이 논문은 CsChrimson 및 GtACR2를 활용하여 특정 뉴런을 활성화하고 침묵시키는 Drosophila melanogaster의 광유전학적 조작 방법을 제시합니다. 광유전학을 활용하여 열택 및 미각 행동을 탐구하고 이러한 과정을 제어하는 기본 신경 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 네 가지 실험이 설명됩니다.
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방법 논문
Drosophila melanogaster에서 신경 회로의 광유전학적 조작을 위한 행동 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
광유전학은 신경 과학의 기본 기술이 되었으며, 빛 자극을 통해 신경 세포 활동을 정밀하게 제어할 수 있습니다. 이 연구는 Drosophila melanogaster에 광유전학적 방법을 적용하기 위한 구현하기 쉬운 설정을 소개합니다. 두 가지 광유전학 도구인 CsChrimson, 적색광 활성화 양이온 채널, 청색광 활성화 음이온 채널인 GtACR2가 4가지 실험적 접근 방식에 사용되었습니다. 이러한 접근 방식 중 세 가지는 단일 파리 실험을 포함합니다 : (1) 온도에 민감한 가열 세포를 표적으로 하는 청색광 광유전학 열tactic 위치 선호 분석, (2) 쓴 감지 뉴런을 활성화하는 적색광 광유전학 위치 선호 분석, (3) 단맛 감지 뉴런을 활성화하는 확장 반응 분석. 네 번째 접근 방식(4)은 여러 파리를 사용하여 회피 행동을 평가하기 위한 파리 미로 설정입니다. 신경 활동을 시간적, 공간적으로 조작할 수 있는 능력은 감각 처리 및 의사 결정에 대한 강력한 통찰력을 제공하며, 신경 기능에 대한 지식을 발전시킬 수 있는 광유전학의 잠재력을 강조합니다. 이러한 방법은 특정 신경 경로와 행동 결과에 대한 이해를 향상시키기 위해 신경 과학의 향후 연구를 위한 접근 가능하고 강력한 프레임워크를 제공합니다.
서론
광유전학은 신경 과학에서 광학과 유전학을 결합한 강력한 기술로 부상했으며, 광 자극1을 통해 신경 활동에 대한 정확하고 비침습적인 제어를 제공합니다. 널리 사용되는 모델 유기체인 Drosophila melanogaster에서 광유전학 도구는 특정 뉴런의 활성화 및 억제를 가능하게 하여 연구자들이 신경 회로를 조절할 수 있도록 합니다. 사용된 도구 중 CsChrimson 및 GtACR(Guillardia theta 음이온 채널 로돕신)은 신경 세포 표적화를 위한 상호 보완적인 접근 방식을 제공합니다. 녹조류의 적색광에 민감한 양이온 채널인 CsChrimson 채널로돕신은 적색광에 노출될 때 탈분극을 통해 뉴런 활성화를 촉진하며 약 590nm에서 피크 활성화를 촉진합니다2. CsChrimson은 이전의 채널로돕신보다 더 나은 조직 침투를 제공하고 초파리 연구에서 빛에 의한 행동 인공물을 감소시킵니다2. 대조적으로, GtACR2와 같은 변형을 포함하는 GtACR은 과분극(hyperpolarization)을 통해 뉴런을 침묵시키는 광의존성 염화물 채널입니다
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프로토콜
1. 스트레인, 플라이 사육 및 플라이 흡입기
- 긴장 및 유지 보수
- 실험에 사용된 균주는 HC-Gal410, Gr5a-Gal420 (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592), Gr66a-Gal421 (BDSC: 57670), UAS-GtACR23, UAS-CsChrimson2 (BDSC: 55136)입니다. 후방은 12시간 조명:12시간 다크 사이클 아래에서 표준 옥수수 가루 매체에서 25°C로 비행합니다.
참고: 1L 옥수수 가루 배지에는 1L dH2O, 포도당 79g, 한천 7.5g, 플레이크 효모 24g, 옥수수 가루 57g, 메틸-4-하이드록시벤조에이트 2.1g(에탄올 11.1mL에 용해), 주석산칼륨 6g, 사수화 나트륨 6g 및 염화칼슘 0.9g이 포함되어 있습니다.
- 실험에 사용된 균주는 HC-Gal410, Gr5a-Gal420 (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592), Gr66a-Gal421 (BDSC: 57670), UAS-GtACR23, UAS-CsChrimson2 (BDSC: 55136)입니다. 후방은 12시간 조명:12시간 다크 사이클 아래에서 표준 옥수수 가루 매체에서 25°C로 비행합니다.
- 파리 사육 및 실험 준비<....
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결과
Single-fly blue-light optogenetic thermotactic positional preference assay(단일 비행 청색광 광유전학 열전술 위치 선호 분석)
ATR 보충이 없는 실내 조명(실내 조명, ATR -), ATR 보충이 있는 실내 조명(실내 조명, ATR +), ATR 보충이 없는 청색광(파란색, ATR -), ATR 보충이 있는 청색광(파란색, ATR +)의 4가지 조건을 테스트했습니다. 처음 세 가지 조건은 컨트롤 역할을 했습니다. 대조군 실험에서 파리는 31°C 쪽을 피했습니다. ATR 보충제가 있는 청색광에서 파리는 25°C와 31°C 사이에서 선호도를 나타내지 않았으며, 이는 GtACR2 활성화에 의한 HC 뉴런의 성공적인 억제를 나타냅니다(그림 2A).
Single-fly red-light optogenetic positional.......
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토론
광유전학적 조작은 시공간 정확도로 신경 회로를 정밀하게 제어할 수 있게 함으로써 신경과학 분야를 변화시켰다27. 신경 회로는 시냅스에 의해 상호 연결된 뉴런 집단을 포함하며, 활성화 시 특정 기능을 수행합니다. 초파리 전뇌 커넥톰(Drosophila whole-brain connectome)이 완성되어 초파리 뇌 내 시냅스 경로에 대한 포괄적인 통찰력을 제공합니다28,29. 커넥톰은 특정 행동의 기저에 있는 잠재적인 회로 메커니즘을 예측할 수 있지만, 추가적인 실험적 검증이 필요합니다. 유전 도구와 행동 분석을 결합함으로써 광유전학 조작은 행동 기능에서 신경 회로의 역할을 탐구하는 강력한 접근 방식을 제공합니다. 예를 들어, 트랜스 탱고(trans-Tango)를 광유전학 기술.......
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공개 사항
저자는 이 기사의 출판과 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다. 모든 저자는 잠재적인 갈등을 공개했으며 이 연구에서 제시된 연구에 영향을 미칠 수 있는 재정적 또는 개인적 관계가 없음을 확인합니다.
감사의 글
모든 그림에 대한 개략도는 Biorender.com 로 생성되었습니다. 이 작업은 NIH R01GM140130(https://www.nigms.nih.gov/)에서 L.N.에 지원했습니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.
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참고문헌
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Mauss, A. S., Busch, C., Borst....
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