 중 수축을 방지하기 위해 이미징 프로세스 내내 수화 상태를 유지해야 합니다.
2. 이미지 획득
   1. 사용 가능한 회절 제한 형광 현미경에서 샘플의 이미지를 시각화하고 캡처합니다.
      참고: 저자는 1.2 개구수(NA)의 63x 침수 대물렌즈와 함께 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용했습니다. 형광단 여기를 위해 488 및 647 nm의 고체 레이저 라인이 사용되었습니다. 캡처는 독점 소프트웨어로 제어되는 16비트 디지털 CMOS 카메라로 이루어졌습니다( 자료 표 참조). 복셀 크기는 64.4mm x 64.4mm x 200nm(XYZ 축)로 설정되었습니다.
3. 이미지 처리
   1. 박테리아의 분할(섹션 SF2.1), 세포 폭 측정(섹션 SF2.2), EF 결정(섹션 SF2.3) 및 사전 확장 및 확장 조건(섹션 SF2.4)에 대한 이미지 일치를 위한 디지털 이미지 처리 루틴을 찾으려면 보충 파일 2 를 참조하십시오.

PmbExM은 P. mirabilis 생물막을 4.3배 확장하고 형태 및 토폴로지를 보존했습니다.
그림 3A-D는 P. mirabilis 생물막 세포의 물리적 확대와 이 기술에 의해 제기된 증가된 해상도를 입증합니다. 더욱이, 이것은 세포가 단층과 같은 레이아웃으로 조직하는 얇은 생물막 영역뿐만 아니라 박테리아의 2 또는 3 단계 층의 조밀하게 채워진 배열의 두꺼운 영역에서도 관찰되었습니다 (그림 3G, H). 정량적 형태학적 분석에 따르면 PmbExM은 박테리아의 최대 너비를 0.7μm± 0.07μm에서 3.0μm± 0.22μm(평균 SD)± 증가시켰으며(그림 3E), 이는 약 4.3의 팽창 계수(EF)로 해석됩니다. 또한, 확장 전 및 확장 후 이미지의 공동 국소화는 분절된 박테리아 간의 높은 영역 중복을 보여주었습니다(그림 3F). 이와 일치하게, 추가 형태학적 분석은 영역, 둘레2/면적, 주축 편심 및 경계 상자 편심3과 같은 형상 설명자의 확장 전과 확장 후 조건 간에 유의미한 차이를 나타내지 않았습니다. 이와 동시에 토폴로지 분석은 확장 과정에서 318개의 최근접 이웃 중심 거리 중 7개만 변경되었음을 밝혔습니다. 전체적으로 이러한 결과는 PmbExM이 세포 형태와 생물막 공간 조직을 3차원으로 보존하는 4배 확장을 달성했음을 나타냅니다.

그림 3: PmbExM에 의한 4배 등방성 팽창은 P. mirabilis 생물막의 측면 및 축 분해능을 개선합니다. (A) WGA 접합체(녹색)로 세포벽을 염색한 pre-PmbExM P. mirabilis 생물막. 흰색 사각형 삽입은 확대되고(B) 확장 이미지, (C) 및 (D)를 일치시키는 데 사용됩니다. (B)에 비해 (C)에서 해상도와 세부 사항이 증가한 것을 주목하십시오. (D) (C)의 WGA 접합체 및 DNA 염색(마젠타색) 채널의 이미지. (E) PmbExM 이전(흰색) 및 PmbExM 이후(회색)의 최대 너비에 대한 상자 차트. 중간선은 평균값입니다. PmbExM은 4.3 ± 0.44의 팽창 계수(EF)를 달성했습니다. p-값 < 0.0001, Welch의 수정이 있는 쌍체가 없는 t-검정. (F) 분절된 박테리아의 공동 국소화, 사전 확장(빨간색), PmbExM(녹색) 및 사전 확장 전과 확장 후(노란색)의 중첩 이미지를 보여줍니다. PmbExM 이미지는 확장 전 이미지와 일치하도록 축소되었습니다. 흰색 화살표는 확장 중에 회전한 박테리아를 나타냅니다. (G) P. mirabilis 생물막의 측면 및 직교 보기. 셀의 계층 구성은 XZ 및 YZ 평면에서 거의 해결되지 않습니다. (H) P. mirabilis 생물막의 PmbExM 이후 측면 및 직교 보기. 생물막의 박테리아 세포층(노란색 화살촉)과 그 위에 있는 고립된 박테리아(청록색 화살촉)는 쉽게 분해할 수 있습니다. 흰색 막대는 물리적 규모(10μm)를 나타내고 회색 막대는 EF에 의해 정규화된 척도를 나타냅니다. 이 그림은 Castagnini, D. et al.3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

PmbExM은 P. mirabilis에서 뚜렷한 세포 내 DNA 조직 패턴을 보여주었습니다.
PmbExM은 세포 및 초세포 수준에서 생물막 구조에 액세스할 수 있으며 생물막 세포의 세포 내 특징 연구에 대한 유용성을 입증했습니다. PmbExM은 이미지 분석과 함께 세포 내 DNA 조직의 세 가지 다른 패턴을 밝혔습니다: (1) 중앙에서 아보카도 돌과 같은 패턴을 동반하는 세포 경계의 후광과 같은 패턴(그림 4C, D, 각각 노란색 화살촉 및 빨간색 별표); (2) 바실러스 모양의 이종 패턴(그림 4C, E, 노란색 별표); (3) 세포 극에 있는 두 개의 작은 원형 점과 관련된 중심 응집(그림 4E, F, 빨간색 화살촉). 이러한 DNA 조직 패턴 중 어느 것도 기존의 회절 제한 컨포칼 현미경 검사에서는 관찰할 수 없었습니다(그림 4A, B).

그림 4: PmbExM은 생물막 내 세포 특징을 나타냅니다. (A) 회절 제한 컨포칼 현미경으로 캡처한 비확장 P. mirabilis 생물막의 DNA 염색. 녹색 화살표는 (B)에 있는 명암 선 플롯의 방향, 위치 및 거리를 나타냅니다. (B) 녹색 화살표를 따른 상대 거리의 함수로 나타낸 상대 형광 강도의 강도 선 그래프. 세포체 전체에 걸쳐 박테리아 DNA가 균질하게 분포되어 있는 것을 주목하십시오. (씨,이자형) PmbExM에 의해 확장된 P. mirabilis 생물막의 DNA 염색 및 해당 강도 프로파일 플롯(D,F). 색깔이 있는 별표와 화살촉은 박테리아 DNA의 서로 다른 공간 조직을 나타내며, 이는 PmbExM의 해상도 증가로 드러납니다. 다양한 DNA 조직 패턴은 선 플롯의 피크 프로파일로 입증될 수 있습니다. (A,C,E)의 흰색 눈금 막대는 2μm를 나타냅니다. (C,E)의 회색 막대는 확장 계수에 의해 정규화됩니다. 이 그림은 Castagnini, D. et al.3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 확장 현미경에서 효소 분해를 위한 재고 및 작업 솔루션. 표 1: 재고 솔루션. 이 표에는 이 연구에서 설명한 모든 솔루션을 준비하는 데 필요한 재고 솔루션이 나열되어 있습니다. 표 2: 명명된 솔루션. 이 표에는 프로토콜 전체에 사용되는 working solution 및 enzyme stock buffer solution의 이름과 구성이 나열되어 있습니다. 갓 준비된 효소 스톡 버퍼를 사용하여 각각의 효소 스톡 용액을 생성합니다(표 1). 모든 효소 분해 용액은 각 실험 실행 시 준비되고 사용됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 데이터 처리 및 이미지 분석에 대한 세부 정보. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: WEKA 분류기: 확장 전 모델. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 4: WEKA 분류기: 확장 후 모델. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이 작업과 관련된 재정적 또는 개인적 이해 상충이 없음을 선언합니다.