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방법 논문

유세포분석을 사용하여 손상된 척수에서 미세아교세포(microglia) 및 말초 침투 대식세포(peripheral infiltrating macrophages in the injured spinal cords) 확인

1.2K 조회수

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DOI:

10.3791/67967

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2025년 6월 24일

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1Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Laboratory Medicine, Bengbu Medical University, 3Anhui Province Key Laboratory of Immunology in Chronic Diseases, Bengbu Medical University, 4The Second Affiliated Hospital of South China University, 5Anhui Province Key Laboratory of Basic and Translational Research of Inflammation-related Diseases, Bengbu Medical University

이 논문에서

요약

손상된 척수에서 미세아교세포(MG)와 말초 침투 대식세포(Mø)를 식별하는 것은 어렵습니다. 이 프로토콜에서는 유세포 분석법(FCM)을 사용하여 각각 M1-like MG, M2-like MG, M1-like Mø 및 M2-like Mø를 식별했습니다. 이 기술은 MG와 Mø의 역할을 이해하기 위해 다른 중추 신경계 질환에도 적용될 수 있습니다.

초록

건강한 척수에서는 말초 침투 대식세포가 거의 검출되지 않으며, 미세아교세포(MG)는 식세포작용(phagocytosis), 세포 파편을 제거하고, 신경 영양 인자(neurotrophic factor)를 생성하여 척수 미세환경의 안정성을 유지하는 데 참여합니다. 척수 손상(SCI) 후 MG가 활성화되고 말초 면역 세포가 손상된 척수에 침투합니다. 이러한 면역 세포 중 활성화된 MG와 말초 침윤 대식세포(Mø)는 SCI의 병리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 이 세포는 전염증성(M1-like) 및 항염증성(M2-like) 표현형으로 구별할 수 있습니다. 그러나 이들을 구별하는 것은 형태학의 유사성과 많은 세포 마커로 인해 어렵습니다. 생물의학 분야에서 널리 사용되는 기술인 유세포분석법(FCM)은 단일 실험에서 세포 크기, 입자 크기, 세포 표면 및 세포 내 마커와 같은 여러 세포 매개변수를 동시에 검출할 수 있습니다. 수년간의 연구를 통해 척수에서 MG와 Mø를 식별하기 위해 FCM을 시도했으며 궁극적으로 안정적인 검출 방법을 개발하기 위해 지속적으로 최적화되었습니다. 이 방법을 사용하면 CD45, CD11b, CD68, CCR7 및 기타 마커의 발현 프로파일을 검출하여 SCI 후 M1/M2 유사 MG 및 M1/M2 유사 Mø를 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 CD11b+CD45−/lowCD68+CCR7+, CD11b+CD45-/lowCD68+CCR7-, CD11b+CD45highCD68+CCR7+ 및 CD11b+CD45highCD68+CCR7- cell은 각각 M1-like MG, M2-like MG, M1-like Mø 및 M2-like Mø로 식별될 수 있습니다.

서론

척수 손상(SCI)은 다양한 이유로 인한 척수 손상의 결과입니다. SCI는 장애율이 높고, 현재 효과적인 치료법이 없어 세계에서 가장 심각한 공중 보건 문제 중 하나가 되고 있다 1,2. SCI의 병태생리학적 과정은 복잡하며 두 단계로 나뉩니다. 처음에는 부상으로 인한 기계적 외상이 즉시 급성 세포 기능 장애와 세포 사멸을 유발합니다. 그런 다음 2차 손상은 며칠, 몇 주 또는 몇 달에 걸쳐 세포 기능 장애와 세포 사멸로 이어집니다. 2차 손상 메커니즘 내에서 염증은 2차 손상의 심각성을 결정하는 핵심 요인으로 입증되었으며, 궁극적으로 세포 사멸과 세포 기능을 좌우합니다3. 염증 반응의 특징은 손상된 척수 내에 염증 세포가 침투하고 활성화되어 염증 세포와 염증 인자를 증가시키고, 염증성 미세환경을 생성하고, 결국 척수 기능 장애를 유발한다는 것이다4.

중추신경계(CNS)의 미세아교세포와 말초 침윤 대식세포는 척수 손상(SCI) 후 염증 반응에 중요한 역할을 합니다5,6. 중추신경계의 상주 대식세포인 미세아교세포는 중추신경계 세포의 5%-10%를 구성하며 SCI 회수에 필수적입니다 7,8. 미세아교세포(Microglia)는 SCI 후 세포 파편을 삼키고 제거하여 치유 흉터의 형성을 매개할 수 있습니다 9,10. 그러나 미세아교세포의 과도한 활성화는 지속적인 염증 반응을 유발하고 신경교세포 반흔의 형성을 촉진하여 축삭 재생을 방해할 수 있습니다11. SCI 후, 활성화 된 마이크로 아교 세포는 주로 M1 유사 및 M2 유사12,13의 두 가지 표현형을 나타냅니다. M1 유사 표현형은 전염증성(pro-inflammatory)으로, 세포 사멸(cell apoptosis) 및 2차 손상에 기여하는 염증 인자의 합성을 촉진합니다. M1 유사 미세아교세포는 또한 신경독성 효과를 일으켜 부상 및 신경세포 자멸사를 악화시킵니다14,15. 대조적으로, M2 유사 표현형은 항염증 특성을 가지며 혈관 신생, 재수초화, 축삭 성장 및 조직 복구를 촉진합니다16,17. M2 유사 미세아교세포는 염증 및 복구 과정을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다.

말초 대식세포는 손상된 혈액-척수 장벽과 혈관 구조를 통해 SCI 후 병변 부위로 침투하며(17,18), 염증 반응, 식세포작용(phagocytosis), 흉터 형성 및 신경 조직 재생을 더욱 조절합니다 19,20. 말초 침투 대식세포는 SCI 후 염증 반응을 감소시키고, phagocytose tissuedebris 21를 촉진하고, 신경 재생 및 기질 리모델링을 촉진할 수 있습니다. 그러나 말초 침투 대식세포에 의해 매개되는 지속적인 염증 반응은 장기적인 회복에 해로운 2차 손상으로 이어질 수 있습니다22,23. M1과 같은 말초 침투 대식세포는 괴사 세포를 제거할 수 있는 강력한 식세포 및 항원 제시 능력을 가지고 있습니다24. 그러나 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine), 반응산소종(reactive oxygen species, ROS), 반응성 질소종(reactive nitrogen species, RNS)의 과도한 분비는 뉴런과 신경교세포를 손상시켜 더 심각한 신경세포사멸(neuronal apoptosis)을 유발할 수 있다25. 반대로, M2와 같은 말초 침투 대식세포는 신경 세포사멸을 억제하고 SCI 후 염증 반응을 완화하여 신경 조직의 복구를 촉진할 수 있습니다26.

SCI 후 활성화된 미세아교세포와 말초 침투 대식세포는 형태학적 및 분자 발현 유사성을 나타내므로 구별하기 어렵습니다. 널리 채택되는 기술인 유세포분석법(FCM)은 세포 표면 및 세포 내 분자의 발현을 분석하고, 다양한 세포 하위 집단을 식별하고, 개별 세포의 여러 매개변수를 동시에 평가하는 데 사용됩니다. 활성화된 미세아교세포를 말초 침투 대식세포와 구별하여 SCI에서 대식세포의 역할을 조사하기 위해 안정적인 FCM 분석이 추구되었습니다. 이 기사에서는 개발된 안정적인 검출 방법에 대해 설명합니다.

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프로토콜

본 연구는 방부의과대학교 동물관리윤리위원회(No. 2020-050)의 승인을 받았다. 동물 보호는 중국 과학기술부에서 제공한 규정을 준수했습니다. 총 18 8 주 된 암컷 C57 / BL6 마우스를 상업적으로 획득하여 사용했다. 시약과 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 실험 및 동물 준비

  1. 수술 전에 생쥐를 통풍이 잘 되는 케이지에 수용합니다. 12시간의 라이트/다크 사이클을 유지하고 음식과 물을 무료로 이용할 수 있도록 합니다. 일주일 동안 환경 실내 온도를 20-22 °C로, 습도를 30%-70%로 유지하십시오.
  2. 마우스의 수술 기구를 고압증기멸균으로 소독하고 사용하기 전에 건조시킵니다. 수술 30분 전에 기구와 동물 수술실에서 자외선 살균을 실시합니다. 무작위 그룹화 원리에 따라 마우스를 그룹화하고 레이블을 지정합니다. 나중에 사용할 수 있도록 체중을 기록하고 등록하십시오.
  3. 복강내 주사(기관에서 승인한 프로토콜에 따름)로 케타민(80mg/kg)과 자일라진(10mg/kg) 칵테일로 생쥐를 마취합니다. T8에서 T10 척추까지 뒤쪽의 털을 면도합니다.

2. SCI 마우스 모델 준비

  1. T9을 중심으로 머리부터 꼬리까지 요오드 면봉을 사용하여 수술 부위를 소독한 후 75% 알코올 면봉으로 소독합니다. T9 중심의 피부를 1cm 절개합니다. T9를 둘러싼 근막, 근육 및 인대를 1cm 동안 절개합니다.
    1. T9 가시돌기에 인접한 근육을 분리하여 T9을 노출시킵니다. 안과 가위를 사용하여 T9와 T10 사이의 얇은 판을 발견하고 제거하여 직경이 약 2mm인 T9에 위치한 척수를 완전히 노출시킵니다.
      알림: T9 얇은 판을 들어 올릴 때 가위가 척수에 닿지 않도록 하십시오.
  2. T7 및 T11의 가시돌기를 클램핑하여 척추를 안정화합니다. 직경이 1.3mm이고 힘이 0.5N인 막대를 사용하여 적당한 SCI 모델을 만듭니다. SCI 후 꼬리가 위로 말리고 뒷다리가 경련하는 것을 관찰합니다. 가짜 수술 마우스의 경우, 타박상 없이 후판 절제술만 시행합니다.
  3. 절개 부위에 지혈을 실시합니다. 멸균 5-0 수술 봉합사를 사용하여 층상 봉합을 수행합니다. 근육 근사를 위해 이빨로 Adson 집게로 깊은 근막을 잡고 5-0 흡수성 모노필라멘트를 사용하여 panniculus carnosus 층을 봉합하고 상처 가장자리에서 수직으로 바늘을 삽입하여 3mm 간격으로 대칭적인 전체 두께 교합(깊이 2-3mm)을 얻습니다.
    1. 근막면을 해부학적으로 정렬하기 위해 장력을 조절하여 사각형 매듭을 묶습니다. 마이크로 홍채 가위를 사용하여 피부 가장자리를 재배치하여 1mm 표피 외전을 만듭니다. 진피를 워치메이커의 집게에 정확하게 정렬하고 2mm 간격으로 간단한 단속 5-0 비흡수성 봉합사로 고정하여 피하 사각 공간 없이 균일한 접합을 보장합니다.
    2. 상처 중심에서 바깥쪽으로 단방향 스트로크를 사용하여 요오드 면봉으로 봉합사 라인을 소독합니다. 식염수에 적신 거즈로 잔여 혈액을 부드럽게 두드리고 절개 부위를 따라 삼중 항생제 연고를 얇게 바릅니다.
  4. 수술 후 적절한 온도와 습도가 유지되는 케이지에 쥐를 넣습니다. 쥐가 독립적인 배뇨를 회복할 때까지 돕기 위해 하루에 두 번(아침과 저녁) 배뇨 관리를 제공합니다.
  5. 감염을 예방하기 위해 매일 0.5mL의 식염수와 항생제(겐타마이신, 2000-2500 U/마우스)를 각 마우스에 피하주사합니다.

3. C57/BL6 마우스에서 척수 조직 분리

  1. 수술 전에 마우스를 마취합니다(1.3단계). 완전히 마취되면 누운 자세로 수술대에 고정합니다. 가짜 수술 마우스도 비슷한 취급을 받습니다.
  2. 흉강, 흉골 아래, 횡격막을 따라 횡단을 절개하여 심장을 노출시킵니다. 지혈기로 심장을 부드럽게 안정시키고 관류 캐뉼라를 정점 좌심실에 삽입하여 대동맥으로 전진시킵니다.
    1. 즉시 오른쪽 귓바퀴를 절단하고 10mL의 PBS 용액으로 250mL/h의 속도로 관류를 시작합니다. 관류는 우측 귓바퀴에서 배출되는 액체가 핏빛 빨간색에서 투명하고 무색으로 변하거나 간이 빨간색에서 흰색으로 전환될 때 성공적인 것으로 간주된다27.
  3. 쥐의 꼬리 끝에 있는 척추를 절제하여 척추공을 노출시킵니다. 안과 가위를 사용하여 부상 부위 위와 아래 0.5cm의 척수 조직을 조심스럽게 절개합니다. 분리된 척수 조직을 5% 염색 완충액이 함유된 무균 효소 배양 접시에 넣고 4°C의 얼음에 보관하여 나중에 콜로이드 실리카 코팅된 폴리비닐피롤리돈(PVP) 밀도 구배 원심분리에 사용합니다.
    알림: 부상 센터 근처에서 척수를 절개할 때 부상 부위에서 척수가 찢어지거나 손상되지 않도록 조직의 무결성을 확인하십시오. 5% 염색 완충액(SB)은 2.5mL의 소 태아 혈청(FBS)과 47.5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 구성됩니다.

4. 폴리비닐피롤리돈으로 코팅된 콜로이드 실리카를 사용한 밀도 구배 원심분리

  1. 척수 조직을 300메쉬 세포 여과기에 넣고 5mL/10mL 일회용 주사기의 플런저를 사용하여 분쇄합니다. 분쇄 후 300메시 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브에 여과하여 원심분리를 수행합니다(5분, 110 x g, 실온).
    1. 원심분리 후 세포 침전물에 트립신 세포 분해 용액 1mL를 첨가하고 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 15분 동안 배양합니다. 소 태아 혈청 1.5mL를 첨가하여 분해를 중단한 다음 다시 원심분리(110 x g, 5분, 실온)합니다. 세포 침전물을 1mL의 5% 염색 완충액(SB)에 재현탁합니다.
  2. 70% 콜로이드 실리카 코팅 폴리비닐피롤리돈 용액 4mL, 30% 콜로이드 실리카 코팅 폴리비닐피롤리돈 용액 4mL, 5% SB 재현탁 세포 용액 1mL를 15mL 원심분리 튜브에 순차적으로 첨가합니다. 혼합물을 원심분리기합니다(300 x g, 30분, 20°C).
    참고: 콜로이드 실리카 코팅 폴리비닐피롤리돈 분리 시약을 콜로이드 실리카 코팅 폴리비닐피롤리돈과 10× PBS의 9:1 혼합물로 준비합니다. 70% 콜로이드 실리카 코팅 폴리비닐피롤리돈 용액을 1× PBS로 희석하고 30% 콜로이드 실리카 코팅 폴리비닐피롤리돈 용액을 DMEM 또는 RPMI 1640 세포 배양 배지로 희석합니다.
  3. 원심분리 후 세포는 원심분리 튜브에 층을 형성합니다(그림 1). 8mL 보정 표시 위의 세포 파편과 혈소판 층을 폐기합니다. 남은 용액(최대 1.5mL 보정 표시까지)을 조심스럽게 흡입하고 표시 아래의 침전물을 버립니다.
    1. 남은 용액을 새 15mL 원심분리 튜브로 옮기고 1×PBS를 추가하여 원심분리를 위한 총 부피를 15mL(400 x g, 5분, 4°C)로 만듭니다.
  4. 상층액을 버리고 세포 침전물을 5% SB에 재현탁합니다.세척 및 원심분리를 위해 용액을 유세포 분석(FCM) 튜브로 옮깁니다(110 x g, 5분, 4°C). 200μL의 5% SB로 FCM 튜브의 세포 침전물을 재현탁합니다.

5. FCM 염색

  1. 200 μL의 세포 현탁액을 두 개의 새로운 유세포 분석 튜브로 균등하게 분할합니다. 한 튜브는 "Isotype Control"로, 다른 튜브는 "Specific Staining"으로 표시합니다.
  2. 염색 절차
    1. "Isotype Control" 튜브에 PE 표지 Rat IgG2b 카파, FITC 표지 Rat IgG2b 카파, APC 표지 Rat IgG2b 카파, APC-eFluor 780 표지 Rat IgG2b 카파와 같은 동형 일치 항체를 추가합니다.
    2. "Specific Staining" 튜브에 권장 희석 비율에 따라 Rat anti-mouse CD45 APC, Rat anti-mouse CD11b PE, Rat anti-mouse CD68 FITC 및 Rat anti-mouse CCR7 APC-eFluor 780 형광 표지 항체 패널을 추가합니다.
    3. 튜브를 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  3. 염색된 세포를 두 번 세척할 때마다 1mL의 SB를 첨가합니다. 세포를 원심분리(110 x g, 5분, 4°C)합니다. 마지막으로, 유세포 분석을 위해 2% 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 고정합니다.

6. FCM 감지

참고: 절차에 대한 자세한 내용은 이전 보고서27,28을 참조하십시오.

  1. 호환 가능한 소프트웨어와 함께 유세포 분석기를 사용하여 샘플을 분석합니다( Table of Materials(재료표 참조).
    1. 먼저 isotype control tube를 분석하여 기본 그래프(x축의 FSC, y축의 SSC)를 설정합니다. 순방향 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 전압을 조정하여 세포 집단을 적절한 범위 내에 배치합니다.
    2. 두 개의 추가 그래프를 설정합니다: 하나는 x축에 IgG-APC가 있고 y축에는 IgG-PE가 있습니다. 다른 하나는 x축에 IgG-FITC가 있고 y축에 IgG APC-Cy7(참고: APC-eFluor 780이 이 채널에서 검출됨)이 있습니다.
    3. IgG-APC, IgG-PE, IgG-FITC 및 IgG APC-Cy7에 대한 형광 채널 전압을 조정하여 세포 집단을 이중 음성 영역의 103 내에 배치합니다.
  2. FSC 및 SSC 전압과 형광 채널 전압이 isotype control tube를 사용하여 조정되고 최적화되면 이러한 설정은 변경되지 않은 상태로 유지되어야 합니다. 항체 염색 실험 튜브에 대한 분석을 진행합니다.
    1. x축에 CD11b-PE를 배치하고 y축에 SSC를 사용하여 기본 그래프를 설정합니다. x축에 CD68-FITC를 설정하고 y축에 CCR7 APC-Cy7을 사용하여 다른 그래프를 설정합니다. isotype control tube를 참조로 사용하여 기준선 값을 설정하고 CD11b+ 세포의 "영역"을 설명합니다. 기본 그래프에서 CD11b+ 세포 영역을 게이트하고 이를 "P1 게이트"로 정의합니다.
    2. 다음으로, x축에 CD68-FITC가 있고 y축에 CCR7 APC-Cy7이 있는 그래프를 선택합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Show Population을 선택한 다음 P1을 선택합니다. 그러면 CD68+/CCR7+ 또는 CD68+/CCR7-을 발현하는 CD11b+ 그룹 내의 세포 집단이 표시됩니다. 샘플당 50,000개의 이벤트를 수집합니다.
    3. 데이터를 수집한 후 필요에 따라 형광 보정을 조정합니다. CD11b+ , CD68+, CCR7+ (M1 유사) 세포 및 CD11b+ , CD68+ CCR7- (M2 유사) 세포의 비율을 분석하고 측정합니다. 긍정적으로 표시된 셀의 평균 백분율은 전체 표본 모집단의 백분율로 표시됩니다.
  3. isotype control tube에서 잘 조정된 전압 매개변수를 사용하여 실험 튜브의 분석을 진행합니다.
    1. 먼저 CD45-APC 및 CD11b-PE로 그래프를 설정한 다음 CD68-FITC 및 CCR7 APC-Cy7로 두 개의 그래프를 설정합니다. 샘플당 50,000개의 이벤트를 수집하고 데이터를 수집한 후 형광 보상을 조정합니다.
    2. CD45/CD11b 의사색 플롯에서 각 샘플에 대한 CD11b+ CD45-/low 및 CD11b+ CD45high cell의 "영역"을 분석합니다. 그런 다음 이 두 영역 내의 CD68+ CCR7+ 세포 및 CD68+ CCR7- 세포를 분석합니다.
    3. CD11b+ CD45−/low CD68+ CCR7+ (M1-like microglia), CD11b+ CD45−/low CD68+ CCR7- (M2-like microglia), CD11b+ CD45high CD68+ CCR7+ (M1-like macrophage), CD11b+ CD45high CD68+ CCR7- (M2-like macrophage)의 비율을 측정합니다.
      참고: 긍정적으로 표시된 셀의 평균 백분율은 전체 표본 모집단의 백분율로 표시됩니다.

7. FCM 데이터 분석

  1. 유세포 분석 소프트웨어를 실행하고 유세포 분석 실험 파일을 인터페이스의 "All Samples" 섹션으로 드래그합니다. 유세포 분석 실험은 인터페이스의 "모든 샘플" 아래에 표시됩니다. 먼저 isotype control tube를 분석하여 positive 형광 신호와 negative 형광 신호 사이의 임계값을 결정합니다.
    1. isotype control tube sample을 두 번 클릭하면 2차원 점도표를 표시하는 그래픽 창이 나타납니다. x축으로 FSC-A를 선택하고 y축으로 SSC-A를 선택합니다. 인터페이스 상단에 있는 Rectangular Gate(직사각형 게이트) 버튼을 클릭하고 직사각형을 사용하여 세포 파편을 제거한 후 영역을 선택합니다(그림 2A).
    2. 선택한 영역을 두 번 클릭하여 새 그래픽 창을 생성합니다. x축으로 FITC 를 선택하고 y축으로 히스토그램 을 선택합니다. 인터페이스 상단에 있는 Region Gate 버튼을 클릭하여 단일 파라미터 히스토그램에서 게이트를 설정하여 음성 형광 신호와 양성 형광 신호 사이의 임계값을 결정합니다. 영역 게이트는 양의 영역을 정의합니다(그림 2A).
      알림: FSC 값이 작은 영역은 세포 파편을 나타냅니다.
    3. 실험에 사용된 4개의 형광 항체 각각에 대해 isotype control tube 샘플을 사용하여 음과 양수 신호 사이의 임계값을 결정합니다. x축에서 형광 색소를 PE, APC 및 APC-Cy7로 순차적으로 변경하고 y축을 히스토그램으로 유지합니다.
    4. 단일 파라미터 히스토그램에서 영역 게이트 도구를 사용하여 게이트를 설정하고 4개의 형광 항체 각각에 대한 음과 양수 신호 사이의 임계값을 결정합니다(그림 2A).
  2. M1 유사 세포와 M2 유사 세포의 비율을 분석하려면:
    1. 실험용 튜브 샘플을 두 번 클릭하여 2차원 점도표를 불러옵니다. x축으로 FSC-A를 선택하고 y축으로 SSC-A를 선택합니다. 인터페이스 상단에 있는 Rectangular Gate(직사각형 게이트) 버튼을 클릭하고 직사각형을 사용하여 세포 파편을 제거한 후 영역을 선택합니다(그림 2B).
    2. 선택한 영역을 두 번 클릭하여 새 그래픽 창을 생성합니다. x축으로 CD11b-PE를 선택하고 y축으로 SSC-A를 선택합니다. 인터페이스 상단의 Rectangular Gate 버튼을 클릭하고 isotype 컨트롤에 의해 설정된 PE 포지티브/네거티브 임계값을 참조로 사용하여 CD11b+ 게이트를 정의합니다(그림 2B).
    3. CD11b+ 게이트 영역을 두 번 클릭하여 새 그래픽 창을 생성합니다. x축으로 CD68-FITC를 선택하고 y축으로 CCR7 APC-Cy7을 선택합니다. 크로스 게이트 버튼을 클릭합니다. isotype control에 의해 설정된 FITC 및 APC-Cy7 positive/negative thresholds를 참조로 사용하여 cross gate를 사용하여 세포를 분류하고 CD11b+ CD68+ CCR7+(M1 유사) 세포 및 CD11b+ CD68+ CCR7-(M2 유사) 세포의 비율을 측정합니다(그림 2B).
      참고: M1 유사 대식세포(M1-like Mø), M2-유사 대식세포(M2-like Mø), M1-유사 미세아교세포(M1-like MG) 및 M2-유사 미세아교세포(M2-like MG)의 비율을 분석하기 위한 게이팅 원리는 M1-유사 및 M2-유사 세포를 분석하는 데 사용되는 것과 일치합니다. 양성 형광 신호와 음성 형광 신호를 구별하기 위한 임계값은 게이트 설정을 위한 기준 역할을 하는 isotype control tube를 기반으로 합니다. 소프트웨어 작동 프로세스는 그림 2B에 설명되어 있으며, 세포 비율을 결정하는 데 사용되는 마커 발현 프로파일은 대표적인 결과 섹션에 자세히 설명되어 있습니다.

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결과

척수 조직의 면역 세포는 폴리비닐피롤리돈 밀도 구배 원심분리로 코팅된 콜로이드 실리카를 사용하여 분리됩니다. 원심분리 과정에서 세포는 부력 밀도에 따라 서로 다른 층으로 분포되어 세포 분리가 이루어집니다(그림 1). 위에서 아래로 분포는 다음과 같습니다 : 세포 파편, 단핵 세포가 풍부한 층, 림프구가 풍부한 층, 그리고 하단에는 적혈구 및 과립 구층이 있습니다.

M1 유사 및 M2 유사 세포의 FCM 분석은 CD68, CD45, CD11b 및 CCR7로 구성된 세포 마커 발현 프로파일을 활용합니다29,30. CD11b+ CD68+ CCR7+를 발현하는 세포는 M1 유사 세포로 정의되고, CD11b+ CD68+ CCR7

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토론

SCI 동물모델의 성공적인 생성은 필수적입니다. SCI 모델은 T9 분절의 척수를 0.5N의 힘에 노출시켜 확립되었습니다. 동물 모델의 성공은 쥐의 꼬리가 말리고, 양쪽 뒷다리가 경련을 겪고, 뒷다리가 마비되어 쥐가 SCI 후에 걸을 수 없게 됨으로써 입증되었습니다(2.3단계 참조). 수술 후 관리는 마우스의 생존에 매우 중요합니다. 쥐가 독립적으로 소변을 볼 수 있을 때까지 비뇨기 관리가 제공됩니다. 또한 감염으로 인한 소변의 혈액을 예방해야 합니다. 수술 후 쥐의 뒷다리가 붓거나 감염되는 것을 예방해야 하며, 치명적인 결과를 피하기 위해 쥐가 뒷다리를 갉아먹는 것을 막기 위한 조치를 취해야 합니다(2.5단계 참조).

분쇄 후 척수 조직의 원심분리 후 얻은 세포 펠릿을 트립신으로 분해하여 세포 부착을 방지하고 단일 세포 현탁액을 달성합니다(4.1단계 참조). 밀도 구배는 폴리비닐피롤리돈 용액으로 코팅된 70% 콜로이드...

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공개 사항

이해 상충은 선언되지 않았습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 82072416)의 지원을 받았습니다. Bengbu Medical College (BYYFY2022TD001)의 First Affiliated Hospital의 고급 과학 기술 혁신 팀 기금.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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1× PBS  솔라바이오P1020
10× PBS  솔라바이오P1022
18 8주 된 암컷 C57/BL6 마우스 Cavens Laboratory Animal Ltd, 창저우, 중국
APC-eFluor 780 표지 쥐 항마우스 CCR7(IgG2b 카파)인비트로젠47-1971-820.25&무; g/테스트
APC-eFluor 780 표지 쥐 IgG2b kappa  이소형 제어인비트로젠47-4321-820.25&무; g/테스트
APC 표지 쥐 항마우스 CD45(IgG2b kappa)인비트로젠17-0451-820.125&뮤; g/테스트
APC 표지 쥐 IgG2b kappa  이소형 제어인비트로젠17-4031-820.125&뮤; g/테스트
DMEM깁코11965092
태아 소 혈청론세라S711-001
FITC 표지 쥐 항마우스 CD68(IgG2b kappa)인비트로젠  MA5-166760.25&무; g/테스트
FITC 표지 쥐 IgG2b kappa  이소형 제어인비트로젠11-4031-820.25&무; g/테스트
파라포름알데히드바이오샤프23319084
PE 표지 쥐 항마우스 CD11b(IgG2b 카파)인비트로젠12-0112-810.25&무; g/테스트
PE 표지 쥐 IgG2b kappa  이소형 제어인비트로젠12-4031-820.25&무; g/테스트
퍼콜  솔라바이오P8370
트립신 용액바이오샤프BL526A

참고문헌

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유세포분석을 사용하여 손상된 척수에서 미세아교세포(microglia) 및 말초 침투 대식세포(peripheral infiltrating macrophages in the injured spinal cords) 확인
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