방법 논문

카테터 관련 요로 감염의 체외 방광 모델

DOI:

10.3791/67966

⸱

2025년 6월 24일

 ,  , 
1The Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, The University of Liverpool, 2Department of Life Sciences, The University of Bath

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 카테터 삽입 요로의 체외 모델을 자세히 설명하며, 이는 시뮬레이션된 카테터 관련 요로 감염에서 플랑크톤 및 생물막 관련 박테리아 세포 집단을 모두 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 모델은 요로 감염을 통제하기 위한 항균 제품의 효능을 연구하는 데 추가로 활용될 수 있습니다.

초록

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카테터 관련 요로 감염(CAUTI)은 가장 흔한 의료 관련 감염 중 하나입니다. 요로 카테터의 생물막 형성은 이러한 감염의 발병기전에서 중요한 측면이며, 종종 카테터의 막힘과 신우신염 및 패혈증과 같은 심각한 합병증을 유발합니다. 이러한 환경에서 생물막 형성을 모델링하고 연구하는 접근 방식은 CAUTI의 발병 기전을 뒷받침하는 메커니즘에 대한 근본적인 이해뿐만 아니라 CAUTI 및 카테터 막힘을 제어하기 위한 효과적인 치료 전략의 개발 및 강력한 전임상 평가에 필수적입니다. 이 프로토콜은 임상 실습에서 사용되는 카테터 폐쇄 배액 시스템을 복제하여 대표적인 조건에서 CAUTI 및 카테터 생물막 형성에 대한 연구를 촉진하는 카테터 삽입된 요로의 체외 모델을 설명합니다. 또한, 이 프로토콜은 현재 NHS 공급망에서 사용 가능한 제품을 포함하여 항균 카테터 유지 관리 제품의 효능을 평가하기 위한 체외 방광 모델의 적용을 자세히 설명합니다.

서론

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비뇨기 카테터는 가장 일반적으로 사용되는 의료 기기 중 하나이며, 급성 치료 시설에서 19%의 유병률이 있는 것으로 추정됩니다 1,2,3. 카테터는 주로 방광 기능 장애가 있는 경우 소변 배출 관리를 돕기 위해 배치되며, 방광에 직접 삽입되어 중앙 내강을 통해 방광에서 소변이 배출될 수 있도록 합니다 2,3. 소변 카테터는 소변을 배출하기 위해 주기적으로 방광에 삽입하는 간헐적으로 사용할 수도 있고, 방광에 카테터를 제자리에 두어 지속적으로 소변을 배출하는 유치 카테터를 사용할 수도 있습니다 3,4. 요로 카테터는 널리 사용되고 있음에도 불구하고 요로 감염(UTI) 발병의 가장 큰 위험 요소이며, 요로 감염은 의료 관련 감염의 약 5분의 1을 차지합니다 5,6. 실제로, 카테터 자체는 종종 미생물 집락화의 초기 부위로 작용하여 비뇨기 병원체가 요로에 부착하고 더 나아가 군락화할 수 있는 표면을 제공합니다 1,6,7,8. 장기간 연속 카테터 삽입(카테터를 ≥28일 동안 제자리에 두는 경우)을 받는 거의 모든 환자는 세균뇨를 경험하게 되며, 카테터가 현장에서 2,9,10,11일 동안 매일 ~5%씩 위험이 증가합니다. 이에 상응하여 요로감염의 약 80%는 요로 카테터 사용과 관련이 있다6.

카테터 관련 요로 감염(CAUTIs)은 의료 서비스에 상당한 부담을 주며, 합병증이 없는 요로감염보다 더 심각한 상부 요로감염 증상(예: 요로염 및 신우신염)과 관련이 있을 뿐만 아니라 2차 혈류 감염의 위험 증가와 관련이 있는 경우가 많습니다 1,7,12,13,14 . CAUTI에 대한 표준 치료법에는 항생제 요법이 포함되지만, 이러한 감염은 카테터 표면에 복잡한 생물막 군집이 발달하기 때문에 항균 치료에 내성이 있는 경우가 많습니다 15,16,17,18,19,20. 실제로, CAUTI의 ~80%는 생물막을 형성하는 요로 병원체에 의해 발생하는 것으로 추정됩니다19. 생물막 형성은 박테리아 세포가 카테터 표면에 부착되고 세포 외 고분자 물질 (EPS) 21 , 22 , 23 , 24 의 광범위한 매트릭스에 내장 된 군집의 발달을 특징으로합니다. EPS의 생산은 생물막 군집의 정의 특징이며 항균제에 대한 내성 증가 및 면역 제거율 21,22,24와 같은 생물막 관련 세포가 표시하는 많은 창발적 특성을 담당합니다. EPS는 세포막의 물리화학적 미세환경 및 지속세포 형성과 같은 생물막 군집의 더 넓은 측면의 발달을 촉진함으로써 간접적으로 세포를 물리적으로 보호하고 항균제 또는 면역 효과기로부터 세포를 보호함으로써 이러한 표현형에 직접적인 역할을 할 수 있습니다 23,24,25,26. 또한, CAUTI의 ~ 11 %를 차지하는 Proteus spp.를 포함한 일부 요로 병원체는 강력한 우레아제 효소를 보유하고있어 소변에 존재하는 요소를 가수 분해하고 요로 pH 2,27,28,29,30을 전반적으로 증가시킵니다. 이러한 pH 증가는 칼슘 및 인산마그네슘 결정의 침전을 동반하며, 이는 성장하는 생물막에 통합될 수 있으며, 그 결과 생체 광물화가 발생하고 카테터를 차단할 수 있는 조밀한 결정질 생물막 구조가 형성됩니다. 이러한 결정질 생물막은 치료를 어렵게 만들 뿐만 아니라 신우신염 및 패혈증과 같은 심각한 합병증을 유발할 수 있습니다 2,28,31,32,33,34.

카테터화된 요로의 복잡한 환경적 틈새와 이러한 감염에서 생물막 형성의 중요한 역할은 CAUTI 발병 기전 연구에서 특별한 문제를 제기합니다. 96웰 플레이트 기반 분석법과 같이 생물막 형성을 연구하고 정량화하기 위해 널리 사용되는 단순하고 널리 사용되는 실험실 모델은 CATUI의 생물막 형성, 특히 결정질 생물막 연구에 적합하지 않습니다. 예를 들어, 이러한 모델은 소변이 제공하는 복잡한 영양 환경, 카테터 표면이 접착 및 후속 생물막 생성에 미치는 영향, 소변 매체의 지속적인 흐름과 같은 CAUTI 틈새의 주요 측면을 설명하지 않습니다 35,36,37,38,39,40. 또한 요로 병원체의 항균제 감수성을 결정하는 데 사용되는 표준 분석법은 실제 임상 감수성을 반영하지 않는 경우가 많습니다. 최소 억제 농도 분석 및 미생물 현탁액 검사는 CAUTI 병원체의 항균 감수성을 추론하는 데 자주 사용되지만, 일반적으로 요로 카테터의 존재 및 후속 생물막 형성이 항균제 감수성에 미칠 수 있는 영향과 같은 CAUTI 환경의 중요한 변수를 시뮬레이션하지 않습니다 41,42,43.

이 연구는 카테터화된 요로의 환경을 시뮬레이션하고 1999년 Stickler et al.44에 의해 처음 설명된 임상 실습에서 사용되는 표준 카테터 폐쇄 배액 시스템을 복제하는 체외 방광 모델의 설정 및 실행에 대해 자세히 설명합니다(그림 1). 이 모델은 표준 크기의 폴리 카테터(현재 NHS 공급망에서 사용 가능)와 Nzakizwanayo et al.45에서 이전에 설명한 대로 인공 소변 배지(AUM)를 사용하여 CAUTI 및 생물막 형성을 시뮬레이션합니다. 체외 방광 모델은 "방광" 역할을 하는 이중벽 유리 챔버로 구성되며 폴리 카테터를 중앙 유리 챔버에 삽입할 수 있는 배출구가 있습니다. 중앙 유리 챔버의 상단에는 연동 펌프를 사용하여 생물학적으로 관련된 유속으로 AUM을 "방광"에 공급할 수 있는 흡입구가 있으며, 이 흡입구는 배액 눈구멍을 통해 카테터를 통해 폐기물 봉투로 흐릅니다. 또한 외부 챔버는 수조 회로에 연결되어 모델을 일정한 온도로 유지할 수 있습니다. 체외 방광 모델은 중앙 챔버를 통해 접종할 수 있으므로 생물학적으로 대표적인 틈새 시장에서 CAUTI 병원체를 연구할 수 있습니다. 또한, 모델에 카테터를 삽입하고 새로운 AUM을 지속적으로 공급함에 따라 플랑크톤 및 생물막 관련 세포의 성장 및 개체군 역학을 연구할 수 있습니다.

과거 연구에서는 Proteus mirabilis 및 Escherichia coli 43,45,46,47,48,49를 포함한 저명한 CAUTI 병원체의 생물막 형성에 대한 기초 연구를 포함하여 여러 응용 분야에 체외 방광 모델을 활용했습니다. 또한, CAUTI를 조절하거나 막힘을 예방하기 위한 제품의 효능을 평가하기 위해 체외 모델을 활용했습니다 50,51,52. 보다 최근에는 AMR과 관련된 적응 및 돌연변이가 P. mirabilis43,46의 생물막 형성 및 CAUTI 발병에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 모델이 사용되었습니다. 체외 방광 모델은 또한 새로 제형화된 테라노스틱 카테터 코팅 및 파지 요법 치료를 포함하여 CAUTI 치료를 목표로 하는 새로운 항균 치료를 연구하는 데 사용되었습니다47,48. 이 프로토콜은 체외 방광 모델의 설정 및 실행, 모델 및 요로 카테터 표면에서 각각 생존 가능한 플랑크톤 및 생물막 관련 세포의 계수, 요분해효소 생산을 모니터링하기 위한 요로 pH 측정을 포함합니다. 또한 현재 NHS 공급망에서 사용할 수 있는 방광 세척 솔루션 및 항균 윤활제 젤을 포함하여 CAUTI를 치료하거나 예방하기 위한 항균 제품의 평가를 위한 프로토콜도 자세히 설명되어 있습니다.

프로토콜

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체외 방광 모델 설정의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. 체외 방광 모델은 표준 폴리 카테터와 호환되도록 설계되었습니다(그림 1에 표시된 치수는 표준 크기 14 프렌치 카테터와 호환됨). 모든 체외 방광 모델 장비를 살균하고 clamp 사용하기 전에 미디어 회로에 사용된 모든 실리콘 튜브. 체외 모델 설정 전반에 걸쳐 무균 기술을 엄격하게 준수해야 하며, 모델을 멸균 조건(즉, 카테고리 II 미생물 안전 캐비닛 또는 층류 후드)에서 조립하는 것이 좋습니다. 시험관 내 방광 모델 실험에 대한 통계적 유의성을 결정하기 위해 최소 n = 5회 반복이 권장됩니다. 시약 및 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 인공 소변 매체의 제조

참고: 인공 소변 배지(AUM)는 실험에 필요한 매체의 양이 많고 인간의 소변 샘플과 관련된 변동성이 있기 때문에 체외 방광 모델에 사용하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 앞서 설명한 바와 같이 AUM의 준비를 자세히 설명하고 Nzakizwanayo 등의 체외 방광 모델에서 사용하도록 최적화되었습니다. (5L 최종 용량) 43,45,46,48,53,54.

  1. AUM 솔루션 준비 1
    1. 다음 화합물의 무게를 측정하고 850mL의 탈 이온수로 채워진 1L 붕규산 병에 첨가하십시오 : 염화 마그네슘 육수화물 (MgCl2.6H 2O) 3.25g, 염화나트륨 (NaCl) 23g, 무수 황산 나트륨 (Na2SO4) 11.5g, 구연산 삼 나트륨 3.25g (Na3C6H5O7), 옥살산 나트륨 (Na2C2O4 ) 0.1g, 인산 모노 칼륨 (KH2PO4 ) 14g, 염화 칼륨 (KCl) 8g, 염화 암모늄 (NH4Cl) 5g, 젤라틴 25g 및 트립톤 콩 육수 5g.
  2. AUM 용액을 교반하는 동안 pH 측정기를 사용하여 pH를 측정하고 5.75M NaOH 또는 HCl을 적절하게 첨가하여 0.02(±)로 조정합니다.
    참고: pH 조정을 위한 NaOH/HCl을 AUM에 적가하여 용액에서 염이 침전되는 것을 방지해야 합니다.
  3. AUM의 pH가 조정되면 용액을 탈이온수로 최종 부피 1L까지 보충하고 오토클레이브 멸균합니다.
    알림: 멸균되면 용액은 실온에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다(강수 또는 탁도가 관찰되는 경우 AUM 용액 1을 폐기해야 함).
  4. 이와 별도로 멸균 500mL 비커에 멸균 탈이온수 400mL에 요소 125g(CH4N2O)과 염화칼슘 2.45g(CaCl2)을 첨가하여 AUM 용액 2를 준비합니다.
    참고: 칼슘 요소 용액 2를 준비하면 흡열 반응이 발생하므로 AUM 용액 2를 교반하고 가열하여 가열하는 동안 화합물이 동결을 방지하기 위해 용해되는 동안 가열하는 것이 좋습니다.
  5. 요소와 염화칼슘이 용해되면 진공 펌프와 0.45μM 니트로셀룰로오스 필터 장치를 사용하여 용액 2를 멸균된 500mL 유리병에 여과하여 멸균합니다. 멸균이 완료되면 용액 2는 4°C에서 3개월 동안 또는 실온에서 1개월 동안 안정적입니다
    알림: AUM 용액 2는 강수 또는 흐림이 관찰되는 경우 폐기해야 합니다.
  6. 층류 후드 또는 카테고리 II 미생물 안전 작업대에서 AUM 용액 1 및 2를 멸균 5L 유리 흡입기 병에 담긴 3.6L의 멸균 탈이온수와 무균 방식으로 결합합니다. AUM은 옅은 노란색이어야 하며 투명해야 합니다.
  7. 혈청학 피펫을 사용하여 총 AUM 부피에서 50mL를 제거하고 50mL 원심분리 튜브에 분취한 후 나중에 사용할 수 있도록 보관합니다.
  8. 고무 마개 또는 알루미늄 호일을 사용하여 흡인기 병을 밀봉하고 체외 모델이 조립될 때까지 실온에 두십시오.
  9. 50mL 부분 표본에서 10mL의 AUM을 무균 방식으로 제거하고 접종 준비를 위해 나머지 용액을 예약합니다. pH 측정기를 사용하여 10mL AUM 부분 표본의 pH를 측정하며, 이는 ~pH 6.1(±0.2)이어야 합니다. 준비된 AUM은 실온에서 약 1개월 동안 안정적이며, 강수나 흐림이 발생하면 폐기해야 합니다.

2. 체외 방광 모델 설정

  1. 폴리 카테터를 체외 방광 모델의 중앙 유리 챔버에 삽입합니다( 그림 1에 자세히 설명된 개략도). 제공된 멸균수 주사기로 풍선을 부풀려 카테터를 제자리에 고정하고 폐기물 봉투를 카테터 포트에 부착합니다.
  2. 튜브를 연결하여 시험관 내 방광 모델 장치(45)를 AUM 저장소에 연결합니다. 제조업체의 지침에 따라 매체 회로 튜브를 연동 펌프에 연결하여 튜브가 늘어나지 않고 적절한 장력을 갖도록 합니다.
  3. 체외 방광 모델을 클램프 스탠드에 부착하고 모델 아래의 스탠드에 폐기물 봉투를 고정하여 중력을 통해 모델을 통한 흐름을 보장합니다.
  4. 방광 모델의 외부 챔버를 실리콘 튜브를 통해 순환 수조에 연결합니다(그림 1B). 수조를 37°C로 가열하고 탱크 순환기를 켭니다.
    1. 체외 방광 모델을 접종하기 전에 30분 동안 수조를 실행하여 온도가 37°C에서 안정적인지 확인하고 실험 기간 동안 수조가 적절한 수위까지 채워져 있는지 확인합니다.
  5. 배지 튜브에서 클램프를 제거하고 연동 펌프를 약 0.75mL/분으로 설정하여 인간의 소변 생성(~1080mL/일)을 복제합니다. 실제 유속은 실험 중에 계산됩니다.
  6. 접종 전 30분 동안 연동 펌프를 통해 체외 방광 모델을 통해 AUM을 실행하여 매체 흐름이 일정한 속도로 이루어지고 멸균 배액 시스템이 손상되지 않았는지 확인합니다.
  7. 실험하기 전에 폐기물 봉투에서 축적된 매체를 배출하십시오. 정확한 유속을 계산하기 위해 매체의 부피를 측정할 수 있습니다(4단계에서 자세히 설명).

3. 체외 방광 모델의 접종

  1. 고체 한천에서 자란 한 무리의 박테리아 콜로니를 10mL의 LB 육수에 현탁하여 체외 방광 모델을 위한 하룻밤 배양을 준비합니다. 37 °C에서 교반하면서 밤새 배양하십시오.
    참고: 체외 방광 모델은 Proteus mirabilis와 같은 우레아제 양성 균주를 포함한 다양한 CAUTI 병원체를 연구하는 데 사용할 수 있으며 사용되는 성장 배지는 그에 따라 수정될 수 있습니다.
  2. 실온에서 4,500 x g 의 전체 부피를 10분 동안 원심분리하고 상층액을 폐기합니다. 펠릿을 10mL의 AUM에 재현탁하고 분광계를 사용하여 OD595nm 에서 흡광도를 측정합니다.
  3. 다음 방정식을 사용하여 재현탁 배양물을 1.0의 OD595nm 및 AUM의 최종 부피 10mL로 정규화합니다.
    figure-protocol-1
    여기서,A1 은 야간 배양의 OD600nm 에서의 흡광도,A2 는 접종물의 OD600nm 에서의 원하는 흡광도(1.0),V2 는 접종물의 원하는 부피(10mL),V1 은 정규화를 위해 필요한 야간 배양의 부피입니다.
    참고: OD595 nm 1.0 현탁액 10mL는 확립된 감염을 복제하는 대부분의 박테리아 균주(Proteus mirabilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa 및 Staphylococcus aureus에 대해 검증됨)의 약10 10 CFU를 모델에 접종합니다. 사용 된 종 또는 모델링되는 감염 단계에 따라 접종 시작 횟수를 수정할 수 있습니다 (즉, 초기 단계 감염을 시뮬레이션하기 위해 더 낮은 접종 밀도를 사용할 수 있음) 47.
  4. 70% 에탄올을 사용하여 체외 방광 모델을 멸균하고 스토퍼(매체 주입구)를 제거하여 내부 챔버에 접근할 수 있도록 합니다. 혈청학 피펫을 사용하여 방광 모델 내부의 부피에서 10mL의 AUM을 제거합니다.
    참고: 중앙 챔버에서 체외 모델을 접종하고 샘플링할 때 작업이 빠르고 무균적인지 확인하고, 항상 적절한 PPE를 착용하고, 정기적으로 장갑과 표면의 오염을 70% 에탄올로 제거합니다.
  5. 정규화된 10mL 현탁액 전체를 사용하여 중앙 챔버를 통해 체외 방광 모델을 접종하고 혈청학적 피펫으로 철저히 혼합합니다. 혈청학 피펫을 사용하여 체외 방광 모델의 중앙 챔버에서 10mL를 제거하고 나중에 CFU/mL 계산 및 pH 측정을 위해 15mL 유니버설로 분취합니다.
  6. 블래더 모델과 마개의 외부 표면을 70% 에탄올로 철저히 오염 제거하고 마개를 교체합니다. 흐름을 멈추기 전에 중앙 챔버의 AUM 수준이 아이홀에 도달하도록 미디어 흐름을 잠시 재개합니다.
  7. ~0.75mL/분의 속도로 연동 펌프 를 통해 배지 흐름을 켜기 전에 1시간 동안 방광 모델에 배양이 확립되도록 합니다.
  8. 접종물이 설정되는 동안 중앙 챔버에서 채취한 샘플로 희석액을 준비합니다.
    1. 시료가 10-7로 희석될 때까지 900μL의 멸균 PBS에 100μL의 시료를 연속적으로 희석합니다. 희석액의 10μL 스폿을 적절한 고체 매체에 3회 플레이트로 제거하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    2. 배양 후 각 희석 플레이트의 콜로니를 세고 초기 접종물의 정확한 CFU/mL를 계산합니다.
      참고: 떼를 지어 다니는 종, 즉 Proteus mirabilis를 사용하는 경우 소금이 없는 MacConkey 한천(펩톤 20.0g/L, 유당 10.0g/L, 담즙염 5.0g/L, 중성 적색 0.075g/L 및 한천 12.0g/L)을 사용하여 단일 군체가 계속 볼 수 있도록 하여 계산을 용이하게 합니다.
  9. 1시간 배양 후 연동 펌프를 통해 매체 흐름을 켜서 체외 방광 모델 실행을 시작하고 모델이 켜지는 시간을 확인합니다.

4. 체외 방광 모델 유량 계산

  1. 체외 모델에 접종이 완료되고 배지 흐름이 시작되면 모델을 4시간 동안 실행할 수 있습니다. 매체 흐름을 잠시 일시 중지하고 배수 포트를 통해 부피 측정 플라스크의 폐기물 백에서 잔류 AUM의 전체 부피를 수집합니다. 수집된 볼륨을 기록하십시오.
    참고: 유속은 2.7단계에서 수집된 매체의 부피에서 계산할 수 있지만, 계산된 유량에 영향을 미치는 매체 회로 튜브의 잔류 공기 가능성을 줄이기 때문에 모델을 더 장시간(즉, 권장 4시간) 실행함으로써 보다 정확한 유량을 얻을 수 있습니다.
  2. 연동 펌프를 통해 매체 흐름을 재개하고 폐기물 봉투 배수 포트가 닫혀 있는지 확인하여 멸균 배수 시스템을 유지합니다.
  3. 체외 모델의 실제 유량을 계산하려면 다음 방정식을 사용하십시오.
    figure-protocol-2
    참고: 인간의 소변 생산을 복제하려면 0.55-1.0mL/분 범위의 유속이 권장됩니다.
  4. 매체 유속이 허용 범위를 벗어나 계산되면 반복실험을 폐기하고 연동 펌프의 rpm을 허용 범위 내에 맞게 조정합니다.

5. in vitro bladder model에서 플랑크톤 세포 샘플링

참고: 체외 방광 모델은 집단 역학을 모니터링하기 위해 실험 전반에 걸쳐 정기적으로 샘플링해야 합니다. 모든 모델은 접종 직후, AUM 흐름 활성화 시점, 접종 후 4시간 후(유속 계산 시) 및 모델이 종료되는 시점(막힘 또는 미리 결정된 종말점)에서 샘플링해야 합니다. >24시간 동안 모델을 실행하는 경우 CFU/mL를 모니터링하기 위해 24시간마다 샘플을 채취하는 것이 좋으며 사용자의 필요에 따라 추가 샘플을 채취할 수 있습니다.

  1. 방광 모델 스토퍼의 오염을 70% 에탄올로 제거하고 중앙 챔버에 접근할 수 있도록 제거합니다.
  2. 카테터 팁과 풍선을 피하고 혈청학적 피펫을 사용하여 중앙 챔버의 내용물을 부드럽게 혼합합니다.
  3. 혈청학적 피펫을 사용하여 챔버에서 10mL 샘플을 제거하고 멸균 튜브로 옮깁니다. 즉시 스토퍼를 70% 에탄올로 오염을 제거하고 교체하여 멸균되고 폐쇄된 배수 회로를 완성합니다.
  4. 피펫을 사용하여 샘플에서 1mL를 제거하고 연속 희석을 위해 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 분취합니다.
  5. pH 측정기를 사용하여 나머지 샘플의 pH를 측정하고 샘플이 완전히 혼합되고 pH 측정기가 사용 전에 보정되었는지 확인합니다.
  6. 샘플에서 예약된 1mL 분취액을 연속적으로 희석하고 앞서 단계 3.8.에서 설명한 대로 적절한 고체 매체에 플레이트하고 모든 희석액을 도금합니다.
    참고: 방광 모델에서 채취한 플랑크톤 샘플은 게놈 또는 분자 생물학 응용 분야(선택 사항)를 포함한 다른 분석에 적합합니다.

6. in vitro bladder 모델에서 생물막 관련 세포 샘플링

  1. 카테터 제거 및 준비
    참고: 체외 방광 모델의 생물막 샘플링은 종말점 분석으로, 모델을 비활성화하고 처리를 위해 카테터를 제거해야 합니다.
    1. 카테트에서 폐기물 봉투를 분리하고 풍선을 수축시켜 모델에 남아 있는 소변을 배출합니다. 멸균 집게를 사용하여 모델 바닥에서 카테터를 제거합니다.
    2. 제거한 카테터를 멸균 보드에 놓고 멸균 메스를 사용하여 절편에 필요한 지점에서 카테터를 절단합니다( 그림 2 참조).
    3. 카테터 절편이 내강을 노출시키기 위해 세로로 절단되었는지 확인하십시오. 그런 다음 멸균 겸자를 사용하여 카테터 절편을 멸균 PBS에 3회 담궈 비부착 세포를 제거합니다.
      참고: 다운스트림에서 카테터 절편을 이미징하는 경우, 즉 SEM을 사용하는 경우 1cm 절편을 그대로 두고(세로로 자르지 마십시오) 고정하기 전에 멸균 종이 타월로 내강에서 과도한 수분을 제거합니다.
  2. CFU/mL 계수를 위한 생물막 파괴
    참고: 생물막 관련 세포의 파괴를 자세히 설명하는 프로토콜은 생물막이 광범위하게 결정질 또는 점액질인 경우 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.
    1. 제조된 카테터 절편을 0.25% 트립신에 넣고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 사용되는 트립신 부피는 카테터를 덮는 데 필요한 최소 부피여야 합니다. 예를 들어, 수직으로 절단된 1cm 카테터 절편의 경우 0.25% 트립신 1mL로 충분합니다.
    2. 배양 후 카테터가 포함된 용액을 10분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 카테터 절편을 제거하고 폐기할 수 있습니다. 트립신을 비활성화하려면 3.8단계에서 설명한 대로 세포 용액을 멸균 PBS에 즉시 희석하고 적절한 고체 매체에서 CFU 개수를 위해 도금해야 합니다.
  3. 크리스털 바이올렛 염색을 통한 카테터 생물막 정량화
    1. 준비된 카테터 절편을 적절한 크기의 바닥이 평평한 웰 플레이트에 있는 웰에 추가합니다. 적절한 양의 0.1% 크리스털 바이올렛 용액을 사용하여 카테터 절편을 완전히 담그고 실온에서 15분 동안 정적으로 배양합니다. 멸균 카테터 섹션도 배경 대조군으로 포함되어 있는지 확인합니다.
    2. 플레이트에서 카테터 섹션을 제거하고 새 플레이트로 옮깁니다. 각 카테터 절편을 증류수로 두 번 세척합니다.
    3. 헹굼 후 카테터 절편을 새 플레이트로 옮기고 33% 아세트산으로 덮습니다. 실온에서 15분 동안 배양합니다.
    4. 플레이트에서 카테터 절편을 제거한 다음 플레이트 리더를 사용하여 멸균 카테터 절편이 포함된 웰을 배경 대조군으로 사용하여 각 복제에 대해 OD595nm 를 측정합니다.

7. 체외 방광 모델에서 항균 감수성 테스트

참고: 카테터 관련 요로 감염을 통제하는 것을 목표로 하는 대부분의 치료법은 표준 폴리 카테터와 호환되며, 체외 방광 모델 실험을 시작하기 전에 호환성을 확인하십시오.

  1. 항균 윤활제 젤
    참고: 카테터 삽입 시 윤활제 사용을 시뮬레이션하려면 폴리 카테터 삽입 직전인 2.1단계에서 이 단계를 수행해야 합니다. 카테터를 삽입한 후 모델을 즉시 연결하고 2.6단계를 수행해야 합니다. 접종 전에 젤이 희석되거나 배출되지 않도록 생략해야 합니다. 접종은 카테터 삽입과 같은 날에 이루어져야 합니다. 카테터와 함께 사용하도록 설계된 윤활제는 6 mL 또는 11 mL 용량의 개별 멸균 일회용 주사기로 포장됩니다. 약 5mL의 윤활제는 방광 모델의 목을 채우고 모델의 바닥을 코팅하는 데 적합합니다.
    1. 무균 기술을 사용하여 윤활제가 들어있는 주사기의 끝을 방광 모델의 목에 삽입하고 젤 5mL를 삽입하여 목을 채우고 챔버 바닥으로 들어갑니다.
    2. 베이스가 젤로 고르게 코팅되도록 모델을 회전한 다음 카테터 팁을 젤을 통해 밀어 모델에 폴리 카테터를 삽입하고 평소와 같이 풍선을 채워 고정합니다.
    3. 모델을 나머지 설정에 연결한 다음 소변이 배출되기 시작할 때까지 모델 루멘을 소변으로 채웁니다. 카테터 안구멍을 통해 소변이 배출되기 시작하자마자 접종 전에 젤 손실을 방지하기 위해 펌프를 중지하십시오.
      1. 소변이 37°C에 도달할 수 있도록 모델을 30분 동안 배양한 다음, 앞에서 설명한 대로 모델에 접종하여 젤 성분이 소변량으로 확산되는 시간의 균일성을 보장합니다.
    4. 3.5단계에서 설명한 대로 모델을 접종하고 연동 펌프를 켜기 전에 1시간 동안 배양하도록 둡니다. 펌프를 켤 때 1mL 플랑크톤 샘플을 채취하고 3.8단계에서 설명한 대로 CFU 개수에 대한 희석액을 플레이트아웃합니다.
  2. 관개 솔루션
    참고: 관개 솔루션은 종종 대량 또는 개별, 멸균, 일회용 "파우치"로 제공됩니다. 개별 용액을 사용하는 경우 실험 전에 사용할 카테터의 배액 포트와 호환되는지 확인하십시오. 벌크 관개 솔루션을 사용하는 경우 삼중 루멘 카테터를 사용하고 제조업체의 지침에 따라 제품 투여량/기간을 결정해야 합니다.
    1. 치료 전에 최소 4시간 동안 체외 모델을 실행하여 생물막 관련 커뮤니티가 확립할 수 있는 충분한 시간을 가졌는지 확인합니다. 모델이 4시간 동안 실행되면 매체 흐름을 일시 중지하고 5단계에 설명된 대로 체외 모델의 내부 챔버에서 전처리 샘플을 채취합니다.
      알림: 대량 관개 솔루션을 사용하는 경우 7.2.5 단계로 진행하십시오.
    2. 개별 관개 "파우치"를 사용하는 경우 카테터에서 폐기물 봉투를 분리하고 파우치와 함께 제공된 캡을 사용하여 폐기물 봉투를 밀봉합니다. 즉시 세수 용액 파우치를 카테터에 부착하고 가벼운 압력을 사용하여 제품을 중앙 내강에 짜냅니다. 제조업체의 지침에 따라 적용하십시오(예: 15분 적용).
    3. 권장 치료가 완료되면 잔류 용액이 카테터 눈 구멍을 통해 내부 챔버에서 세척 파우치로 배출되도록 한 다음 파우치를 분리합니다. 파우치의 남은 내용물은 폐기하거나 추가 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
    4. 카테터 배액구와 배설물 봉투 연결 포트를 70% 에탄올로 살균하고 다시 연결하여 멸균 밀폐형 배액 시스템을 완성합니다.
      알림: 관개 파우치를 사용하는 경우 7.2.7단계를 계속합니다.
    5. 삼중 루멘 카테터를 사용하는 경우 관개 루멘 포트를 70% 에탄올로 소독하고 제조업체의 지침에 따라 멸균 주사기를 사용하여 즉시 세척을 시작하십시오.
      알림: 관개하기 전에 쓰레기 봉투에 남아 있는 소변의 양을 측정하여 다운스트림 막힘 시간 또는 유속 계산에 설명할 수 있습니다.
    6. 관개가 완료되면 주사기와 쓰레기 봉투에 남아 있는 잔류 관개 용액을 버리십시오.
    7. 5단계에서 자세히 설명한 대로 체외 방광 모델 중앙 챔버에서 치료 후 샘플을 채취하고 연동 펌프를 통해 AUM 흐름을 재개하여 실험을 계속합니다.

8. 체외 방광 모델 실험 종료

참고: P. mirabilis 와 같은 우레아제 양성 유기체는 결정질 생물막 형성 을 통해 요로 카테터를 막을 수 있습니다. 따라서 막힘은 체외 방광 모델에 대한 생물학적으로 관련된 종말점으로 사용될 수 있으며, 결정질 생물막으로 카테터 안구멍을 완전히 폐색하고 유리 "방광"의 중앙 챔버에서 AUM의 부피를 증가시킴으로써 시각적으로 식별됩니다(그림 3).

  1. 체외 방광 모델이 막힘 또는 정의된 런타임일 수 있는 미리 결정된 종말점까지 실행되면 연동 펌프를 통한 AUM 흐름을 끄고 5단계에서 설명한 대로 중앙 챔버에서 종말점 샘플을 채취합니다.
  2. 수조 흐름을 끄고 체외 방광 모델에서 미디어 회로와 수조 회로 튜브를 분리합니다.
  3. 체외 방광 모델에서 마개를 제거하고 혈청학적 피펫을 사용하여 잔여 소변의 전체 부피를 제거합니다. 오염된 매체를 적절하게 폐기합니다(즉, 오토클레이브 살균).
  4. 쓰레기 봉투를 비우고 잔여 매체를 버리십시오. 카테터 포트에서 카테터 폐기물 봉투를 분리하고 폐기하십시오.
  5. 모델에서 카테터를 제거하기 전에 주사기를 사용하여 카테터 풍선을 천천히 수축시킵니다.
    참고: 우레아제 양성 박테리아 종을 사용하는 경우 카테터가 체외 모델의 유리벽에 "달라붙을" 수 있습니다. 카테터에 많은 힘을 가하지 말고 대신 8.6단계로 진행하십시오.
  6. 체외 모델을 5% 항균 세정 용액(재료 표 참조)에 하룻밤 동안 담근 다음 물로 철저히 씻어 잔여 소독제가 제거되었는지 확인합니다. 살균을 위한 오토클레이브.
    알림: 우레아제 양성 종을 사용하는 경우 소독 용액에 5% w/v 구연산을 첨가하여 중앙 챔버의 생체 광물화를 용해하는 데 도움이 됩니다. 이 산성 용액은 또한 결정질 생물막 침전물을 분해하여 모델에 달라붙은 카테터를 분리하는 데 도움이 됩니다.
  7. AUM 저장소에서 미디어 회로 튜브를 분리하고 잔여 미디어를 폐기합니다. 튜브를 통해 물로 세척하여 잔류 AUM과 오토클레이브를 제거합니다.
  8. 정확한 막힘 시간을 계산하려면 쓰레기 봉투의 최종 부피를 기록하고 4.4단계의 방정식과 이전에 계산된 유속을 사용하여 막힘 시간을 결정합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

체외 방광 모델의 성공적인 작동은 우수한 무균 기술을 연습하고 실험 전반에 걸쳐 매체 탁도를 주의 깊게 관찰하는 데 달려 있습니다(그림 3). 접종 전, 멸균 AUM은 옅은 노란색을 띠었고 체외 방광 모델 중앙 챔버에서 투명했습니다(그림 3A). 배지 저장소의 AUM은 발생하는 탁도 변화가 용액에서 염의 침전 또는 매체의 오염을 나타낼 수 있으므로 실험 전반에 걸쳐 명확하게 유지되어야 합니다. 매체 저장소 또는 매체 회로 튜브의 AUM이 흐려지거나 색상이 급격히 변하는 경우 복제를 폐기하고 반복해야 합니다. 접종 후, 체외 방광 모델 중앙 챔버에서 AUM의 탁도 증가가 명확하게 보입니다(그림 3B). 탁도의 변화는 P. mirabilis와 같은 우레아제 양성 유기체에서 더 뚜렷하게 나타나는 경우가 많지만, 우레아제 음성 유기체에서는 접종 후에도 여전히 볼 수 있어야 합니다. AUM 흐름이 시작된 후, 플랑크톤 세포가 씻겨 나감에 따라 AUM 탁도의 감소가 종종 관찰되며, 이는 모델에서 생존 가능한 세포가 부족함을 나타내지 않습니다. 중앙 챔버에서 매체 수준을 관찰하는 것은 우레아제 양성 유기체를 사용하는 경우 차단 시간을 결정하는 데에도 사용할 수 있습니다(그림 3C). 모델이 실행될 때 카테터 눈구멍과 끝이 완전히 보여야 쓰레기 봉투로 적절하게 배출된다는 것을 알 수 있습니다. 막히면 중앙 챔버의 AUM 수준이 카테터 안구멍과 팁 위로 올라가 실험이 모든 종말점 판독 및 종결에 대한 준비가 되었음을 나타냅니다. 실험 중에 체외 방광 모델 매체 회로의 압력 효과로 인해 모델이 차단된 것처럼 보일 수 있습니다. 막힘이 의심되는 경우 튜브의 잠재적인 기포나 꼬임으로 인해 "에어록"이 발생하고 카테터가 배출되는 것을 방지할 수 있으므로 분석을 종료하기 전에 AUM 회로, 카테터 및 배설물 백 튜브가 팽팽한지 확인하십시오.

체외 방광 모델 실험 중에 플랑크톤 샘플링은 모델 내의 성장 역학과 CAUTI의 진행에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 세포 성장, pH 및 생물막 형성은 모델을 종료할 필요 없이 실험 전반에 걸쳐 모두 모니터링할 수 있습니다(그림 4). 우레아제 양성 유기체를 사용하는 경우 차단 시간 계산을 생물막 형성 속도의 척도로 활용하고 다양한 박테리아 균주의 특성을 비교하는 데 사용할 수 있습니다(그림 4). P. mirabilis의 야생형 균주와 LPS 돌연변이(waaC에 mini-tn5 삽입)를 비교한 결과, 막힘까지의 시간이 연장되어 돌연변이체의 생물막 형성이 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 4). 우레아제 음성 유기체는 일반적으로 체외 방광 모델을 차단하지 않으므로 실험 전에 설정된 종점을 결정하는 것이 좋습니다. 어떤 경우에는 우레아제 음성 유기체로 인해 카테터가 막힐 수 있습니다. 예를 들어, 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae)의 우레아제 음성 균주는 광범위한 점액성 생물막을 생성할 수 있지만, 이러한 균주는 일반적으로 우레아제 양성 생물막보다 배액을 차단하는 데 훨씬 더 오래 걸리므로 종점을 설정하는 것이 좋습니다.

방광 모델 실험 전반에 걸쳐 pH를 측정하면 CAUTI의 진행 상황뿐만 아니라 변형률 간 차이에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 우레아제 음성 유기체를 사용하는 경우, 시험관 내 방광 모델 중앙 챔버의 pH는 실험 전반에 걸쳐 대체로 안정적으로 유지되어야 하지만, 실험 과정에서 집단 역학이 변화함에 따라 pH의 작은 변동이 예상됩니다. 체외 모델에 우레아제 양성 유기체를 접종하면 시간이 지남에 따라 pH가 크게 증가하며, 일반적으로 막힘 시 가장 높은 pH가 관찰되며, ~8-9의 높은 pH 판독값이 관찰될 수 있습니다(그림 4B).

플랑크톤 CFU/mL의 계수는 체외 방광 모델링의 중요한 구성 요소로, 작업자는 접종의 성공 여부를 평가하고 실험 진행 상황을 모니터링할 수 있습니다. 실험이 끝날 때 CFU/mL를 측정하면 서로 다른 박테리아 균주 간의 방광 집락화의 차이를 강조할 수 있습니다. P. mirabilis의 mini-Tn5 돌연변이 균주를 야생형과 비교할 때, 막힘 시 CFU/mL의 현저한 감소가 관찰되었습니다(그림 4C). 또한, 카테터 표면의 생물막에서 CFU를 계수하고 생물막 바이오매스를 정량화하면 카테터화된 요로에 서식하는 다양한 병원체의 능력에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 야생형 P. mirabilis 균주 HI4320과 클로르헥시딘에서 계대된 분리물 사이의 생물막 형성 차이를 결정하기 위해 크리스탈 바이올렛 염색을 사용했습니다(그림 5). 595 nm에서 광학 밀도 측정은 클로르헥시딘에서 계대된 분리체가 야생형 및 클로르헥시딘이 없는 상태에서 계대된 대조군에 비해 생물막 형성의 감소를 보여주었습니다.

체외 방광 모델의 목적은 CAUTI 틈새 시장을 정확하게 복제하는 것이므로 임상적으로 관련된 환경에서 CAUTI를 치료하는 것을 목표로 하는 항균 요법의 효과를 연구하는 데에도 모델을 활용할 수 있습니다. 우레아제 양성 유기체의 경우, 처리된 모델과 처리되지 않은 모델의 차단 시간을 비교하면 치료 효과에 대한 유용한 통찰력을 얻을 수 있습니다. P. mirabilis를 0.02% 클로르헥시딘 방광 세척 용액으로 접종한 체외 방광 모델을 치료한 경우, 처리하지 않거나 0.9% 식염수로 처리한 모델에 비해 막힘 시간이 유의하게 연장되었습니다(그림 6A). 또한, 체외 방광 모델은 항균 치료제의 살균 활성을 연구하는 데 활용될 수 있습니다. 항균 처리 후 플랑크톤 및 생물막 관련 세포의 CFU/mL 변화를 모니터링하면 치료의 효과를 확인할 수 있습니다. P. mirabilis를 접종한 체외 방광 모델을 치료한 결과, 제조업체의 지침에 따라 적용했을 때 처리되지 않은 0.9% 식염수 관개 모델에 비해 처리 직후 플랑크톤 CFU/mL가 >7log 감소한 것으로 나타났습니다(그림 6B).

figure-results-1
그림 1: in vitro bladder model의 주요 구성 요소에 대한 개략도. (A) 방광 모델(폐쇄형 배수 시스템): (1) 방광을 시뮬레이션하는 이중벽 유리 챔버 (2) 매체 입구, AU는 연동 펌프를 통해 방광 모델 내부 챔버로 공급됨 (3) 순환 수조를 통해 외부 챔버로 공급되는 물 유입구 (4) 물 배출구 (5) 폴리 카테터, 내부 챔버에 삽입 (6) 배수 루멘 연결 지점; 쓰레기 봉투/관개 파우치 연결 지점 (7) 배액 봉투, 소변 유출을 수집합니다. (B) 체외 방광 모델의 설정 및 모델을 통한 매체 및 물의 흐름 방향을 묘사하는 개략도. 인공 소변은 실온에서 매체 저장소(1)에 보관하고 실험 기간 동안 ~ 0.75mL min-1의 일정한 유속으로 연동 펌프(2)를 통해 모델에 공급됩니다. 매체는 방광(3)을 나타내는 이중벽 유리 용기의 중앙 챔버로 흘러 들어가고 폴리 카테터(4)의 아이홀을 통해 배액 백(5)으로 배출되어 멸균 폐쇄형 배액 시스템을 완성합니다. 체외 방광 모델은 이중벽 유리 용기의 외부 챔버를 통해 흐르는 순환 수조(6)를 통해 37°C의 일정한 온도로 유지됩니다. 점선은 실리콘 튜브를 나타내고 화살표는 흐름의 방향을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 생물막 관련 세포를 처리하기 위한 요로 카테터 절편. 다운스트림 생물막 정량화를 위한 절개를 위한 요로 카테터의 예. (A) 카테터는 팁/안구멍에 근접한 8cm 영역(대부분의 생물막 형성이 관찰되는 곳)에서 위도방향으로 먼저 절단됩니다. 1cm 절개는 메스로 제거하며, 일반적으로 재현성 처리의 어려움으로 인해 수축된 카테터 풍선이 있는 영역을 피합니다(1-3). (B) 카테터가 처음에 1cm 조각으로 절단되면 중앙 내강을 따라 또 다른 세로 절단을 하여 추가 생물막 정량화, 즉 결정 바이올렛 염색의 CFU/mL 계수를 위해 존재하는 모든 생물막을 노출시킵니다. 파선은 단면 점을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 체외 방광 모델 실험의 단계. 실험의 여러 단계에 걸친 시험관 방광 모델 중앙 챔버의 이미지. (A) 접종 전 체외 방광 모델 중앙 챔버의 AUM. 중앙 챔버의 매체는 완전히 투명하여 성공적인 멸균을 나타내며, 카테터 끝과 눈구멍이 매체 선 위로 표시되어 카테터가 성공적으로 배출되고 있음을 나타냅니다. (B) P. mirabilis를 접종한 후 체외 방광 모델 중앙 챔버의 배지(접종 후 4시간). 성공적인 접종은 배지의 탁도 증가로 표시됩니다. 카테터 끝과 눈구멍의 가시성은 AUM이 카테터를 통해 성공적으로 배출되고 있으며 막힘이 발생하지 않았음을 나타냅니다. (C) 차단된 체외 방광 모델의 예. P. mirabilis를 접종하고 그에 따른 생물막 형성 및 광물화로 인해 카테터 안구멍이 막혀 배액이 차단되고 중앙 챔버의 매체 수준이 카테터 팁 위로 상승하게 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 체외 방광 모델에 대한 종말점 측정은 막힐 때까지 실행됩니다. P. mirabilis의 임상 균주인 RS47(WT)과 약독화된 생물막 형성이 있는 돌연변이 균주 RS47-2(돌연변이)를 접종한 체외 방광 모델의 막힘 시점의 종말점 측정 예. (A) P. mirabilis의 WT 및 돌연변이 균주의 차단 시간 (h). (B) 막힘 시점의 시험관 내 방광 모델의 pH. (C) 막힘 시 시험관 내 방광 모델 챔버에 있는 플랑크톤 세포의 CFU/mL. 모든 데이터는 5개의 생물학적 복제물의 평균을 나타냅니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)를 보여줍니다. *p ≤ 0.05; **P ≤ 0.01. 이 그림은 Clarke et al.46에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 체외 방광 모델의 생물막 관련 세포 측정. P. mirabilis 생물막 형성의 정량화, 야생형 균주 HI4320을 크리스탈 바이올렛 염색 및 595nm에서 광학 밀도(OD) 측정을 통해 클로르헥시딘(CHD) 유무에 관계없이 계대된 적응 집단과 비교합니다. 무게 : P. mirabilis HI4320; 1, 3, 5: CHD 노출이 없는 통로 제어; 2, 4, 6: 4μg/mL CHD에서 HI4320 계대배양. 모든 데이터는 5개의 생물학적 복제물의 평균을 나타냅니다. 오차 막대는 SEM을 표시합니다. *p ≤ 0.05; **P ≤ 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: 항균 치료 후 체외 방광 모델에서 측정한 결과. 플랑크톤 샘플은 0.02% 클로르헥시딘 항균 용액(100mL) 또는 0.9% 식염수 대조군으로 세척한 후 P. mirabilis를 접종한 체외 방광 모델에서 채취했습니다. (A) 관개 후 체외 방광 모델의 막힘 시간. (B) 관개 처리 직후의 플랑크톤 CFU/mL. 모든 데이터는 5개의 생물학적 복제물의 평균을 나타냅니다. 오차 막대는 SEM을 표시합니다. *p ≤ 0.05; *P ≤ 0.01; *P ≤ 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

카테터화된 요로는 실험실 환경에서 복제하기 어려울 수 있는 복잡한 생물학적 틈새를 나타냅니다. 체외 방광 모델은 CAUTI를 시뮬레이션하기 위해 설계되었으며, 표준 요로 카테터를 사용하여 임상 실습에서 사용되는 멸균 폐쇄형 배액 시스템을 복제합니다. 카테터화된 요로는 감염에 매우 취약하며, 이는 요로 카테터가 CAUTI 6,55의 발병에 대한 가장 큰 단일 위험 인자인 것으로 입증되었습니다. 이에 상응하여, 신중한 무균 기술은 체외 방광 모델의 성공에 매우 중요합니다. AUM의 탁도는 오염되거나 만료된 매체가 시간이 지남에 따라 흐려져 모든 복제물을 폐기해야 하기 때문에 무균 상태의 명확한 지표입니다. 시험관 내 방광 모델을 접종하고 샘플링할 때도 신중한 무균 기술을 사용해야 하는데, 준비된 접종물을 추가하기 위해 중앙 챔버를 열면 멸균되고 폐쇄된 배액 시스템이 파손되어 체외 방광 모델이 오염에 취약해지기 때문입니다. 중앙 챔버의 오염을 방지하기 위해 삼중 루멘 카테터를 사용하여 플랑크톤 세포 집단을 샘플링할 수 있습니다(폐 루멘을 고정하고 추가 루멘을 통해 배출). 4시간 시점에서 약간의 유실이 예상되지만, 이 시점에서 생존 가능한 플랑크톤 세포가 열거되지 않은 경우 문제 해결이 필요할 수 있습니다. 4시간 후에 생존 가능한 세포가 열거되지 않으면 박테리아 집락화를 더 잘 지원하기 위해 사용된 접종물 밀도 또는 AUM 제형을 최적화해야 할 수 있습니다. 또한 접종물 세척은 미디어 회로에 문제가 있음을 나타낼 수 있습니다. 튜빙 내부의 꼬임은 적절한 배수를 방해하여 박테리아 성장을 방해할 수 있는 독성 대사 산물을 축적할 수 있으며, 미디어 튜빙을 통해 세척하는 데 사용되는 잔류 소독제는 살균 효과를 가질 수 있습니다.

이 프로토콜은 이전에 Nzakizwanayo 등이 설명한 바와 같이 AUM의 제조를 자세히 설명하며, Proteus mirabilis 및 Escherichia coli 43,45,46,48을 포함한 저명한 CAUTI 병원체와 함께 체외 방광 모델에서 사용하도록 이전에 검증되었습니다 . 그러나 다른 병원체의 성장을 위해 선택하기 위해 프로토콜에 사용되는 AUM 제형을 수정할 수 있는 여지가 있습니다. 수많은 다양한 AUM 공식이 발표되었으며 대신 미디어 회로 28,56,57,58,59,60에서 사용할 수 있습니다. 또한 배지 저장소의 AUM에 영양소 또는 항생제를 보충하여 특정 병원체의 성장을 선택할 수 있습니다. 역사적으로 체외 방광 모델에는 풀링된 인간 소변도 제공되었지만, 체외 방광 모델 복제를 실행하는 데 필요한 많은 양의 배지로 인해 인간 샘플 수집이 불가능할 수 있습니다53,54. 또한, 호르몬, 염 및 단백질의 농도와 수화 상태의 차이가 박테리아 성장 및 생물막 형성에 영향을 미치는 것으로 나타남에 따라 인간 소변의 구성은 환자 샘플마다 크게 다를 수 있으며, 이는 박테리아 성장 및 생물막 형성에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다 38,39,61,62.

위의 프로토콜은 후기 단계 CAUTI를 복제하는 ~1010 CFU/mL를 가진 체외 방광 모델의 접종에 대해 자세히 설명합니다. 그러나 체외 방광 모델의 접종 부위는 향후 분석에서 CAUTI의 초기 단계, 즉 요로 카테터의 초기 집락화 및 방광으로의 상승을 더 잘 복제하기 위해 수정될 수 있습니다. 체외 모델을 설정하기 전에 알려진 박테리아 접종물로 폴리 카테터를 수동으로 오염시키면 CAUTI의 초기 단계에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 실제로, 이전 연구에서 접종 밀도는 초기 단계의 감염을 복제하기 위해 수정되었습니다. 예를 들어, Nzakizwanayo et al. 더 낮은 시작 CFU/mL(ca. 103 CFU/mL)를 투여하여 초기 감염을 재현한다47. 그러나 접종물 밀도를 변경하면 막히는 시간이 길어질 수 있으며 실험 전에 추가 검증이 필요하다는 점에 유의할 가치가 있습니다.

또한, 프로토콜은 박테리아 단일배양으로 체외 모델을 접종하는 것에 대해 자세히 설명하지만, 모델에 진균 병원체를 접종할 수 있는 여지가 있습니다. 과거 연구에 따르면 CAUTI의 최대 8%가 Candida spp.의 감염으로 인해 발생하며, 이는 종종 항진균 치료에 내성적인 생물막을 생성할 수 있습니다27,63. 또한, 시험관 내 방광 모델은 다미생물 CAUTI 연구를 수용하기 위해 수정될 수 있습니다. 실제로, CAUTI의 최대 86%가 다미생물성이며, 이러한 감염은 종종 단일종 감염보다 더 심각한 증상 및 더 높은 사망률과 관련이 있는 것으로 제안되었습니다 27,64,65,69. 시험관 내 모델에는 다미생물 생물막의 형성과 CAUTI의 진행을 연구하기 위해 여러 종을 접종할 수 있지만, 접종 전에 다미생물 군집의 신중한 검증과 접종 밀도의 변형을 수행해야 합니다. 이전 연구에서는 시험관 내 방광 모델을 사용하여 E. faecalis가 있는 이중 종 CAUTI와 비교하여 단일 종 P. mirabilis CAUTI의 생물막 형성 차이를 모니터링했으며, 균주 간의 대사 상호 작용을 강조하여 단일 종 감염에 비해 향상된 생물막 형성을 달성했습니다70.

CAUTI를 연구하기 위해 시험관 내 방광 모델을 사용하는 주요 이점은 표준 요로 카테터 표면의 생물막 형성을 관찰할 수 있다는 것입니다. CAUTI에서 생물막의 형성은 종종 요로 병원체가 고착 할 수있는 소변의 유기 성분으로 구성된 카테터 내강에 컨디셔닝 필름의 형성에 의해 시작됩니다2 , 18 , 71 , 72 , 73 . 생물막 형성을 연구하는 데 사용되는 표준 분석은 종종 AUM이 아닌 표준 박테리아 성장 매체를 사용하며 종종 폴리스티렌 마이크로 플레이트 또는 페그, 즉 캘거리 장치에 대한 준수를 기반으로 합니다. 그러나 과거 연구에서는 시스템의 영양 환경, pH 및 산소 수준뿐만 아니라 흐름 및 표면 구조 (실리콘 대 플라스틱)의 차이와 같은 물리적 특성이 생물막 형성에 영향을 미칠 수 있음을 시사했습니다 36,37,74,75,76,77,78. 또한, AUM의 폐쇄 시스템에서 P. mirabilis와 같은 광범위한 우레아제 활성을 가진 박테리아를 배양하면 독성 대사 산물이 축적되어 세포 사멸을 초래할 수 있습니다78,79. 이는 중앙 챔버의 AUM이 배지 회로를 통해 지속적으로 새로운 배지로 교체되어 임상적으로 보다 관련성이 높은 조건에서 CAUTI 생물막을 연구할 수 있기 때문에 시험관 내 방광 모델에서 완화됩니다45. 체외 방광 모델의 일상적인 실행과 모델에 대해 선택된 종말점은 모델에 우레아제 양성 또는 음성 유기체가 접종되었는지 여부에 따라 크게 달라집니다. 이론적으로 체외 모델은 적절한 양의 AUM이 공급되고 모델의 무균 상태가 유지되는 경우 무기한 실행될 수 있습니다. 그러나 막힘 또는 임의의 일 수에 관계없이 실험 전에 엔드포인트를 선택하는 것이 좋습니다. 일반적으로 우레아제 음성 유기체를 접종한 시험관 내 모델을 임상 환경을 시뮬레이션하기 위해 ≤7일 동안 실행하는 것이 권장되며, 이는 일반적으로 대부분의 유기체에서 생물막 형성을 관찰하기에 충분하며, 표준 모범 사례에 따르면 카테터는 눈에 띄게 감염되면 교체해야 한다는 것을 나타내기 때문에 임상 중재에 따라 유지해야 합니다 1,2, 3,47,48. 우레아제 양성 유기체는 결정질 생물막을 생성할 가능성이 높지만, 체외 방광 모델 막힘에 따라 우레아제 양성 균주 내에서 많은 변화가 있으며, Proteus mirabilis의 일부 균주는 10시간 이내에 카테터 막힘을 일으키고 다른 균주는39,46을 차단하는 데 30시간 이상이 걸립니다. 시험관내 방광 모델 실험 전에 표준 우레아제 테스트를 사용하여 모델을 막히게 실행할지 또는 사전 정의된 종점(80)으로 실행할지 여부를 결정할 수 있습니다.

아마도 생물막 형성을 연구하기 위해 시험관 내 방광 모델을 사용하는 주요 한계는 생물막 측정이 요로 카테터의 제거 및 해부가 필요하기 때문에 종말점 판독이라는 것입니다. 반대로, 플랑크톤 샘플은 실험 중 어느 시점에서나 시험관 방광 모델에서 채취할 수 있습니다. 또한 체외 방광 모델에서 생물막 샘플을 채취하면 수많은 추가 다운스트림 기술을 사용하여 생물막 생산을 더 잘 정량화할 수 있습니다. 과거 연구에서는 결정질 생물막에 존재하는 칼슘과 마그네슘의 양을 정량화하기 위해 화염 측광법을 활용했으며, 더 복잡한 염색을 사용하여 우레아제 음성 생물막의 EPS 매트릭스 구성 요소를 정확하게 식별할 수 있습니다 45,73,81,82,83,84.

이 연구는 또한 CAUTI 치료를 목표로 하는 치료법의 효과를 연구하기 위해 체외 방광 모델을 적용하는 방법을 설명합니다. 체외 방광 모델은 AUM의 사용과 같은 CAUTI 틈새 시장의 중요한 측면뿐만 아니라 임상적으로 관련된 생물막 형성 및 CAUTI에서 볼 수 있는 유기 부하 증가를 시뮬레이션합니다. 항생제와 같은 치료제를 AUM 탱크에 직접 첨가하여 임상적으로 관련된 약물 생체이용률을 시뮬레이션할 수 있으며, 과거 연구에서는 항생막 효과를 입증하기 위해 티오리다진(thioridazine) 및 플루옥세틴(fluoxetine)과 같은 용도 변경된 약물을 활용했습니다81. 또한, 최소 억제 농도 분석 및 박테리아 현탁액 검사는 종종 살생물제의 항균 활성을 추론하는 데 사용되지만, 분석법이 실제 살생물제 감수성과 상관관계가 있음을 시사하는 증거는 거의 없습니다 41,85,86,87,88. 체외 방광 모델은 요로 카테터의 존재와 CAUTI 틈새 시장의 대표적인 시뮬레이션으로 인해 항균 윤활제 젤 및 관개 용액과 같은 제품을 제조업체의 지침에 따라 테스트할 수 있기 때문에 CAUTI를 치료하거나 예방하기 위한 살생물제 테스트에 유리합니다. 과거 연구에서는 파지 요법의 효과를 확인하기 위해 체외 방광 모델을 사용했으며, 파지 치료가 P. mirabilis가 체외 방광 모델을 차단하는 시간을 100시간 이상 연장할 수 있음을 입증했습니다47. 체외 방광 모델에서 표준 크기의 폴리 카테터를 사용한다는 것은 또한 항균 활성을 위해 새로운 코팅된 카테터를 분석할 수 있음을 의미합니다. Slate et al. 의 과거 연구.테라노스틱 시프로플록사신 코팅으로 코팅된 카테터가 체외 방광 모델에서 P. mirabilis의 막힘 시간을 ~60시간 연장할 수 있음을 입증했습니다48. 이는 CAUTI 치료를 목표로 하는 새로운 치료법 연구에서 체외 방광 모델의 잠재적 응용을 강조하며, 생물학적으로 관련된 시뮬레이션된 CAUTI 틈새 시장에서 항균제를 보다 정확하게 평가할 수 있습니다.

공개 사항

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

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이 프로토콜 개발에 대한 전문 지식을 공유해 주신 Jonathan Nzakizwanayo 박사와 Anthony J. Slate 박사에게 감사드립니다. University of Bath에서의 연구는 V.B. (MR/N0137941/1)의 학생으로 Medical Research Council GW4 Biomed DTP의 자금 지원을 받았습니다. B. V. J.는 또한 Dunhill Medical Trust(RPGF1906\171)의 자금 지원을 받습니다. O.E.C.의 연구는 Kidney Research Northwest(RCN: 1144798)의 지원을 받았습니다. 그림 1 은 Biorender.com 사용하여 만든 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
313 급속 부하 펌프헤드 확장Watson-Marlow313연동 펌프 - 추가 펌프헤드 확장 
323S/D 수동 제어 가변 속도 펌프Watson-Marlow323S/D연동 펌프
3L 침대 가방, 레버 탭이 있는 멸균  그레이트 베어 헬스케어 GDW173
3mm 내경 백금 경화 실리콘 튜브Fisher10111801소형 AUM 회로 튜브(펌프 튜브를 모델에 연결)
5mm 내경 백금 경화 실리콘 튜브Fisher10539201중간 AUM 회로 튜브(펌프 튜브를 AUM 저장소에 연결)
염화암모늄(NH4Cl)Fisher11473713
무수 황산나트륨(Na2SO4)Fisher11498717
Azlon 테이퍼 커넥터 피셔10712807AUM 회로에서 다양한 길이의 튜브를 연결하는 데 사용됩니다
가방 걸이 그레이트 베어 헬스케어 10705P
Bochem 핀치 콕 튜브 클램프, 직경 25mm셔11805101
염화칼슘(CaCl2)피셔10021681
구연산 일수화물 MerckC1909-500G실험 후 모델에서 결정질 생물막을 제거하는 데 사용됩니다. 
피셔브랜드  유리 눈금 클래스 B 유형 1 피펫피셔11992168지루한 마개 젤라틴을 통해 AUM이 있는 체외 블레이더 모델을 공급하는 데 사용
VWR24360.233
그래프패드 프리즘 10그래프패드V10.0체외 방광 모델 결과 및 통계 분석을 그래프로 표시하는 데 사용되는 분석 소프트웨어. 
Hanna HI 2211-02 pH 벤치탑 측정기Phillip Harris PP00057414
시험관 내 방광 모델 --이전에 Nzakizwanayo et al. (2019).
Instillagel 6 mL 윤활제 젤mydoctorshop.co.uk40-006섹션 7.1에 사용된 윤활제 젤; 다른 공급업체도 이용 가능합니다.
Kartell Plastilab 고르지 않은 테이퍼 커넥터Fisher 11914289직경의 튜브를 연결하는 데 사용
MacConkey 소금 없는 한천(탈수)Fisher10472643떼를 지어 다니는 박테리아의 단일 콜로니, 즉 Proteus mirabilis
염화마그네슘 육수화물(MgCl2.6H2O)Fisher10386743
일칼륨 인산염(KH2PO4)Fisher10573181
Nalgene Y자형 커넥터Fisher10186070하나의 AUM 저장소(탱크당 1-4개 모델)에서 여러 AUM 회로를 실행하는 데 사용됩니다.
염화칼륨(KCl)Fisher10375810
Pyrex 흡입기 병(간유리 측면 소켓 포함), 용량: 5000mLFisher11347884AUM 저장소
무 마개(보어가 있음), 직경 외부: 37mm, 빨간색, 직경: 37mmFisher11517612AUM 저장소에 사용 및 AUM
이 있는 시험관 내 모델 공급에 사용됩니다.크기 14 프랑스 100% 실리콘 폴리 카테터, 팽창용 멸균 물 주사기 포함 그레이트 베어 헬스케어 4833-0514
염화나트륨(NaCl)피셔10735921
옥살산나트륨(Na2C2O4)Fisher10442211
Teknon Biocleanse 농축액 살생물제 클리너 5L 피셔12447580실험 후 모델 멸균에 사용 구
연산삼나트륨(Na3C6H5O7)피셔11434993
트립톤 콩 국물피셔10198002
요소(CH4N2O)피셔10404185
Uro-Tainer M NaCl 0,9%B.BraunFB99833섹션 7.2. 에 사용되는 식염수 방광 관개 파우치;
Watson-Marlow Pumpsil 내경 1.6mm 백금 경화 실리콘 튜브Fisher12406280두꺼운 AUM 회로 튜브(perstaltic 펌프에 사용)
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