방법 논문

박테리아에서 구리 나노 입자 유도 프로그래밍 된 세포 사멸 연구

DOI:

10.3791/67951

⸱

2025년 5월 16일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine and Biotechnology, College of Medicine, Tzu Chi University, 2Graduate Institute of Microbiology, College of Medicine, National Taiwan University, 3Department of Biological Sciences, Missouri University of Science and Technology

이 논문에서

요약

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구리 나노 입자는 반응성 산소 종을 생성하여 항균제로 작용합니다. 여기에서는 구리 나노 입자가 임상적으로 관련된 세 가지 병원체에 효과적이며 프로그래밍된 특정 세포 사멸 경로가 이 살균 과정에 관여한다는 것을 입증하는 절차가 제시됩니다.

초록

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최근에는 항생제의 과용과 오용으로 인해 다제내성 병원체와 난치성 감염에 대한 우려가 높아지고 있습니다. 금속 및 금속 산화물 나노 입자와 같은 나노 물질은 다제내성 병원체와 싸우기 위한 잠재적인 새로운 전략으로 생물 의학 분야에서 인기를 얻고 있습니다. 본 연구는 약물 내성이 점점 더 커지고 있는 병원에서 흔히 발생하는 3종의 기회감염 병원균인 대장균(E. coli), 아시네토박터 바우마니(A. baumannii), 황색포도상구균(S. aureus)에 대한 구리 나노입자(CuNP)의 사용을 조사했다. 두 가지 크기(20nm 및 60nm)의 CuNP를 합성하고 콜로니 분석을 통해 살균 효능을 평가하기 위한 자세한 프로토콜이 제시됩니다. CuNP의 기저에 있는 항균 작용 메커니즘은 반응성 산소 종 생산의 변화를 평가하여 탐구되었습니다. 또한, 박테리아 사멸에 프로그래밍된 세포 사멸(PCD) 경로의 잠재적 관여를 연구하기 위해 인간 단백질 기능을 억제하는 4가지 조절제를 적용했습니다. 이 접근 방식을 통해 구리 의존성 전사 조절자를 포함한 구리 항상성 단백질에 대한 연구를 기반으로 구리 내성 균주의 잠재적인 출현을 제안합니다. 이러한 발견은 CuNP의 살균 효과와 항생제 내성 해결에 대한 잠재적인 역할을 연구하기 위한 포괄적인 방법론을 제공합니다.

서론

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약물 내성 박테리아는 의학계에서 심각한 우려 사항이다. 이 항생제의 급속한 출현은 기존 항생제의 효능을 감소시켜 더 많은 임상 합병증을 초래했습니다. 이는 공중 보건에 큰 위협이 되며 새로운 항균제에 대한 긴급한 필요성을 야기합니다. 연구 분야 중 하나는 나노 물질입니다. 나노 물질은 생존 능력을 손상시키는 방식으로 미생물과 상호 작용할 수 있는 고유한 물리화학적 특성을 가지고 있습니다. 예를 들어, 은 나노 입자(AgNP)는 박테리아에 산화 스트레스를 유발하여 단백질 기능 장애, 막 파괴, DNA 손상 및 궁극적으로 세포 사멸을 초래합니다1. 반면에 금 나노 입자(AuNP)는 항진균 특성으로 알려져 있으며 운반체 역할을 하여 항생제의 살균 효과를 향상시킬 수 있습니다2.

또한 구리 나노 입자(CuNP)도 강력한 항균 효과와 낮은 생산 비용으로 인해 상당한 주목을 받고 있습니다. 연구에 따르면 CuNP는 효소 활성의 중단과 활성 산소 종(ROS)의 생성에 의해 광범위한 살균 활성을 나타냅니다3. CuNP의 양전하는 박테리아로의 침투를 촉진하여 세포 흡수를 향상시킵니다4. 이 메커니즘으로 인해 CuNP는 감염을 예방하기 위해 임플란트와 같은 표면 코팅에 대한 유망한 옵션입니다3. 그러나 한 가지 흥미로운 발견은 CuNP의 살균 효과가 크기에 따라 달라지는 것으로 보인다는 것입니다. 일부 연구에서는 CuNP가 작을수록 항균 활성이 더 높다는 사실이 밝혀졌는데, 이는 표면적 대 부피 비율이 우수하기 때문일 수 있습니다5.

ROS 생성은 지질 과산화, 단백질 기능 장애, DNA 단편화, 포도당 신생합성/글리코겐분해 억제를 포함하여 세포와 박테리아에 광범위한 손상을 일으키며 괴사 또는 프로그래밍된 세포 사멸(PCD)6,7,8에 관여합니다. 최근 연구에 따르면 PCD 시스템은 박테리아에 존재하며, 진핵 시스템과 유사한 작용 모드 및 효과기가 존재합니다9. 박테리아 군집은 독소-항독소(TA) 시스템을 통해 산화 스트레스를 포함한 스트레스에 대한 반응으로 PCD를 유도할 수 있습니다10. 간단히 말해서 독소-항독소 시스템은 필수 세포 과정을 방해할 수 있는 독소와 독소와 안정적인 복합체를 형성하여 정상적인 성장 조건에서 독성을 억제할 수 있는 항독소로 구성됩니다. 대부분의 박테리아와 고세균은 게놈에 TA 유전자좌를 포함하고 있으며, 종종 염색체 외 및 염색체 DNA의 여러 사본에 존재합니다. TA 시스템에는 여러 유형이 있으며, 특히 유형 II TA(MazE/MazF 모듈이라고 함)가 중요합니다. 스트레스 상태에서는 항독소가 분해되어 독소가 세포 표적을 억제할 수 있습니다. 대장균(E. coli)과 황색포도상구균(S. aureus)에서 독소인 MazF는 산화 스트레스, 고온, 아미노산 결핍과 같은 스트레스 조건에 반응하여 활성화됩니다. 결과적으로 항독소 MazE의 발현이 감소하여 독소 MazF10이 방출됩니다. 연구에 따르면 MazF는 대부분의 인구가 mazEF 매개 세포 사멸을 겪는 동안 소수의 하위 집단이 불리한 조건에서 생존할 수 있도록 하는 단백질의 합성을 가능하게 합니다. 이 세포 사멸은 ROS가 전사 또는 번역 억제를 유도하는 ROS 의존성 또는 DNA 손상이 사멸 경로를 유발하는 ROS 독립적일 수 있습니다11.

이 연구는 CuNP가 박테리아 사멸을 유도하는 메커니즘을 탐구합니다. TA 시스템에만 초점을 맞추는 대신, 이전에 본 연구에서 사용된 4개의 PCD 조절제 7,12를 사용하여 박테리아의 잠재적인 PCD 경로를 조사했습니다.

본 연구는 서로 다른 농도에서 두 가지 크기(20 및 60nm)의 CuNP의 살균 효과를 조사하고 콜로니 분석, ROS 검출 및 PCD 조절제(SBI, Z-VAD, NSA 및 Wortmannin)와 같은 방법을 활용함으로써 PCD가 다세포 유기체에만 국한되지 않고 스트레스를 받는 박테리아 군집에서도 발생한다는 점을 강조합니다. 이 연구는 상세한 프로토콜을 제공함으로써 연구자들이 자신의 시스템에서 CuNP 효능 및 살균 메커니즘을 평가할 수 있도록 하는 것을 목표로 합니다. 또한, 이러한 발견은 세균성 PCD에 대한 이해를 증진하고 항생제 내성 박테리아와 싸우기 위한 CuNP 기반 치료법의 개발을 지원합니다.

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프로토콜

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이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 구리 나노 입자의 제조

  1. 상업용 소스에서 상업용 구리 나노 분말 (25 nm 및 60-80 nm)을 얻습니다.
  2. 1.0mM 도데실황산나트륨(SDS)을 두 가지 크기의 1mg/mL 나노입자에 대한 분산제로 사용합니다.
  3. 실온에서 최소 30분 동안 초음파 수조를 사용하여 나노 입자를 분산시킵니다. 그런 다음 완전히 분산된 나노 입자는 후속 실험에 사용할 준비가 됩니다.

2. 박테리아의 준비

  1. American Type Culture Collection에서 E. coli (Migula) Castellani 및 Chalmers 균주 25922 및 A. baumannii Bouvet 및 Grimont 균주를 얻습니다. 생물자원 수집 및 연구 센터(Bioresource Collection and Research Center)에서 S. aureus 를 입수합니다.
  2. 37 °C의 호기성 조건에서 Luria-Bertani (LB) 육수에 박테리아를 배양합니다.
  3. LB 배지의 박테리아 배양액을 600nm(OD600)에서 약 0.5의 광학 밀도로 희석합니다.

3. 세포 생존율 평가

  1. 콜로니 분석
    1. 스톡 CuNP 용액(1mg/mL)을 사용하여 0μg/mL, 1μg/mL, 5μg/mL, 10μg/mL, 50μg/mL 및 100μg/mL를 포함한 두 가지 크기의 CuNP의 다양한 농도를 준비합니다.
    2. 2.3단계에서 준비한 박테리아 배양액을 마이크로 원심분리기 튜브로 분리하고 실온에서 10 분 동안 3300 ×g으로 원심분리합니다.
    3. 박테리아 펠릿을 유지하고 부드러운 피펫팅으로 각각 두 가지 크기의 CuNP를 다른 농도로 첨가합니다.
    4. 박테리아 펠릿을 PBS 및 70% 알코올로 각각 음성 및 양성 대조군으로 처리합니다.
    5. 처리된 모든 박테리아를 200rpm, 37°C에서 24시간 동안 진탕하여 배양합니다.
    6. 배양 후 처리된 모든 박테리아를 PBS로 세척하고 LB 한천 플레이트에 펴 바릅니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 24시간 동안 놓습니다.
    7. 다음 날 각 치료 그룹의 군집 수를 세고 통계 분석을 수행합니다. 통계적 정확성을 위해 이 작업을 세 번 수행하는 것이 좋습니다.
  2. 살균 메커니즘 연구
    1. 3.1.2 단계에서 설명한대로 박테리아를 준비하고 2 시간 동안 5 μM의 SBI-0206965 (SBI), 1 시간 동안 0.5 μM의 네크로 설 폰 아미드 (NSA), 30 분 동안 100 nM의 워트 마닌 (맥아 즙) 또는 30 분 동안 100 nM의 Z-VAD-FMK (Z-VAD)로 처리합니다.
    2. 3.1.1단계에서 설명한 바와 같이 5μM의 SBI, 0.5μM의 NSA, 100nM의 Wort 및 100nM의 Z-VAD의 존재 여부에 관계없이 두 가지 크기의 CuNP 용액의 농도가 다른 박테리아를 공동 처리합니다.
    3. 조절제 처리 후(3.2.1단계) 박테리아를 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
    4. 3.2.2단계에서 준비한 용액에 박테리아 펠릿을 재현탁시키고 24시간 동안 37°C에서 200rpm으로 진탕하면서 배양합니다.
    5. 박테리아를 각각 70% 에탄올과 PBS를 양성 및 음성 대조군으로 처리합니다. 각 그룹에 대해 동일한 억제제 조건에서 CuNP 블랭크 대조군(0μg/mL, 모의)으로 CuNP가 없는 용액을 사용합니다. 모든 샘플을 추가로 24시간 동안 배양합니다.
    6. 배양 후, 세포 생존율 시약을 1:10 부피 비율로 배양액에 첨가합니다. 37 ° C에서 흔들면서 2 시간 동안 배양물을 더 배양합니다.
    7. 배양 후 배양물을 원심분리(단계 3.1.2) 2시간 배양 후. 형광 상등액을 96웰 플레이트로 옮깁니다. 마이크로플레이트 리더로 560nm의 excitation 파장과 590nm의 방출 파장을 사용하여 형광을 측정합니다.
    8. 남은 상등액을 10-5 및 10-4 로 희석하고 배양을 위해 LB 한천 플레이트에 펴 바릅니다.
    9. 다음 날 단일 식민지를 계산합니다.

4. 활성산소종의 검출

  1. 2.3단계에서 설명한 대로 박테리아 배양을 준비하고 마이크로 원심분리기 튜브로 분리합니다.
  2. 다양한 스트레스 조건을 가진 박테리아를 ROS 유도 양성 대조군으로 처리합니다(데이터는 결과에 표시되지 않음). 치료법은 4.2.1-4.2.4 단계에 설명되어 있습니다.
    1. 박테리아를 405nm 자외선에 3시간 동안 노출시킵니다. 박테리아를 45°C에서 2시간 동안 배양합니다.
    2. 그런 다음 4°C에서 2시간 동안 박테리아를 배양합니다.
    3. 30분 동안 3% H2O2 로 박테리아를 처리합니다.
    4. LB 육수에 있는 박테리아를 음성 대조군으로 37°C로 유지하십시오.
  3. 3.1.1 단계에서 설명한대로 다양한 농도의 CuNP를 준비하고 24 시간 동안 1 μg / mL, 5 μg / mL, 10 μg / mL 및 100 μg / mL 농도의 20 nm 또는 60 nm CuNP로 박테리아를 처리합니다.
  4. 배양된 박테리아를 PBS로 두 번 세척하여 남아 있는 나노 입자를 제거합니다.
  5. 5μM의 최종 농도에서 PBS에서 2",7"-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) 염료를 준비합니다.
  6. 박테리아 펠릿을 5μM의 H2DCFDA에 재현탁시키고 유세포 분석기를 사용하여 520/30nm 방출에서 형광 강도를 측정합니다.
    참고: FL1 녹색 형광의 강도는 처리된 배양액의 ROS 수준과 관련이 있습니다. 통계적 정확성을 위해 이 작업을 세 번 수행하는 것이 좋습니다.

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결과

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3가지 병원체에서 2가지 크기의 CuNP의 항균 활성
CuNP의 살균 활성을 테스트하기 위해 세 가지 기회 병원체(E. coli, S. aureus 및 A. baumannii)를 사용했습니다. 박테리아를 0 μg/mL, 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL 및 100 μg/mL의 20 nm 또는 60 nm CuNP로 처리하고, 군집 수에서 파생된 최소 살균 농도(MBC)를 사용하여 살균 활성을 측정했습니다. 우리의 결과는 세 가지 균주 모두에 대해 두 가지 크기의 CuNP(그림 1)에서 긍정적인 살균 효과를 보여주었습니다. 대장균에서 20nm 및 60nm CuNP 처리에 대해 각각 1μg/mL 및 5μg/mL에서 시작하여 콜로니 수의 현저한 감소가 관찰되었습니다(그림 1A). 대조적으로, ...

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토론

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이 연구는 E. coli, S. aureus 및 A. baumannii에 대해 두 가지 크기와 다양한 농도에서 CuNP의 항균 효과와 메커니즘을 조사했습니다. 확립된 프로토콜을 사용하여 CuNP 유도 살균 효과가 산화 스트레스 및 잠재적인 PCD 활성화를 포함하는 것으로 관찰되었습니다. 그러나 금속 항상성과 박테리아 스트레스 반응 사이의 상호 작용은 대부분 연구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이전 연구에서는 구리 유출 펌프 및 금속 결합 단백질과 같은 박테리아 저항성 전략을 확인했으며, 이는 CuNP 감수성에 영향을 미칠 수 있습니다19. 또한, 구리 이온의 잠재적인 세포 독성은 치료 응용 분야에서 여전히 우려 사항으로 남아 있어 신중한 투여량 최적화의 필요성이 강조됩니다20. CuNP의 살균 메커니즘에 대한 심층적인 이해는 CuNP의...

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공개 사항

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저자는 재정적 또는 기타 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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대만 Tzu Chi University의 핵심 시설 센터의 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Acinetobacter baumannii Bouvet 및 Grimont 균주 American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA17978CuNP 독성 실험을 위한 박테리아
Bio-Rad iMark 마이크로플레이트 리더Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA168-1130박테리아 생존율 분석에서 흡광도를 측정하는 데 사용됩니다.
세포 투과성 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트  (H2DCFDA)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USAD6883처리된 박테리아 세포에서 활성 산소종(ROS)을 검출하는 데 사용됩니다.
구리 나노입자(CuNP) 25 nmSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA774081CuNP 원액 제조에 사용
리 나노입자(CuNPs) 60-80 nmSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA774103CuNP 원액 제조에 사용
Escherichia coli (Migula) Castellani and ChalmersAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA25922CuNP 독성 실험을 위한 박테리아
Gallios 유세포 분석기Beckman Coulter, Brea, CA, USA활성 산소종 검출을 포함한 여러 실험에서 유세포 분석에 사용됩니다.
LB 한천FocusBio, Miaoli, TaiwanLBA500박테리아 배양에 사용
Luria-Bertani(LB) 국물Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA244620박테리아 배양에 사용
Necrosulfonamide(NSA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA480073박테리아 사멸 경로 연구에서 전처리를 위한 조절제로 사용됩니다.
PrestoBlue 세포 생존율 시약Invitrogen, Carlsbad, CA, USAP50200형광을 통해 세포 생존율을 평가하는 데 사용됩니다.
SBI-0206965 (SBI)BioVision, Milpitas, CA, USA9580박테리아 사멸 경로 연구에서 전처리를 위한 조절제로 사용됩니다.
데실황산나트륨(SDS)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAL4509응집을 줄이기 위해 구리 나노입자의 분산제로 사용됩니다.
황색포도상구균American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA
Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan		13567CuNP 독성 실험을 위한 박테리아
Varioskan LUX 다중 모드 마이크로플레이트 리더Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAVLBLATGD2세포 생존율 분석에서 형광 측정에 사용
Wortmannin (Wort)Abcam, MA, USAab120148박테리아 사멸 경로 연구에서 전처리를 위한 조절제로 사용됩니다.
Z-VAD-FMK (Z-VAD)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAV116박테리아 사멸 경로 연구에서 전처리를 위한 조절제로 사용됩니다.
구도기

참고문헌

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  18. Solioz, M. Copper and Bacteria: Evolution, Homeostasis and ToxicitySpringerBriefs in Molecular Science. Chapter 3, Springer. Cham. 21-48 (2018).
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