여기서 보고된 TCID50 분석법은 라벨 없는 실시간 임피던스 측정과 시스템의 바이러스학 모듈을 활용하여 바이러스 유발 세포병리 효과(CPE)를 실시간으로 객관적으로 모니터링합니다. 이 간소화된 분석법은 직접 손을 대고 작업하는 시간을 크게 줄이면서 고처리량의 정량적 동역학 CPE 측정을 지원하고 자동화된 실시간 TCID50 계산을 가능하게 합니다.
방법 논문
임피던스를 이용한 자동화된 바이러스 역가 정량을 위한 간소화되고 라벨이 없는 실시간 50% 조직 배양 감염 선량(TCID50) 분석법
이 논문에서
요약
초록
바이러스 역가, 즉 샘플 내 바이러스 농도를 측정하는 것은 바이러스학 연구에서 기본적인 절차입니다. 필수적이지만, 플라크 분석법과 TCID50 분석법과 같은 전통적인 방법은 시간이 많이 걸리고, 시약을 염색하거나 라벨링해야 하며, 특히 세포병리 효과(CPE)가 미묘하거나 영상으로 정량화하기 어려운 경우 주관적인 해석이 자주 발생합니다. 예를 들어, TCID50 검사는 MTT나 MTS와 같은 생존성 염료를 사용할 수 있지만, 플라크 검사는 영상 검사와 염색을 통해 바이러스 플라크를 시각화하는 데 의존하는데, 이 두 경우 모두 변동성을 초래할 수 있습니다. 더불어, 이러한 전통적인 방법들은 바이러스 감염성의 정적인 스냅샷만 제공해 바이러스와 허용 세포 간의 동적 상호작용을 포착하는 능력을 제한합니다. 바이러스 역가 측정의 현재의 한계를 극복하기 위해, 임피던스 기반 기술을 활용한 간소화된 TCID50 분석법이 개발되어 객관적이고 비침습적이며 실시간으로 CPE를 측정하여 라벨의 필요성을 없애게 되었습니다. 본 연구에서는 두 가지 바이러스 허용 세포 모델을 사용하여 임피던스-TCID50 검사법을 검증하였는데, HEK293A 세포에서는 GFP 표지 아데노바이러스(Adv-GFP)와 MDCK 세포 내 인플루엔자 A 바이러스(IAV)입니다. 워크플로우는 세포 시딩, 바이러스 접종, 실시간 모니터링, 소프트웨어에 의한 TCID50 자동 분석을 포함하는 단순합니다. 감염 기간 동안 TCID50 값은 시스템 소프트웨어에 의해 Reed-Muench 공식을 사용하여 모든 기록된 시점에서 자동으로 계산되었습니다. 임피던스 판독 을 통해 얻은 IAV의 TCID50 값은 기존 결정 바이올렛 염색 기반 TCID50 분석법과 유사했습니다. 이 결과들은 시스템 소프트웨어의 바이러스학 모듈과 임피던스 측정을 결합하여 바이러스 정량화를 정밀하고 효율적으로 달성할 수 있음을 보여줍니다. 이 새로운 분석법은 전통적인 방법을 간소화하는 동시에 바이러스 역학에 대한 통찰을 강화하여 첨단 바이러스학 연구를 지원하고 임상 응용 가능성을 확장합니다.
서론
바이러스학 연구가 빠르게 발전함에 따라, 바이러스 감염성의 정확한 정량화는 바이러스 기전 이해, 항바이러스 치료제 개발, 백신 효능 평가에 매우 중요합니다. 가장 중요한 절차 중 하나는 샘플 내 바이러스 입자의 농도인 바이러스 역가를 측정하는 것입니다. TCID50 분석법은 접종된 세포의 50%에서 CPE를 생성하는 데 필요한 감염성 바이러스 입자 수를 정량화하며, 기능성 바이러스 역가를 결정하는 데 가장 널리 사용되는 방법 중 하나입니다. 이 널리 사용되는 종점 분석법은 플라크를 형성하지 않는 바이러스에 특히 유용하며, 플라크 분석1의 대안으로 활용될 수 있습니다.
일반적으로 TCID50 분석은 바이러스와 허용 세포에 따라 2일에서 14일 정도 소요됩니다. 세포 증식, 형태 및 생존율의 변화를 포함한 CPE는 (1) 시약 첨가 후 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 및 MTS(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메토시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨) 등의 시약 첨가 후 비도 측정을 통해 판독기2를 사용하여 평가합니다또는 (2) 광학 영상 플랫폼을 이용한 형태학적 또는 배양 관련 변화의 시각적 평가 — 예를 들어, CPE를 측정하여 수렴률3을 측정하거나, (3) 바이러스 처리된 웰을 포르말린 또는 파라포름알데히드(PFA)로 고정한 후 결정 바이올렛 염색을 통한 CPE의 시각적 검출. 각 바이러스 희석에서 CPE 양성 복제 수에서 도출되는 양성 감염률이 TCID50 계산의 근거입니다. 배양의 50%가 CPE를 보이는 희석은 Reed-Muench, Spearman-Karber, Improved-Karber와 같은 확립된 공식4를 사용하여 통계적으로 계산되며, 결과는 TCID50/밀리리터(TCID50/mL)로 보고됩니다.
전통적인 TCID50 및 플라크 검사는 기능성 바이러스 정량의 금본위로 널리 인정받고 있으며, 귀중한 통찰을 제공할 수 있습니다. 하지만 이러한 분석은 종종 번거롭고 시간이 많이 소요되며, CPE를 시각화하기 위해 수작업 염색이 필요해 처리량이 낮고 인간 오류 위험이 증가하며 주관성이 높아집니다. 감염성이 매우 크거나 치명적인 바이러스의 경우, 바이러스 노출 시간을 최소화하고 염색과 같은 추가 단계에서 발생하는 바이러스 함유 폐기물을 줄이는 것이 생물안전성 향상을 위한 중요한 고려사항입니다. 라벨 없는 영상 기반 TCID50 검사를 제외하고, 대부분의 TCID50 및 플라크 검사는 종료점 검사(endpoint assay)이기도 하여, 역가 평가 시기가 최적이 아니고 바이러스와 숙주 세포 간의 동적 상호작용 관찰 능력을 제한할 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 간소화되고 라벨이 없으며 실시간 TCID50 분석법이 개발되고 확립되었습니다. 개념적으로는 기존 TCID50 검사와 유사하지만, 이 새로운 방법은 RTCA MP 시스템이 캡처 및 분석한 세포 임피던스 판독값을 활용하여 감염을 객관적이고 지속적으로 시간에 따라 모니터링합니다.
임피던스 기반 생체감각이 세포 수, 형태, 세포-기질 부착 강도를 표지 없이, 비침습적으로 정성적·정량적으로 복합적으로 읽어낼 수 있음이 입증되고 검증되었습니다 5,6. 이전 연구들은 RTCA 임 피던스측정 7,8,9를 사용하여 바이러스 유발 CPE를 실시간으로 정확히 정량화할 수 있음을 입증했습니다. 원시 임피던스 값을 보고하는 대신, 셀 인덱스(CI)라는 단위 없는 매개변수를 사용하여 셀 이벤트로 인한 임피던스 변화를 반영합니다. 예를 들어, 세포가 우물 바닥에 부착하고 퍼져 성장함에 따라 CI가 증가합니다. 반대로, 세포가 죽거나 축소되거나 바이러스 감염 시처럼 분리될 때 CI는 감소합니다.
임피던스를 이용한 CPE 측정 유망한 보고를 고려할 때, 본 연구는 임피던스 기반 TCID50 분석법이 기존 바이러스 정량에 대한 신뢰할 수 있고 정확한 대안임을 입증하고자 했습니다. 시스템 소프트웨어의 바이러스학 모듈은 실시간 CPE 측정 전반에 걸쳐 TCID50 자동 계산을 가능하게 하여 분석 과정을 간소화하고 단축하며, 바이러스 복제 동역학과 허용 세포와의 상호작용에 대한 귀중한 통찰을 제공합니다.
프로토콜
시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 임피던스 기반 TCID50 분석법
참고: 그림 1 에서 볼 수 있듯이, 임피던스 기반 TCID50 분석은 생물센서 플레이트에 허용된 세포 시딩, 바이러스 희석 준비 및 접종, 시스템 내 CPE 측정, 그리고 시스템 소프트웨어의 바이러스학 모듈을 이용한 데이터 분석 및 TCID50 계산을 포함하는 네 단계로 구성됩니다.
- 분석물 준비: 부활 및 하위 배양 허용 세포
참고: 이 단계는 분석 일주일 전에 수행되어야 합니다. 실험 간 변동을 최소화하기 위해, 동일한 통과 번호를 가진 허용 세포 뱅크를 준비하여 분석에 사용할 것을 강력히 권장합니다. 구매 후 15통 이상 된 세포는 사용하지 마십시오.- 해동 보존 허용 세포
- 37°C 물욕에서 따뜻한 세포 배지를 최소 30분간 보관하세요. 예를 들어, 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충한 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)가 HEK293A 배양에 사용되었습니다.
- TCID50 분석을 위해 세포 뱅크에서 세포 바이알을 해동하여 37°C 물욕에서 1-2분간 부드럽게 돌려 몇 개의 얼음 결정이 나타날 때까지 보존합니다; 캡을 잠기지 마세요. 70% 에탄올로 바이알을 닦고 라미나 후드에 넣으세요.
- 세포를 새로운 50 mL 원뿔 튜브로 부드럽게 옮기고, 가열한 배지 9mL를 세포에 추가하세요.
- 셀 현탁액을 300 x g 에서 실온에서 4분간 원심분리합니다.
- 상청액을 버리고 세포를 15mL의 가열된 성장 배지에 재현탁합니다. 새 T75 플라스크로 옮기세요.
- 37°C 인큐베이터에서 5%CO2로 세포를 80%-90% 융합률로 배양합니다.
- 허용 세포의 아위배양.
- 세포가 80%-90% 융합률에 도달할 때까지 모니터링하세요.
- 플라스크에서 혈청 함유 배지를 제거하고, Mg 및 Ca-프리 Dulbecco's 인산염 완충 식염수(DPBS)로 세포 단층을 한 번 부드럽게 헹군습니다.
- T75 플라스크당 0.05% 트립신/EDTA 용액 2mL를 고르게 분포하고, 플라스크를 37°C 인큐베이터에 1-3분간 두어 세포를 트립신 생성합니다.
참고: 세포를 과도하게 트립신화하지 마세요. 이는 세포에 해로울 수 있습니다. - 원래 트립신 부피를 최소 5배 희석하기 위해 8 mL 혈청 함유 배지를 첨가하여 트립신 생성을 멈추세요. 세포 현탁액 2.5mL를 새로운 T75 플라스크에 옮긴 후 8mL의 배양지를 추가합니다.
참고: TCID50 분석에 신선히 해동된 허용 세포 사용을 피하세요. 대신 80%-90% 합류 비율의 배양 세포를 사용하세요. 실험 간 변동성을 줄이기 위해 부활한 세포는 해동 후 최대 2주간 유지해야 합니다. 2주 배양 기간 동안 높은 세포 생존성과 증식을 보장하기 위해: (1) 매개체를 주 2회 이상 교체; (2) 세포 세포가 80%-90% 합류율에 도달할 때. 2주 이상 연장 유지보수를 위해서는 검증이 필요합니다.
- 해동 보존 허용 세포
- 바이러스 역가
참고: 이 단계는 첫날에 수행해야 합니다.- 바이오센서 플레이트 배경 측정
- 각 웰에 50μL의 예열된 매체를 다채널 피펫을 사용해 조심스럽게 전달하며, 역피펫 기법을 사용해 기포 형성을 최소화하고 일정한 부피 분배를 보장합니다.
- 플레이트를 플레이트 스테이션에 넣으세요; 시스템 소프트웨어를 열고 실험을 시작하기 전에 바이러스학 모듈을 선택하세요. 경험 노트 탭에 관련 노트를 입력하고, 해당 우물을 선택한 후 레이아웃 탭의 셀 서브탭에서 셀 이름과 번호 등 셀 정보를 입력하세요. 또는 시드 후에 셀 정보를 입력할 수도 있습니다.
참고: 플레이트 배경 측정은 플레이트의 웰에 셀을 추가하기 전에 반드시 이루어져야 합니다. 모든 우물의 배경 측정값은 -0.063에서 0.063 사이여야 합니다. - 일정 탭에서 'Step 추가' 버튼을 클릭하면 판 배경 측정을 위한 Step 1을 추가합니다. 그 다음 시작 버튼을 클릭하여 녹화를 시작하세요.
- 스테이션에서 플레이트를 분리해서 후드에 다시 넣어 세포 시딩을 하세요.
- 허용 세포 시딩을 96웰 바이오센서 플레이트에 적용
- T75 플라스크에서 허용 세포를 트립신화하세요.
- 셀 수를 세고 원하는 농도로 셀 부유액을 조절하세요. 이 연구에서 HEK293A 농도는 60,000 세포/mL였습니다.
- 플레이트의 각 웰에 100 μL의 셀 현탁액을 추가합니다.
참고: 적절한 셀 밀도가 필수적입니다. 최적이 아닌 파종 밀도는 실험적 인공물을 만들 수 있습니다. 따라서 TCID50 분석을 수행하기 전에 시딩 밀도를 최적화해야 합니다. - 셀 추가 후 플레이트를 후드에 30분간 실온에 두어 셀들이 웰 바닥에 고르게 분포되도록 하세요.
참고: 이 단계를 수행하지 않으면 우물 간 큰 변동이 발생할 수 있습니다. - 플레이트를 5%CO2가 포함된 37°C 인큐베이터 내 플레이트 스테이션에 넣습니다.
- 소프트웨어의 스케줄(Schedule ) 탭으로 이동하여 기본 녹화 설정인 100회 스윕과 15분 간격으로 2단계를 추가하세요. 이 시스템은 15분마다 임피던스/CI 모니터링을 시작하여, 바이러스 접종 전 세포 품질 관리(QC) 단계로서 세포 부착 및 증식을 실시간으로 평가할 수 있게 합니다.
참고: 2일차 - 실험 간 재현성과 일관성을 극대화하기 위해서는 다음 단계로 진행하기 전에 시스템에서 세포 성능을 평가하는 것이 매우 중요합니다. CI는 세포 부착과 성장을 반영하기 때문에, 파종 후 20-28시간 동안 CI는 핵심 품질 관리 기준 역할을 합니다. CI의 가치와 운동학은 세포 특이적입니다. 본 연구에서는 웰당 6,000 세포로 시딩하고 20-28시간 배양한 HEK293A 세포의 CI가 2를 초과해야 합니다. 시드 후 20-28시간 이내에 CI가 2에 도달하지 못하면 HEK293A 세포 배양은 품질 관리(QC)에 실패한 것으로 간주되며, 이후 TCID50 분석은 수행되지 않습니다. 이 기준은 실험 결과의 높은 재현성을 보장합니다.
- 바이러스 연쇄 희석 제조
- 희석액을 준비하는 데 필요한 배지(DMEM + 2% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신)의 총 부피를 계산한 후, 37°C 물욕에서 30분간 데웁니다. 이 매체는 실험의 나머지 부분에 사용될 것입니다.
- 분리된 바이러스 비알을 37°C 물욕에서 1-2분간 빠르게 녹여 모든 얼음 결정이 녹을 때까지 합니다.
- 각 단계에서 180 μL의 예열된 배지를 담은 1.5mL 마이크로 원심분리관에 바이러스 20 μL을 옮겨 10배 연속 희석 바이러스를 준비합니다. 배지와 바이러스가 충분히 섞이도록 피펫을 위아래로 움직여 보세요.
참고: 과도한 바이러스 입자 잔류물이 팁 밖으로 나가지 않도록 피펫 팁을 바이러스 용액에 너무 깊이 담그지 마세요. 이는 희석 정확도가 떨어질 수 있습니다. - 감기 바이러스 샘플 첨가로 인한 임피던스 측정값 변동을 방지하기 위해, 바이러스 희석을 37°C에서 5%CO2 와 함께 인큐베이터에서 20분간 배양하여 접종 후 평형을 맞추세요.
- 레이아웃 탭에서 바이러스 처리 정보를 입력하세요
- 소프트웨어의 플레이트 레이아웃 탭에서; 바이러스 역가 처리를 위한 웰을 선정하고; 서브탭 Treatment를 클릭하고 초기 희석(예: 이 실험에서 0.001 (10-3)을 입력; 10 을 "희석 계수"로 등장시키고; 희석 방향을 왼쪽에서 오른쪽으로 선택하세요. 바이러스 희석도는 플레이트 레이아웃 입력을 기반으로 자동으로 계산되어 각 웰에 표시됩니다.
- 다음으로 바이러스 접종량 을 입력하고 '적용' 버튼을 클릭하여 모든 치료 정보를 저장하세요. 이 단계는 데이터 분석 중 TCID50/mL를 정확히 계산하는 데 필수적입니다.
- 바이러스가 처리되지 않는 웰을 음의 대조군으로 할당하려면 적절한 웰을 선택한 후 처리 탭의 웰 유형 내 네거티브 컨트롤을 선택하세요.
참고: 네거티브 컨트롤 우물은 지정하여 레이아웃 페이지에 추가해야 합니다; 누락하면 TCID50 계산이 불가능합니다.
- 바이러스 접종
- 준비가 되면 소프트웨어에서 일 시정지 버튼을 눌러 데이터 수집을 중지하세요. 스테이션에서 플레이트를 분리하여 층상 후드에 넣으세요.
- 멀티채널 피펫을 사용해 플레이트의 웰에서 배양 배지를 조심스럽게 제거하세요.
- 세포 배양 방해를 방지하기 위해 다채널 피펫을 이용해 세포 단층 상단에 50 μL 바이러스 희석액을 부드럽게 첨가합니다.
- 플레이트를 스테이션에 다시 넣고 기본 녹화 설정(100회 스윕과 15분 간격)으로 Schedule 탭에서 Step 3을 추가하면 2시간 동안 15분마다 임피던스 녹화를 재개하여 바이러스가 세포에 결합할 수 있습니다.
- 바이러스 접종 2시간 후 녹화를 일시정지하고 판을 스테이션에서 층상 후드로 옮기세요.
- 멀티채널 피펫을 사용해 웰에 150 μL의 예열된 배지를 천천히 첨가하여 세포 단층 손상을 방지합니다; 번호판을 역에 돌려주세요.
- 일정 탭에서 시작을 클릭하여 3단계를 재개하세요. 임피던스 신호는 접종 기간 동안 15분마다 지속적으로 측정됩니다.
- TCID50 분석이 완료된 후 또는 검사 중 또는 완료 후에 계산
- 데이터 분석 탭에서 분석에 사용된 모든 웰을 선택하여 그래프 차트에 추가하세요. 차트의 y축은 Y축 드롭다운 메뉴에서 선택한 옵션에 의해 결정됩니다.
- 파라미터 섹션으로 이동하세요. TCID50 계산을 시작하려면 매개변수 드롭다운 목록에서 TCID50을 선택하세요.
- 특정 시점에서 TCID50 계산을 위해 막대 차트 를 선택하거나, 예방접종 중 원하는 기간 동안 TCID50 시간 흐름을 생성하려면 시간 의존 TCID50 을 선택하세요. 실행 버튼을 클릭하면 TCID50/mL가 계산되어 표시됩니다.
- 바이오센서 플레이트 배경 측정
2. 크리스탈 바이올렛-TCID50 분석법
- 임피던스 기반 TCID50 분석법(1-2단계)에서 설명된 최적의 시딩 밀도로 96웰 마이크로플레이트 내에 허용 세포를 시딩합니다.
- 임피던스 기반 TCID50 분석법에 따라 바이러스 연속 희석 준비 및 접종을 수행합니다.
- 고정과 염색
- 분석 완료 후에는 각 웰에서 상청액을 부드럽게 제거하고 4% 포름알데히드 100 μL를 추가하여 세포를 고정합니다.
- 4 °C에서 1시간 배큐한 후 고정제를 제거하세요.
- 고정된 세포를 PBS로 준비한 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색합니다. 실온에서 30분간 부양하세요.
- 접시를 수돗물로 씻어 배경이 깨끗해질 때까지 하세요. 점수를 새기기 전에 접시를 완전히 자연 건조시키세요.
참고: 크리스탈 바이올렛 폐기물은 RCRA와 캘리포니아 규정집(CCR 66261.24) 모두에서 유해로 간주됩니다. 사용한 크리스탈 바이올렛 용액, 오염된 물질(예: 종이 타월, 장갑)을 모두 수집하고, 지정된 유해 폐기물 용기에 헹구세요. 폐기물은 기관의 환경 보건 및 안전(EH&S) 또는 공인 유해 폐기물 처리 업체를 통해 처리하세요.
- 점수 산정 및 TCID50 계산
- 각 우물을 육안으로 점검하여 CPE 여부를 확인하세요. 양성 우물은 부분적 또는 완전한 단일층 파괴와 더 가벼운 염색을 보입니다. 음정은 짙은 보라색 염색이 있는 온전한 단일층을 유지합니다.
- 각 희석에 대해 양정과 음정의 수를 세어보세요.
- 접종량 150 μL를 기준으로 리드-뮌치 방법을 사용해 TCID50/mL를 수동으로 계산합니다.
결과
임피던스를 이용한 바이러스 매개 CPE의 라벨 없이, 실시간 동적 모니터링
바이러스 유발 CPE가 임피던스로 신뢰성 있고 정량적으로 측정될 수 있음을 확인하기 위해, 우리는 먼저 Adv-GFP 감염 후 HEK293A 세포의 세포 변화를 기록했습니다. 이 시스템은 임피던스를 측정하고 동일한 세포군의 생세포 이미지를 동시에 캡처하여 세포 행동에 대한 통찰력 있는 정보를 제공합니다. HEK293A 세포는 96웰 바이오센서 플레이트에 6,000 세포/웰 시딩 밀도로 24시간 동안 시딩된 후, 104 IFU/mL의 Adv-GFP에 감염되었습니다. 접종 후 250시간 동안 임피던스와 생세포 영상이 기록되었습니다(그림 2A). 세포 시딩의 차이로 인한 변동성을 최소화하고 처리 후 상대적 변화를 밝히기 위해, 정규화된 세포 지수(NCI)를 사용해 시간이 지남에 따른 세포 성장, 부착 및 생존력의 집단적 변화를 나타냅니다. NCI는 특정 시점의 CI를 정규화 시점(접종 전)의 CI로 나누어 계산합니다. 감염되지 않은 대조군의 NCI 운동 미량(그림 2A, 검은색 흔적)은 처음 48시간 동안 점진적으로 증가하여 지속적인 세포 증식을 나타낸다. 테스트 종료 시 정체성이 나타나는데, 이는 세포들이 합류하여 금 생체센서 표면 전체를 덮었음을 나타냅니다. 반면, 바이러스 감염 우물에서 나오는 NCI의 속도역학은 접종 후 50시간 후 대조군 이하로 떨어졌고, 점차 감소하여 100시간에 0에 도달했습니다.
동일한 세포 집단에서 획득한 생세포 영상은 임피던스 신호가 허용 세포의 물리적 상태를 신뢰성 있게 반영하여 전체 CPE 연속체를 통과함을 확인했습니다. 그림 2A에서 보듯, 허용 세포가 완전히 용해되기 전 첫 100시간 이내에 관찰된 감염 HEK293A 세포에서 NCI와 바이러스 GFP 발현 사이에는 역상관관계가 있습니다. 또한, 지정된 시점에 기록된 생세포 이미지(그림 2B)는 바이러스 감염 중 허용 세포 상태를 더욱 보여줍니다. 감염 후 처음 48시간 동안 세포 성장은 지속되었으나, 바이러스 입자는 세포 내에서 낮은 수준에 머물렀다. 그러나 바이러스 복제와 감염이 진행됨에 따라 세포 사멸이 시작되었으며, 이는 숙주 세포 내 융합 감소와 GFP 신호 증가로 입증되었습니다. 접종 약 100시간 후, 생존 가능한 허용 세포의 유의미한 손실로 인해 바이러스 GFP 발현이 감소하기 시작했습니다. 이 통합 접근법은 임피던스에 의한 바이러스 유발 CPE 검출의 신뢰성을 강화하여 임피던스 기반 TCID50 분석의 견고한 토대를 마련합니다.
임피던스 판독에서 유도된 TCID50의 자동 계산
양성 CPE 정을 정확히 식별하는 것은 신뢰할 수 있는 TCID50 계산에 매우 중요합니다. 시스템 소프트웨어의 바이러스학 모듈을 지원하여 임피던스 기반 TCID50 분석법이 양과 음의 CPE를 정확하고 객관적으로 구별할 수 있는지 평가하기 위해, HEK293A 세포를 6,000 세포/웰에서 24시간 동안 시딩하고, 각 희석마다 8개의 복제체(웰)를 사용하여 10배 희석된 Adv-GFP 연속 처리를 했습니다. Adv에 의해 유도된 CPE는 RTCA 시스템에 실시간으로 기록되었습니다. 그림 3A에서는 임피던스 운동 추적 신호(NCI)가 기록되어 실험 전반에 걸쳐 자동으로 플롯되었습니다. 접종 후 NCI 감소는 바이러스 첨가량과 임피던스 신호 감소 속도 간의 강한 상관관계로 입증되는 명확한 용량 의존적 CPE를 보여줍니다. 10-3 에서 10-7 희석에 노출된 세포들은 NCI가 급격하고 일관되게 감소했으며, 이는 복제 정 전반에 걸쳐 견고하고 균일한 지속적 연합 감소를 반영하였다. 반면, 10-8 바이러스 희석 상태에서는 운동 미량이 시작 시점부터 큰 변동성을 보여 특히 접종 후 100시간 이후로 NCI 표준편차가 유의미하게 커졌습니다. 감염을 유발하는 임계값 이하로 바이러스 부하가 10-10 희석으로 더 낮아지면, NCI는 음성 대조군과 구별할 수 없게 되었다. 이 데이터는 10-8 희석 상태에서 1) 바이러스가 유사한 동역학으로 모든 반복 웰에서 CPE를 유도할 수 없음을 시사합니다; 2) 이 희석은 모든 반복에서 CPE를 유발하는 농도와 일부 또는 전혀 복제체에서 CPE만 유도하는 농도를 나누는 경계선이 됩니다; 이 이진 결과는 감염되었거나(CPE로 유도된 CI 변화로 나타남) 감염되지 않았거나(CI 변화 없음) 시스템 소프트웨어의 통계적 방법으로 TCID50을 계산하는 기초가 됩니다. 따라서 특정 바이러스 농도에서 관찰되는 NCI의 깊은 변동은 부분 감염 발생의 핵심 지표이며, TCID50 계산에 필요한 외삽에 매우 중요할 수 있습니다.
고전적인 TCID50 분석법과 마찬가지로, 양성 CPE의 임계값이 정의되어야 내장된 소프트웨어가 CPE 양성 우물을 자동으로 식별할 수 있습니다. 서로 다른 바이러스와 허용 세포 모델마다 서로 다른 임계값이 필요할 수 있기 때문에, 소프트웨어는 사용자가 바이러스학 모듈 내에서 이러한 기준을 구성하고 세밀하게 조정할 수 있도록 합니다. 경험적 데이터를 바탕으로, 소프트웨어의 양성 CPE에 대한 기본 임계값이 적용되었으며, 바이러스 처리된 웰의 NCI 값이 부정적(비접종) 대조군의 평균 NCI보다 3표준편차 이상 낮은 것으로 정의되었습니다. 즉, NCI바이러스 처리 <(NCI-3 X SD) neg ctrl입니다. 개별 우물들은 양성(+) 또는 음성(-)으로 점수를 매겼습니다(그림 3B). 이 경우 Adv-GFP의 TCID50/mL는 소프트웨어에 포함된 공식 중 하나인 리드-뮌치 공식(Reed-Muench formula)을 사용하여 계산되었습니다. 양성 CPE의 기준 선택 또는 정의 외에는 TCID50 계산에 수동 작업이 필요하지 않았으며, 소프트웨어가 프로세스를 완전히 자동화했습니다.
바이러스 감염 중 TCID50의 동적 추적
TCID50 분석의 적절한 지속 시간을 결정하기 위해, 감염 후 원하는 시점에서 Adv-GFP TCID50 값을 추출하였으며, 30시간씩 최대 240시간까지 이어졌습니다. 아데노바이러스 복제가 약 30시간10분이 걸린다고 보고되어 있어 30시간 단위로 의도적으로 선택되었습니다. Adv-GFP TCID50 값은 시간에 따라 그래프로 표시되었습니다(그림 4). 주목할 만한 관찰은 TCID50 수치가 점진적으로 증가하는 현상으로, 이는 접종 후 약 150시간까지 계속됩니다. 이 지점을 넘어면 정체기가 나타나며, 이는 세포요법 효과가 포화 상태에 도달했을 가능성이 높은 평형 상태를 나타냅니다. 시간 의존적 증가와 안정화 현상은 전형적인 바이러스 복제 곡선을 시사합니다. 초기 단계는 바이러스가 활발히 전파하는 것이 특징이며, 주어진 실험 조건에서 최대 세포병리 영향을 반영하는 피크에 도달합니다. TCID50의 정체기는 바이러스 감염 과정이 허용 세포의 대다수를 관여하여 상당한 세포 사멸과 추가 바이러스 복제 중단을 초래한 생물학적 한계를 반영할 수 있습니다. TCID50의 운동 시간 경과는 HEK293A백신 접종 후 6일에서 7일 이내에 종료할 수 있음을 시사하며, 150시간경부터 TCID50 수치가 8.9 × 109 TCID50/mL로 안정적으로 관찰되었습니다.
임피던스 기반 TCID50 분석법을 이용한 인플루엔자 A 바이러스 역가의 정량화
임피던스 기반 TCID50 분석이 다른 바이러스-숙주 모델로 확장될 수 있는지 알아보기 위해, IAV에 감염된 MDCK 세포에서 TCID50 분석이 수행되었습니다. IAV에 특이적인 감염 배지의 미세한 변이를 수용하면서도, 핵심 검사 절차는 아데노바이러스에 대해 확립된 것과 일치하였습니다. 그림 5A 는 접종 후 MDCK 세포의 NCI를 보여주며, IAV 희석 비율은 1 x 10-2 에서 5 x 10-9까지 다양합니다. Adv에 감염된 HEK293 A 세포에서 관찰된 결과와 유사하게, 감염되지 않은 음성 대조군 웰에서는 복제 전반에 걸쳐 안정적이고 일관된 NCI를 보였습니다. 그러나 바이러스에 감염된 웰에서는 용량 의존적인 NCI 변화가 나타났습니다. 저용량인 6.4 및 1.3 x 10-7 희석 시에는 큰 표준편차가 관찰되었습니다. 이는 이 희석 상태에서 바이러스 농도가 TCID50에 근접했음을 시사합니다.
CPE 양성 우물은 Adv-HEK293A 모델에 적용된 동일한 기준과 임계값을 사용하여 확인되었으며, 특히 음의 대조 우물의 평균보다 3배 표준편차가 낮았습니다. IAV의 임피던스 기반 TCID50 값도 접종 후 여러 시점에서 측정되었습니다. 그림 5B 는 두 개의 독립적인 실험에서 평균 TCID50 값을 보여줍니다. 초기 시점인 60시간을 제외하고, 감염 후 90-150시간의 TCID50 값은 우수한 안정성과 일관성을 보였으며, 이는 IAV에 대한 임피던스 기반 TCID50 분석이 5일이 아닌 4일 만에 신뢰성 있게 완료할 수 있음을 나타냈다. 이러한 일관성은 임피던스 기반 방법의 견고함을 강화하며, 다양한 바이러스 병원체에 대한 적응성과 신뢰성을 확인시켜 줍니다.
기존 TCID50 방법을 이용한 임피던스 기반 TCID50 분석의 검증
IAV 농도 측정을 위한 임피던스 유도 TCID50을 검증하기 위해, 두 가지 대안 방식을 이용한 TCID50 분석법이 병행하여 수행되었습니다: 라벨 없는 이미징과 결정 바이올렛 염색입니다. 간단히 MDCK 세포를 준비하여 96웰 마이크로타이터 플레이트에 시딩했습니다. 다음 날, 세포들은 5일간 IAV 희석 접종을 받았다. 영상 기반 TCID50 분석의 경우, 생세포 영상은 4시간마다 수집되었습니다. 검증 연구에서는 10개의 IAV 샘플 농도가 평가되었습니다. 바이러스 처리된 우정의 세포 융합도를 시스템 소프트웨어를 사용해 음성 비감염 정과 비교하였습니다. 그러나 MDCK 세포에 대한 영상 분석은 그림 6A에서 볼 수 있듯이 특히 어려웠습니다. MDCK 세포의 평평한 형태와 경계선이 불분명해 세포와 빈 공간 간의 정확한 구분이 어려워 영상 기반 분석을 통한 CPE 양성 우물의 신뢰성 높은 식별이 불가능했습니다. 이러한경우, 더 발전되고 정교한 영상 분석 소프트웨어를 사용하면 TCID50 계산의 정확도를 높일 수 있습니다. 이 경우, 라벨 없는 영상 기반 TCID50 평가는 기존 시스템 소프트웨어를 사용해 성공하지 못했습니다. 결정 바이올렛 염색-TCID50 분석에서는 프로토콜 섹션에 설명된 대로 접종 후 5일째에 세포를 고정하고 염색했습니다. 그림 6B 는 임피던스 기반과 결정 바이올렛 염색 기반 TCID50 값 사이에 강한 선형 상관관계를 보여주며, 회귀 방정식은 y = 0.9582x이고 R² = 0.9979입니다. 이 비교 분석은 바이러스 역가 측정에 있어 임피던스 기반 방법의 신뢰성과 TCID50 분석법의 적합성을 강조합니다.
그림 1: 임피던스 기반 TCID50 분석의 워크플로우. 1단계: 생물센서 플레이트에 허용 세포 시딩. 허용 세포를 최적의 씨앗 밀도로 플레이트에 씨앗을 뿌립니다. 세포 성장은 세포 품질 관리(QC) 절차의 일환으로 시스템 내에서 모니터링됩니다. 2단계: 바이러스 준비 및 접종. 사용자 정의 희석 계수를 사용하여 연속적으로 희석된 바이러스 재고를 준비합니다. 플레이트를 시스템에서 제거하고 바이러스를 층상 후드의 플레이트 웰에 넣으세요. 3단계: 바이러스학 모듈 소프트웨어를 이용한 CPE 양성 우물의 CPE 측정 및 점수 매기기. 플레이트를 시스템에 반환하고 바이러스로 인한 CPE 실시간 기록을 재개하세요. 소프트웨어는 사용자가 정의한 CPE 검출 임계값 세트를 기반으로 CPE 양성 우물을 자동으로 식별합니다. 4단계: TCID50 계산. 바이러스 접종 중 CPE 양성 우물의 실시간 점수를 통해 바이러스학 모듈 소프트웨어는 검사 전 중 언제든지 특정 시점에서 TCID50 값을 계산할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 2: 아데노바이러스 유도 CPE는 임피던스 기반 및 영상 기반 방법으로 평가되었습니다 . (A) Adv-GFP 감염 후 시간이 지남에 따라 HEK293A 세포에서 임피던스(왼쪽 y축)와 녹색 형광(오른쪽 y축)의 동적 프로파일링. 아데노바이러스 감염 세포(NCI Adv-감염, 빨간 선), 음성 대조군(NCI NC, 검은선), GFP 총 통합 강도(GFP Adv-감염, 녹색 선)는 시간에 따라 그래프로 표시됩니다. 전체 통합 GFP 강도는 허용 세포 내 GFP 발현을 반영하며 바이러스 감염의 지표로 작용합니다. 정규화 세포 지수(Normalized Cell Index)에 있는 숫자들(1-6)은 감염 과정 중 특정 시점을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± SD(N = 8)로 제시됩니다. (B) 아데노바이러스-GFP 감염 전후 HEK293A 세포의 순차적 영상. (1) 기초 이미지(0시간) 뒤에는 감염 후 48시간(2), 72시간(3), 96시간(4), 120시간(5), 200시간(6)의 스냅샷이 이어지며, 세포 성장, 생존력, 그리고 아데노바이러스-GFP 형광의 시간이 지남에 따라 변화하는 모습을 보여줍니다. 스케일 바 = 160 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 3: 임피던스로 측정된 HEK293A 세포 내 아데노바이러스-GFP의 선량 의존적 CPE. (A) HEK293A 세포를 6,000 세포/웰 밀도의 바이오센서 플레이트에 시딩하고, 24시간 후에 10배 희석된 아데노바이러스-GFP에 감염시켰다. 데이터는 평균 ± SD(N = 8)로 제시됩니다. 삽입: 10-8 희석 상태에서 아데노바이러스-GFP에 감염된 웰의 정규화된 세포 지수. 10-9, 10-11, 10-12 희석 데이터는 명확성을 위해 생략되었습니다. (B) 각 바이러스 희석 상태에서의 개별 웰/복제는 CPE 양성(+) 또는 CPE 음성(-)으로 점수를 부여되었습니다. 플레이트의 각 열은 서로 다른 바이러스 희석 처리를 했으며, 희석 구배는 1열에서 가장 낮은 것부터 10번째 열의 가장 높은 것까지 다양하게 나타났습니다. 11번과 12번 열은 바이러스 처리가 없는 음성 대조 웰이었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 4: 아데노바이러스-GFP 감염 후 HEK293 세포에서 CPE 임피던스 측정을 통해 도출된 TCID50 값의 시간 경과 TCID50/mL의 아데노바이러스-GFP는 5개의 실험에서 바이러스학 모듈을 사용하여 특정 시점에서 계산하였습니다. 바이러스학 모듈은 TCID50 계산 공식을 세 가지로 제공하지만, TCID50 계산에는 리드-뮌치 공식이 선택되었습니다. 데이터는 평균 ± SD(N = 5)로 제시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 5: 임피던스 기반 TCID50 분석법을 이용한 인플루엔자 A 바이러스 역가 평가. (A) 임피던스 를 통해 측정된 MDCK 세포 내 IAV의 용량 의존적 CPE. MDCK 세포는 8,000 세포/웰에서 바이오센서 플레이트에 시딩된 후 24시간 후 인플루엔자 바이러스의 5배 연속 희석으로 감염시켰습니다. 데이터는 평균 ± SD(N = 8)로 표시됩니다. 명확성을 위해 2.6 × 10⁻⁸ 희석 데이터는 생략되었습니다. (B) IAV 감염 MDCK 세포에서 임피던스 측정을 통해 도출된 TCID50 값의 시간 경과 TCID50 계산에는 리드-뮌치 방법이 사용되었습니다. 데이터는 SD (N = 2)± 평균 값으로 제시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 6: 임피던스 기반과 결정 바이올렛 염색 기반 TCID50 분석의 상관관계. (A) IAV 접종된 MDCK 세포의 이미지. 스케일 바 = 160 μm. (B) 임피던스 기반 및 결정 바이올렛 염색 기반 방법으로 얻은 TCID50/mL 값을 10개의 IAV 샘플을 사용하여 비교하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 7: 시스템의 바이러스학 모듈 소프트웨어의 대표적인 인터페이스들. 이 소프트웨어는 임피던스 기반 TCID50 분석 과정을 간소화합니다. (1) 실험 설계 기록을 위한 플레이트 레이아웃; (2) 바이러스 접종 중 소프트웨어가 자동으로 표시하고 표시한 세포 지수 또는 정규화 세포 지수; (3) 소프트웨어는 TCID50 계산식에 대한 양성 CPE 기준과 선택을 유연하게 결정할 수 있습니다; (4) TCID50/mL는 분석 중 어느 시점에서든 측정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
토론
본 연구에서는 아데노바이러스-HEK293A 및 인플루엔자 A 바이러스-MDCK 모델을 사용하여 바이러스 역가 결정에 임피던스의 적용 가능성을 입증하였습니다. 또한 정형소바이러스12, 웨스트나일 바이러스(WNV), 세인트루이스 뇌염 바이러스(SLEV)13, 치쿤구니야 바이러스14, 감염성 점액낭 바이러스8, 키메라 황열병뎅기열 15, 간염 A 바이러스16, SARS-CoV-217, 뎅기열9 등 다양한 바이러스에서 RTCA 시스템을 사용하여 바이러스 유발 CPE를 견고하고 신뢰할 수 있게 검출하는 것을 검증했습니다.
임피던스를 통한 실시간 CPE 기록은 특정 바이러스 허용 세포 모델에서 바이러스 특이적 시간 의존적 CI 값 감소를 발견할 수 있게 합니다. Fang 등은 플라비바이러스 유발 CPE를 특징짓는 운동학적 매개변수인 CIT50(세포 임피던스가 50% 감소하는 시간으로 정의됨)이 특정 범위 내에서 바이러스 감염 용량과 반비례한다는 것을 처음으로 입증했습니다. 또한 CIT50이 중화 항체 역가(13)의 역수에 비례한다는 점도 밝혔습니다. 그 이후로 Sanofi Pasteur의 Charretier 등은 키메라 황열-뎅기열(CYD) 백신 제품 및 공정15 개발 과정에서 바이러스 감염성 역가를 결정하기 위한 임피던스 기반 실시간 세포 분석(RTCA) 방법을 연구해왔습니다. Charretier 등15 는 면역염색 기반 CCID50 분석법을 이용해 이 임피던스 기반 세포 배양 감염 용량 50%(CCID50)를 추가로 검증하였습니다. 그들은 임피던스 기반 RTCA 방법이 산업 환경에서 표준 CCID50 분석보다 약 5배 적은 노동 집약성과 3.5배 더 비용 효율적임을 입증했습니다. 본 연구에서는 IAV 유도 CPE에 대해 임피던스 기반 TCID50이 전통적인 Crystal Violet TCID50 분석법에 대해 검증된 것이 입증되었습니다. 또한 RTCA 소프트웨어의 바이러스학 소프트웨어 모듈도 활용되었습니다. CPE 양성 우물은 소프트웨어 내 사용자 정의 CPE 양성 우물 기준에 따라 자동으로 식별되었으며; 저희 경우, 음성 대조군에 비해 CI의 정도가 떨어집니다. 이후 소프트웨어가 TCID50을 계산하여 CIT50에 의존하거나 검사 샘플이 최적 범위 밖에 떨어질 위험 없이 정확한 역가 결정이 가능했습니다. CPE 양성 웰에 대한 적절한 임계값을 설정하는 것은 분석의 민감도와 특이성에 직접적인 영향을 미치기 때문에 매우 중요합니다. 사용자는 세포 지수 변화를 검증된 기존 방법의 결과와 비교하여 바이러스 특이적 기준을 결정할 것을 권장합니다. 이러한 경험적으로 도출된 임계값들은 소프트웨어의 바이러스학 모듈 내에서 구성 및 정제될 수 있습니다.
다른 세포 기반 분석과 마찬가지로, 임피던스 기반 TCID50 분석에서 사용되는 허용 세포의 상태는 검사의 성공과 결과 품질을 결정하는 데 매우 중요합니다. 높은 세포 증식과 생존력을 보장하기 위해 신선하고 저통통 세포를 권장합니다. 또한, 동일한 통로에 허용 세포 뱅크를 만드는 것은 실험 간 재현성을 향상시킬 수 있습니다. 그림 3A에서 알 수 있듯이, 허용 세포가 최적의 조건에 있을 때, 감염되지 않은 대조군에서 전체 분석에 걸쳐 안정적이고 일관된 임피던스 신호를 생성했습니다. 이 연구는 CPE 양성 웰의 임계값을 설정하는 신뢰할 수 있는 기준선 기준을 제공하여 정확한 바이러스 역가 결정에 기여했습니다. 또한, 임피던스 기반 TCID50 분석법은 바이러스 역가 평가 전에 허용 세포에 대해 품질 관리를 수행할 수 있는 독보적인 능력을 갖추고 있습니다. 건강한 허용 세포의 특징적인 동학 CI 프로필은 신뢰할 수 있는 품질 관리 지표로서, 바이러스 정량에 생존 가능하고 일관된 세포 집단만 사용되도록 보장하여 재현성과 검사의 정확성을 높입니다.
각 새로운 바이러스에 대해, 구현 전에 임피던스-TCID50 분석의 최적화 및 검증도 수행해야 합니다. 기저 배지와 FBS 농도를 포함한 세포 배양 조건과 같은 핵심 요인들은 재현 가능한 세포 임피던스 데이터를 얻고 CPE 검출의 민감도를 높이는 데 매우 중요하며, 이는 이전 연구들에서 강조되었습니다 6,16. 이와 관련해, 라벨 없는 실시간 임피던스 기반 기술은 분석법개발 중 세포 배양 조건을 최적화하는 간단하고 효율적이며 가치 있는 도구임이 입증되었습니다.
임피던스-TCID50 분석법의 한계는 CPE를 유발하지 않는 바이러스에서 발생하는데, 이는 CPE를 이용해 임피던스 판독값 변화를 생성하기 때문이며, 이는 TCID50 계산의 기초가 됩니다. 이러한 경우, 바이러스에 의해 유도된 CPE를 보일 수 있는 대체 허용성 세포 모델을 식별하거나, 특정 바이러스 항원에 대한 적합한 항체가 제공된다면 면역염색 방식을 채택해야 할 수도 있습니다. 그럼에도 불구하고 이 연구는 RTCA MP 시스템이 선량 의존적 CPE를 포착하고, 객관적이고 민감한 임피던스 판독을 통해 감염된 세포와 미감염 세포 집단을 효과적으로 구분할 수 있음을 입증했습니다.
TCID50 시간 의존 분석 도입은 기존의 평가 측정에 비해 중요한 진전을 의미합니다. 이는 단일 실시간 분석법으로 바이러스 역가를 계산하고 보고할 최적의 시점을 쉽게 얻을 수 있어 TCID50 분석 최적화 과정을 단순화합니다. 영상 기반 라벨 없는 TCID50 분석도 시간 분해 TCID50 값을 제공할 수 있으나, IAV-MDCK 모델(그림 6A)에서 입증된 것처럼 영상 소프트웨어 알고리즘으로 인식 가능한 CPE를 보이는 바이러스-세포 모델에 적용 범위가 제한됩니다(그림 6A). 더불어, CPE 감지에 라벨 없는 임피던스를 사용하면 다양한 시약과 다단계 워크플로우 사용으로 인한 복잡성을 없애 인적 오류로 인한 위험을 줄일 수 있습니다. 워크플로우를 단순화하는 것 외에도, 시스템 소프트웨어의 바이러스학 모듈은 검사 과정을 간소화합니다. 우선, 자동 제어 녹화를 위한 간단한 실험 일정 설정부터 시작합니다. 각 측정 후 실시간으로 자발적으로 CPE 양성 점수가 매겨지며, 감염성 바이러스 입자의 간단한 정량화를 위한 자동 TCID50 계산으로 마무리됩니다(그림 7). 이 자동화는 직접 손을 다루는 시간을 크게 줄여주며, 특히 감염성이 강한 바이러스를 다룰 때 매우 중요한 개선입니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 트립신 0.53 mM EDTA (1회 ) | 코닝 | 25-052-CI | |
| 12개의 채널 시약 저장소 | 비스타랩 테크놀로지스 | 3054-1011 | |
| 아데노바이러스-GFP | 벡터 바이오랩스 | 1060 | |
| DMEM 매체 | ATCC | 30-2002 | |
| E-플레이트 뷰 96 | 애질런트 | 300601020 | |
| 태아 소 혈청 | 아반토르 | 97068-085 | |
| Hek293A 셀 | 서모 피셔 사이언티픽 | 그리고 nbsp; R70507 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액 | 하이클론 | SV30010 | |
| 인산염 완충 식염수 (1배) | 하이클론 | SH30256.01 | |
| 씨플라크 아가로스 | 론자 | 50101 | |
| xCELLigence RTCA eSight 시스템 | 애질런트 | S2833AA | |
| xCELLigence RTCA MP 시스템 | 애질런트 | 380601040 |
참고문헌
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