미국 수화와 영어에서 잠재적 PLK1 억제제를 식별하기 위한 이중언어 계산 워크플로우

Summary

이 이중 언어 프로토콜은 Polo-like Kinase 1부터 3(PLK1–3)과 데이터베이스 기반 자연 분자의 흡수, 분포, 대사, 배설, 독성, 안정성(ADMET-S) 특성의 단백질-리간드 상호작용을 평가하는 계산적 신약 개발 워크플로우를 제공합니다.

Abstract

폴로 유사 키나제 1(PLK1)은 세포 주기의 S, G2, M 단계에서 중요한 역할을 하며, 유방암을 포함한 여러 암에서 과발현이 자주 관찰되어 유전체 불안정성과 세포자사사 조절 이상에 기여합니다. 기존의 ATP 경쟁 억제제가 키나제 도메인을 표적으로 하는 것과 달리, PLK1의 폴로박스 도메인(PBD)에 대한 선택적 억제는 유사분열 진행에 중요한 단백질-리간드 상호작용을 교란하여 암세포의 세포자멸사를 유도하는 유망한 전략을 제시합니다. 그러나 PLK1과 그 상동체(PLK2, PLK3) 사이의 구조적 유사성이 높기 때문에, 각각 신경 기능과 스트레스 반응에 필수적이기 때문에, 표적에서 벗어나는 효과를 피하기 위해 예외적인 선택성이 필요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 프로토콜은 가상 스크리닝, 구조 군집, 단백질-리간드 도킹, 결합 친화도 예측, ADMET-S 프로파일링, 양자역학(QM) 안정성 분석을 통합한 이중 언어(미국 수화와 영어) 계산 워크플로우를 포함합니다. SuperNatural 3.0 천연 제품 데이터베이스를 시작으로, 화합물들은 유방암 관련 및 약물 유사성 기준을 사용하여 필터링하고, 화학적 다양성을 보장하기 위해 클러스터링되었으며, PLK1-, PLK2-, PLK3-PBD 구조와의 상호작용을 평가했습니다. 가상 도킹과 실리코 ADMET-S 평가가 선택성이나 작용 기전을 확실히 확인하지는 못하지만, 본 연구는 검증 가능한 가설을 생성하고 향후 분자 역학 시뮬레이션, 생화학적 검증 또는 실험 스크리닝을 위한 천연산물 유래 후보 그룹을 우선시합니다.

Introduction

폴로 유사 키나제(PLK)는 N-말단 도메인과 하나 또는 두 개의 폴로박스 도메인(PBD^)으로 구성된 C-말단으로 구성된 단백질 키나아제 계열입니다^1,2.  이 폴로박스 도메인의 수와 기능 다양성은 PLK 계열 구성원마다 다릅니다. PLK1은 세포 분열의 S, G2, M 단계에 관여합니다. 세포 주기에서 PLK1은 S기에서는 DNA 손상 검사점으로, G2기에는 염색체 응축과 중심체 성숙을 조절하는 역할을 합니다. PLK1은 또한 M기로의 유사분열을 촉진하고, 그 다음으로 방추체 조립, 전기기, 세포분화 ^3,4로 유도합니다. PLK1의 과발현은 비정상적인 중심체 형성으로 인한 유전적 불안정성을 초래하며, 이로 인해 세포 주기가 이상해지고 세포가 세포자멸사를 조절하지 못하게 됩니다.  이러한 과발현은 폐암, 두경암, 식도암, 위암, 대장암, 유방암에서 관찰^됩니다. 따라서 PBD를 표적으로 하는 약물을 통한 PLK1 억제는 세포자사멸사(^{apoptosis 5,6})를 유발할 수 있습니다. 이 워크플로우는 신경학적 기능과 유전독성 스트레스 관리에 중요한 PLK2와 PLK3를 억제하지 않도록 높은 선택성을 달성하는 것을 목표로^합니다.

PLK2는 특정 맥락에서 종양 억제제로 작용하여 G1/S 전이를 조절하고 사이클린 E의 분해를 촉진하여 통제되지 않은 세포 증식을 방지합니다. PLK3는 세포 주기 조절과 유전독성 스트레스 반응 모두에서 복잡한 역할을 하며, DNA 손상 체크포인트 활성화 및 세포자사멸사 유도에 관여함으로써 유전체 완전성 유지에 기여합니다⁷. 중요하게도, PLK1 억제가 암 치료에 유망한 치료 전략으로 떠오르고 있지만, PLK2와 PLK3가 신경 기능과 스트레스 반응에서 필수적인 역할을 하기 때문에 이 중요한 키나제에 대한 비표적 효과를 최소화하기 위해 고도로 선택적인 억제제 개발이 필요하다는 점이다^. 이러한 생물학적 맥락과 구조적 유사성은 PLK1의 폴로박스 도메인(polo-box domain, PBD)을 표적으로 하면서도 정상 세포 생리에서 PLK2와 PLK3의 보호 기능을 방해하지 않는 화합물을 식별하는 것이 중요^{함을 강조합니다} .

특히 PLK1을 표적으로 하는 알려진 폴로 유사 키나아제(PLK) 억제제는 암 치료에서의 잠재적 치료 응용 가능성으로 광범위하게 연구되어 왔습니다. BI 2536, volasertib(BI 6727), 온반서티브(NMS-1286937), GSK461364 등 여러 화합물이 개발되어 임상시험으로 진행되었으며, 주로 ATP 경쟁 억제제 ^8,9,10으로 진행되었습니다. 다른 유형의 억제제로는 티모퀴논(TQ)^11,12, 폴록신^13,14, 알로폴레-A¹⁵ 등이 PBD를 표적으로 합니다. 유망하다고 보고되었으나, 현재 승인된 PBD 특이적 억제제나 후기 임상시험은 없으며, 이는 ADMET-S 특성 부족과 비표적 효과 등의 어려움 때문입니다^. 예를 들어, 여러 PLK1-PBD 억제제는 비특이적 단백질 알^킬화자로 알려져 있어 임상적 적용이 제한적입니다. 따라서 잠재적 PLK1-PBD 억제제의 선택성과 ADMET-S 프로파일을 개선하는 것은 신약 개발에서 여전히 중요한 목표로 남아 있습니다.

본 연구의 목표는 가상 스크리닝, 구조적 유사성 필터링, 도킹, 결합 에너지 계산 및 ADMET-S 평가를 통해 ADMET-S 특성을 가진 잠재적 PLK1-PBD 억제제를 탐구하는 것입니다. PLK2와 PLK3는 잠재적 선택성을 평가하기 위해 동일한 프로토콜을 적용하였습니다. 키나아제 억제제 발견을 위한 수많은 계산 파이프라인이 존재하지만, PLK1–3 PBD 간의 선택성 스크리닝을 포괄적인 ADMET-S 및 양자역학적 안정성 분석, 특히 천연 제품 라이브러리를 활용한 동시 선택성 스크리닝을 통합하는 것은 드뭅니다. 워크플로우는 기존 가상 스크리닝 패러다임을 기반으로 하지만, 교육 접근성과 초기 가설 생성에 맞춰져 있습니다. 이 프로토콜은 표준 노트북(8GB RAM), 무료 학술 소프트웨어, 사전 프로그래밍 지식 없이 필요하므로, 고등학교, 학부, 대학원 환경, 그리고 강의 기반 학부 연구 경험(CURE)에 적합합니다.

이 연구의 계산 파이프라인은 단백질 준비에서 시작되며, PLK1-PBD, PLK2-PBD, PLK3-PBD의 구조를 단백질 데이터 뱅크(PDB)에서 추출하거나 구조적 불일치를 해결하기 위해 모델링하고 처리합니다. 다음으로, 천연 제품 데이터베이스 스크리닝을 수행하여, 항유방암 가능성과 리핀스키의 5가지 법칙 준수 여부를 기준으로 화합물을 필터링했습니다. 이후 단계에서는 분자 지문 인식과 유사성을 기반으로 50개의 대표 구조로 군집화됩니다. 이 대표자들은 단백질-리간드 도킹 및 결합 친화도 계산을 거쳐 세 PLK에 대한 상호작용 데이터를 생성했습니다. 이후 ADMET-S 특성을 세 가지 다른 웹 서버를 사용하여 약물동학, 약물 유사성, 독성, 대사 안정성을 예측합니다. 양자역학 계산을 통해 HOMO–LUMO 갭의 최고 점유 분자 궤도(HOMO) 및 최저 비점유 분자 궤도(LUMO) 분석을 통해 분자 안정성을 평가하였습니다. 마지막으로, ADMET-S 데이터를 분석하여 물리화학적 특성, 흡수, 분포, 대사, 배설, 독성, 안정성 기준을 기준으로 PLK1-PBD 억제제로서 필터링 및 순위를 매겼습니다.

Protocol

연구 자원 식별자(RRID)와 사용되는 모든 소프트웨어 도구의 버전 번호는 재료표에 제공되어 있습니다.

1. 표적 단백질 준비

1. 구조 파일과 계산 결과를 저장할 수 있는 작업 디렉터리를 만들어 주세요.
2. 단백질 데이터 뱅크를 방문하여 표적 단백질 PLK1-PBD(4HCO¹¹)의 식별자를 확인하고, 구조적 불일치가 있으면 HARvard 분자역학 - 그래픽 사용자 인터페이스(CHARMM-GUI ^17,18)의 화학과에 후속 조치를 취하세요.
   1. CHARMM-GUI를 방문하여 학술 계정을 등록하세요. 학술 계정을 등록하면 입력 생성기를 클릭한 후 PDB 리더를 클릭하고, PDB ID 4HCO를 입력한 후 다음 단계를 클릭하세요.
   2. 다음 페이지에서 PROA(단백질 사슬 A)만 선택되었는지 확인하고, 다음 두 페이지의 다음 단계를 클릭하세요.
   3. step1_pdbreader.pdb를 디렉터리에 다운로드하고, 파일 이름을 4hco 또는 preferred로 변경한 뒤, 텍스트 편집기나 코드를 사용해 히스티딘(HSD) 발생 이름을 (HIS)로 변경하세요.
3. PLK2-PBD(PDB 식별자: 4XB0¹⁹)에 대해 CHARMM-GUI를 사용해 절차를 반복합니다.
   참고: PLK3-PBD와 같이 PDB 식별자가 없는 구조는 상동 모델링 구조나 Alphafold²⁰을 사용하세요. Uniprot²¹의 서열 정확성을 확인하세요.

2. 천연 제품 데이터베이스 스크리닝

1. SuperNatural 3.0 라이브러리의 천연 제품 데이터베이스를 방문하여 질병 하위^{페이지 22}를 선택하세요.
   1. 신뢰 구간이 있든 없든 유방암을 선택하세요. 전체 결과는 프로그램적으로 필터링되어야 하므로 말이죠. 그리고 '찾기'를 클릭하세요. 전체 결과 파일을 다운로드 하여 선호 디렉터리에 .csv로 저장하세요. 그 후에는 0.900–1.000 신뢰권선(73,406개 중 n = 1,193)을 가진 항목을 필터링하는 코드를 사용하세요.
      참고: 또는 유방암에 대한 교토 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG) 식별자를 경로 하위 페이지²³페이지에서 입력할 수 있습니다.
   2. FAQ 하위 페이지 하단에 있는 전체 데이터셋을 .csv 파일로 다운로드할 수 있습니다. 이 문서를 다운로드하여 데이터셋의 간소화 분자 입력 라인 입력 시스템(SMILES) 문자열을 1,193개 분자의 SuperNatural 식별자와 대조하고, SMILES 문자열 목록을 작성하세요 (smiles.csv).

3. 군집 샘플링

1. 거의 모든 오픈소스 패키지를 포함하는 Anaconda 배포판(https://www.anaconda.com/download)을 다운로드하거나, RStudio(RStudio Desktop - Posit) 또는 Jupyter(Jupyter Notebook)와 같은 통합 개발 환경(IDE)을 개별적으로 다운로드하세요. Conda를 사용해 오픈 소스 화학정보학 및 머신러닝 패키지인 RDKit²⁴를 설치하세요.
   참고: Conda 설치 및 Conda 환경 생성 방법은 conda 25.9.2.dev31 문서에서 확인할 수 있습니다. RDKit 설치 및 환경 내 모듈 설정에 대해서는 설치 — RDKit 2025.03.6 문서를 참조하세요.
2. "Lipinski.py" 스크립트를 보충 파일 1 에 "smiles.csv"와 같은 폴더에 넣고 실행하세요. 스크립트는 Conda 환경을 열고, 모듈을 불러오고, SMILES 문자열 파일을 읽고, 생체이용률과 흡수 추정을 위한 Lipinski의 5가지 법칙에 기반한 필터를 적용합니다(n = 1,193개 중 999개), 그리고 SMILES 문자열 목록을 "all.csv"로 저장합니다.
   참고: "all.csv"이 생성되었고 ~999개의 화합물(필터링된 부분집합)을 포함하고 있는지 확인하세요. 파일을 열어 각 항목이 유효한 SMILES 문자열을 포함하고 있는지 확인하세요. Python은 콘솔에서 다음 작업을 실행한 후 RStudio에서 실행됩니다: library(reticulate); reticulate::use_condaenv(nameofcondaenv)
3. "Clustering.py" 스크립트(보조 파일 1)를 "all.csv"과 같은 폴더에 넣고 선호하는 IDE에서 실행하세요. 스크립트는 클러스터링 모듈을 로드하고, SMILES 문자열 파일을 읽으며, 분자 지문과 타니모토 유사성을 기준으로 화합물을 50개의 클러스터로 그룹화합니다.
   참고: 50개의 대표 구조(rep_struct.csv, 보충 파일 1)가 SMILES 문자열 목록으로 디렉터리에 저장됩니다. 타니모토 유사도(화학정보학에서 자카드 지수라고도 함)²⁵ 는 분자 지문을 기반으로 두 분자 간 구조적 유사성을 정량화하는 지표로, 타니모토 계수는 0(유사성 없음)에서 1(동일 지문)까지 범위를 가집니다. "rep_struct.csv"에는 각 클러스터를 대표하는 정확히 50개의 고유 SMILES 항목이 있는지 확인하세요.

4. 단백질-리간드 결합 및 결합 친화도 계산

1. AutoDock Vina 기반 공동체 탐지 가이드 블라인드 도킹 웹 서버(CB-Dock2)²⁶을 방문하세요.
   1. 도킹 탭으로 가서 4HCO 단백질을 업로드하세요.
   2. 리간드를 업로드하려면 그리기 리간드 를 클릭한 후 SMILES 문자열 목록에서 리간드를 붙여넣으세요(rep_struct.csv, 보충 파일 1). 다음 필드에 이메일 주소를 입력한 후 더 쉽게 압축된 데이터 수집을 원하시고, 자동 블라인드 도킹을 클릭하세요. 나머지 49개의 소분자 클러스터 대표자에 대해서도 반복하여 lig1, lig2, ..., lig50으로 표기합니다.
2. 이메일로 보내진 결과로 가서 zip 폴더를 4HCO라는 하위 디렉터리에 다운로드하고, 제목을 순서대로 (4hco_lig1, 4hco_lig2, ..., 4hco_lig50)로 붙이세요.
   1. 폴더를 압축 해제하고 단백질-리간드 복합체 파일만 ".complex.pdb"로 끝나는 파일을 제외한 모든 파일을 제거하세요.
      참고: 각 리간드 디렉터리(4hco_lig1부터 4hco_lig50까지)에 해당 ".complex.pdb" 파일이 포함되어 있는지 확인하세요.
   2. 텍스트 편집기로 샘플 .complex.pdb 파일을 열어 단백질 사슬 ID: P와 리간드 ID: A:UNL 를 주의 깊게 기록한 뒤, 파일 압축 유틸리티를 사용해 폴더를 재압축하세요.
   3. 선택성 및 단백질-리간드 결합 친화도를 평가하려면 PROtein binDing enerGY 예측(PRODIGY) 웹 서버를 방문하세요²⁷.
      1. PRODIGY-lig(단백질-소분자) 탭을 클릭하면 여러 단백질-리간드 복합체가 동시에 담긴 압축 폴더(예: 4hco_lig1)를 업로드할 수 있습니다. 단백질 사슬과 리간드 ID를 입력하고, 캡차를 완료한 후 Prodigy-Ligand 제출을 클릭합니다.
      2. 데이터가 처리된 후에는 모든 출력의 아카이브 파일(.zip) 을 클릭하여 결과를 다운로드하세요. 이전 단계를 반복하여 4hco_lig50까지의 모든 하위 디렉터리에 대해 결과 수집을 수행합니다.
   4. 단백질 4XB0와 PLK3에 대해서는 파일 명명법(예: 4xb0_lig1 또는 plk2_lig1)에 주의를 기울이며 모든 단계를 반복하세요.
      참고: 모든 단백질-리간드 복합체의 출력 CSV가 다운로드되어 있으며 ΔG와 인터페이스 잔기 데이터 열을 모두 포함하고 있는지 확인하세요.

5. ADMET-S 평가

1. ADMETlab3 3.0 플랫폼²⁸을 방문하세요.
   1. "ADMET 스크리닝" 아래에서 GET STARTED 를 클릭하고 SMILES 목록을 입력하세요.
      1. 디렉터리에서 rep_struct.csv 열어 SMILES 문자열 목록 전체를 텍스트 필드에 붙여넣고 제출하세요.
      2. 플랫폼의 색상 구분 점수 시스템을 사용해 약동학 및 약물 유사성을 평가하고, 평가 결과를 .csv 파일로 다운로드하여 추가 분석을 할 수 있습니다.
      3. SwissADME 툴²⁹로 이동하세요.
2. 50개 분자 모두의 SMILES 문자열 목록을 입력 필드에 붙여넣으세요.
   1. Run을 클릭하여 BBB 침투율을 포함한 생체이용률 및 투과성 특성을 계산합니다.
   2. 다른 ADMET 결과와 통합하기 위해 출력을 .csv 파일로 다운로드하세요.
3. 사용자의 운영체제와 호환되는 ToxTree³⁰ (의사결정 트리 접근법에 의한 독성 위험 추정)을 다운로드 및 설치하세요.
   1. 터미널 에서 명령어를 사용해 소프트웨어를 열 Toxtree.sh
   2. SMILES 문자열을 개별적으로 ToxTree에 입력하여 크레이머 규칙에 따라 독성을 분류하세요.
   3. 결과를 다른 ADMET 데이터와 통합하기 위해 .csv 파일로 내보내세요.
      참고: ADMETLab3와 SwissADME 출력 CSV가 리간드 수와 일치하는지 확인(n = 50), 그리고 Toxtree 결과가 각 화합물을 Cramer의 규칙(I–III)에 따라 분류하는지 확인하세요.
4. ORCA³¹을 설치한 후, 작업 디렉터리에 stability라는 폴더를 만들고 각 분자별로 하위 폴더(예: plk1_lig1, plk1_lig2, ..., plk1_lig50)를 만듭니다.
   1. Avogadro(Avogadro)를 사용해 각 분자의 SMILES 문자열을 기반으로 각 분자를 구성하세요: 확장 탭으로 가서 최적화 기하학을 클릭해 분자를 최적화하세요. ORCA 확장 > ORCA 입력 파일을 생성 하고 다음 설정을 적용>
      ! B3LYP OPT FREQ DEF2-TZVP
      %맥스코어 4000
      %pal
      Nprocs 1
      끝
   2. 각 리간드에 대해 다운로드한 .sh 작업 파일을 고유 직무명과 이메일 주소를 포함하도록 수정하세요. 그 후 다음 명령어를 사용하여 "stability" 디렉터리를 고성능 컴퓨팅(HPC) 시스템으로 전송합니다:
      쉿 xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu
      MKDIR ~/4HCO
      SCP -r /local/path/to/stability xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu:~/4hco
   3. Simple Linux Utility for Resource Management(HPC 클러스터용 SLURM 워크로드 관리자)를 통해 반복 스크립트를 사용하여 작업을 실행하세요:
      i는 {1..50}에서; 해야 할
      CD ~/4hco/stability/plk1_lig${i}
      chmod +x job_lig${i}.sh
      스배치 job_lig${i}.sh
      끝났어
   4. 작업 완료 이메일을 받은 후, 리간드 폴더로 이동해 출력 파일을 열어 데이터를 검토하고 HOMO와 LUMO 값을 기록하세요:
      CD ~/4hco/stability/plk1_lig1
      나노 리그1.아웃

6. ADMET-S 데이터 분석

1. SwissADME 생체이용률 및 투과성 레이더 차트에서 도출된 물리화학적 특성 데이터를 .csv 파일에 결합합니다.
   1. SwissADME에서 .csv 파일을 저장하고 이름을 "Physiochemical.csv"로 설정하세요.
   2. "Physiochemical.py" 스크립트(보조 파일 1)를 "Physiochemical.csv"와 같은 폴더에 넣고 실행하세요.
   3. 다음 기준을 적용하세요: nHD: 0–7, nHA: 0–12, nStereo: <2, LogP: 0–3, LogD: 1–3, LogS: –4에서 0.5, Fsp3: >0.41, nHet: 1–15.
2. 흡수 및 분포 데이터는 SwissADME에서 도출하세요.
   1. 스위스ADME에서 삶은 달걀³² 차트를 스냅샷하고 저장하세요.
   2. 다음 기준을 적용하세요: 분자는 '난자' 영역에 위치해야 하며, 빨간 점이 선호되는 p-당단백질 억제제 역할을 해야 합니다.
3. ADMETlab3.0에서 사이토크롬(CYP) 기질과 억제제에 대한 대사 데이터를 도출합니다.
   1. ADMETlab3.0.csv 파일을 저장하고 이름을 "Metabolism.csv"로 설정하세요.
   2. .csv 파일을 편집하고 CYP-inh와 CYP-sub 열만 유지하세요.
   3. "Metabolism.R" 스크립트(보조 파일 1)를 "Metabolism.csv"와 같은 폴더에 넣고 실행하세요.
   4. 다음 기준을 적용하세요: CYP p450 억제제와 0등급의 비기질이 선호됩니다.
4. ADMETlab3.0에서 배설 데이터를 추출하여 혈장 클리어런스와 반감기를 측정합니다.
   1. ADMETlab3.0.csv 파일을 저장하고 이름을 "Excretion.csv"로 설정하세요.
   2. .csv 파일을 편집하고 cl-플라즈마와 t0.5 열만 유지하세요.
   3. "Excretion.py" 스크립트(보조 파일 1)를 "Excretion.csv"과 같은 폴더에 넣고 실행하세요.
   4. 다음 기준을 적용하세요: 혈장 클리어런스: 0.01–5 ml/min/kg.
   5. 독성 분류는 Toxtree의 nToxicity 데이터, 독성 포어 수는 ADMETlab3.0에서 제공하는 것입니다.
      1. ADMETlab3.0에서 .csv 저장하고 이름을 "Toxicity.csv"로 이름 붙이세요.
      2. .csv 파일을 편집하고 Toxicophore 열만 유지하고, Toxtree에서 각 리간드의 독성 클래스를 기록하는 새로운 열을 추가하세요.
      3. "Toxicity.py" 스크립트(보조 파일 1)를 "Toxicity.csv"과 같은 폴더에 넣고 실행하세요.
      4. 다음 기준을 적용합니다: 독성포자 수는 0–2로 해야 합니다.
   6. 안정성 데이터는 ORCA 출력 파일에서 도출하세요. ("궤도 에너지", 특히 HUMO와 LUMO 에너지 값)입니다.
      1. 각 리간드의 HUMO와 LUMO 에너지를 별도의 열로 기록하는 엑셀 차트를 만드세요.
      2. 밴드 갭(HUMO–LUMO = 밴드 갭)을 계산하는 새로운 열을 추가하세요.
      3. 엑셀 차트를 "Stability.csv"로 저장하세요.
      4. "Stability.py" 스크립트(보조 파일 1)를 "Stability.csv"과 같은 폴더에 넣고 실행하세요.
      5. 다음 기준을 적용하세요: 밴드 갭 차이는 3.6–5 eV 사이로 설정됩니다.

Results

타겟 단백질 구조 파일 프로토콜은 타겟 단백질 파일이 분석 및 구조 기반 도킹에 최적화되도록 보장합니다. PDB 형식으로 생성된 구조 파일은 누락된 잔기와 수소, 누락된 원자 유형, 그리고 물 분자 및 공결정 리간드와 같은 불필요한 성분이 없습니다. 그림 1A, B 는 준비 전후의 구조물에서 시각적 차이(Mol* 뷰어³³에 의해 시각화됨)를 보여줍니다. 만약 인식되지 않은 원자 이름이나 불완전한 잔류물 같은 잔류 포맷 문제가 남아 있으면, CB-Dock2는 보통 업로드 시 오류를 표시합니다. 이 시점에서 HSD를 HIS로 이름 변경하거나 비표준 잔류물을 제거하는 등 소규모 수동 수정을 적용한 후 도킹 단계를 다시 시도할 수 있습니다.

그림 2 는 분자 지문 인식과 타니모토 유사성을 기반으로 한 주성분 분석(PCA)을 통한 군집화 결과를 보여줍니다. 그림에서 각 클러스터는 회색 음영의 타원형으로 그룹화되어 있으며, 그 안에 비슷한 색깔의 점들이 포함되어 있는데, 이는 해당 클러스터 내 분자를 나타냅니다.  축 위의 PCA 성분 1과 2는 Tanimoto 행렬에서 고차원 요소로부터의 환원을 2차원 선형으로 표현합니다. 본 연구에서는 클러스터 샘플링 단계에서 타니모토 유사성을 사용하여 999개의 리핀스키 준수 천연물 간 중복성을 줄이고 화학적 다양성을 증진합니다. 분자 지문을 이용해 쌍별 타니모토 유사성을 계산하여 데이터셋을 구조적으로 관련된 화합물 클러스터 50개로 나눕니다. 각 클러스터에서 대표적인 분자를 하나 선택하여, 최종 50개 리간드가 넓은 화학 공간을 포착하면서 하위 도킹 및 ADMET-S 분석에서의 계산 중복을 최소화합니다. 이 전략은 특히 SuperNatural 3.0과 같은 대규모 천연 제품 라이브러리를 다룰 때 가상 스크리닝의 효율성과 대표성을 향상시킵니다. ( 그림 2 참조).

각 단백질-리간드 복합체의 최적 자세를 시뮬레이션하며, 반데르발스 힘과 수소 결합을 고려하여 CB-Dock2에서 PLK1 단백질의 다섯 개 CurPocket 포즈 간 Vina 점수 형태로 예측된 친화도를 함께 산출합니다.  그림 3의 리간드 1 시뮬레이션 예시는 두 번째 CurPocket 포즈(C2)에 가장 잘 결합하며, Vina 점수는 다른 네 개의 상위 포즈에 비해 –7.5 kcal/mol로 가장 낮음을 보여줍니다. CB-Dock2의 분자 도킹은 경험적 매개변수와 확률적 전역 최적화 알고리즘을 기반으로 한 점수 함수를 통해 수행됩니다. CB-Dock2는 엄격한 검증을 거쳐 다른 최첨단 블라인드 도킹 도구에 비해 우수한 성능을 입증하여 도킹 연구에 탁월한 선택지입니다^26,34. 이 서버는 바인딩 포즈 예측(RMSD <2 Å)에서 약 85%의 성공률을 기록하며, 최초의 CB-Dock 버전, SwissDock, COACH-D, MTiAutoDock³⁴ 등 대중적인 도구들을 능가합니다. 이러한 높은 정확도는 CB-Dock2가 구조 기반과 템플릿 기반 두 가지 상호 보완 도킹 방식을 혁신적으로 통합한 덕분입니다.

그림 4는 PRODIGY 웹 서버 예측 친화도를 사용하여 각 단백질-리간드 조합별 평균 예측 친화도의 히트맵을 보여줍니다.  더 높은 친화도는 낮은 몰 에너지(kcal/mol)와 더 녹색 히트맵 색조로 나타난다. 이는 결합 친화도가 유리하다. 반면, 더 낮은 친화도, 즉 몰라 에너지가 높고 히트맵 색조가 더 붉어지는 것은 덜 유리합니다. 선택성 관점에서 보면, 상동 단백질(PLK2–3)에 비해 표적 단백질(PLK1)에 유리한 친화력을 가진 화합물이 이상적입니다. 예를 들어, 리간드 27은 리간드 45에 비해 선택적 PLK1-PBD 리간드로, 세 단백질 모두에서 유사한 친화성을 보입니다. 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35, 49가 PLK1-PBD에 대한 친화력이 PLK2/3보다 높지만, 2D 지문 공간에서는 화학적으로 다양합니다(평균 ECFP4 Tanimoto ≈ 0.135, 0.50 ≥ 없음). 이는 더 넓은 특이성은 보좌된 PBD 포켓 기하학과 공유된 3D 약물 포머/상호작용 패턴에 의해 결정될 가능성이 높으며, 스캐폴드 동일성보다는 그렇습니다. 권고사항으로는 PLK1-PBD 인식의 구조적 결정 인자를 규명하기 위한 상호작용-지문 비교 및 약제계자 매핑이 포함됩니다.

물리화학적 특성 평가 결과는 레이더 차트(그림 5)에 표시되어 있습니다. 평가되는 특성에는 원자 간 상호작용, 용해도, 생체이용률이 포함됩니다. 일부 화합물은 허용 가능한 범위로 더 바람직한 물리화학적 특성으로 두드러집니다: nHD = 0–7, nHA = 0–12, nStereo < 2, LogP = 0–3, LogD = 1–3, LogS = –4에서 0.5, Fsp3 > 0.41, nHet = 1–15. 이 레이더 차트는 계산 스크리닝 워크플로우에서 확인된 50개의 대표 리간드에 대한 물리화학적 특성을 포괄적이고 다차원적으로 시각화합니다. 이 검사는 각 화합물이 미리 정해진 '약물과 유사한' 기준을 얼마나 잘 준수하는지, 그 특성을 확립된 하한과 상한선에 대비하여 평가하도록 설계되었습니다. 이 차트는 극축을 중심으로 배열된 10개의 주요 분자 기술자를 표시하는데, 여기에는 pKa 산성과 pKa 염기성이 포함됩니다. 녹색 폴리곤(하한)과 파란색 폴리곤(상한) 사이의 음영 영역은 프로토콜에 제공된 임계값을 기반으로 각 속성의 이상적 또는 허용 범위를 표시했습니다. pKa산(2–12)과 pKa 염기(3–10)의 상한과 하한은 문헌 검토^{35, 36, 37}을 기준으로 정해졌으며, 신약 개발에서 pKa에 대한 단일 상한과 하한선이 존재하지 않기 때문입니다. 각 색 선은 50개의 리간드 중 하나를 나타냅니다. 단일 리간드의 데이터 포인트를 연결하여 형성된 형태는 선택된 열 개의 성질에 걸쳐 동시에 그 프로파일을 보여줍니다. 50개의 리간드 중 대부분은 녹색과 파란색 다각형이 정의하는 허용 영역 내에 있거나 매우 근접합니다. 이는 초기 필터링 단계, 특히 리핀스키의 5법칙 적용과 타니모토 유사성에 기반한 군집화가 약물 유사성을 가진 분자로 데이터셋을 풍부하게 하는 데 매우 효과적이었음을 나타냅니다. 모든 매개변수에 대해 문서화된 값의 전체 범위를 표시하는 것이 권장됩니다.

그림 6A–C는 ADMETlab3.0과 SwissADME 데이터의 구성 요소를 보여줍니다. 흡수와 분포부터 시작하여, SwissADME의 그림 6A에 나타난 BOILED-Egg 모델³⁸은 그래프의 노란색과 흰색 타원으로 표시된 지독성과 투과성을 통한 약물의 흡수와 분포를 나타냅니다. 여기에는 P-gp 기질과 억제제가 포함되며, 각각 파란색과 빨간색 점으로 표시되며, 이때 P-gp 억제가 더 높은 흡수율을 위해 매우 중요합니다. 그림 6B에서 대사 히트맵은 약 7가지 CYP 사이토크롬 p450 효소의 억제 및 기질을 시각화합니다. 리간드의 원하는 결과는 CYP 비억제제 및 비기질(녹색)으로, 약물-약물 상호작용이 없거나 낮은 안전한 약물 안전성 프로파일을 확인하는 결과를 선호하는 것입니다. 그림 6C는 약물의 제거 및 반감기에 대한 배설 데이터를 나타냅니다. 배설은 최적의 혈장 클리어런스(<5 mL/min/kg)로 구분할 수 있습니다. 모든 항암제의 약물 반감기는 작용 기전, 독성, 표적에 따라 달라집니다. 이상적인 반감기는 치료 기간 내에서 약물 농도를 유지하면서 독성을 최소화하고 편리한 투여 일정을 가능하게 하는 균형을 이룹^니다.

두 가지 유형의 독성 평가가 결합된 모습이 나타난다. 그림 7A에는 ADMETlab3.0이 식별한 각 리간드별 독성포어 수가 표시되어 있습니다.  독성포어의 허용 범위에 대한 명확한 임계값이나 정보는 없습니다.  그림 7B에서 톡스트리의 적용은 독성 등급(I-III)과 크레이머 규칙 위반 및 준수 여부와 관련된 정보를 제공합니다. 리간드 1의 샘플 결과는 독성 결과와 SMILES 코드가 상단 바에 표시되며, 구조는 왼쪽 아래 창에 표시됩니다. 오른쪽 상단 창의 클래스 독성 식별은 클래스 II(중간 독성)나 클래스 I(저독성) 같은 다른 가능성과는 달리, 크레이머 규칙에 근거한 리간드 1의 높은 독성(클래스 III)을 나타냅니다.  오른쪽 아래 창은 크레이머 규칙 결정 트리를 기반으로 한 클래스 식별의 문학적 추론을 보여줍니다.

최적화된 구조의 진동 주파수 ORCA QM 계산은 밴드 갭 결정을 위한 궤도 에너지 값을 계산합니다. 그림 8 은 HOMO와 LUMO의 차이에서 유도된 각 리간드의 밴드 갭(eV)을 보여줍니다. 임계값 범위는 3.6 eV에서 5.0 eV 사이의 음영 영역에 나타내며, 음영 영역의 각 점이 더 바람직한 안정성과 반응성에 관련된 에너지 준위를 만족합니다. 전체 계산 워크플로우의 개요는 그림 9에 요약되어 있으며, 표적 단백질 준비와 천연 제품 데이터베이스 스크리닝부터 ADMET-S 평가까지의 순차적 단계를 보여줍니다. 이 단계는 약물 유사 특성과 화학적 안정성을 보장하면서 선택적 PLK1-PBD 억제제를 식별하도록 설계되었습니다. 이 시각적 로드맵은 프로토콜의 모듈화성, 접근성, 교육 구현 적합성을 강조합니다.

표 1은 프로토콜을 선형적인 명령어 시퀀스에서 교실 및 독립 연구에 적합한 견고하고 오류 인식이 있는 파이프라인으로 전환하여 운영화합니다. 이 연구는 계산 신약 개발에서 알려진 도전 과제인 재현성을 명확히 해결하며, 주요 전환점에 검증 기준을 내장합니다. 예를 들어, CHARMM-GUI 처리 후 히스티딘 잔기가 일관되게 "HIS"로 표시되는지 확인하면 하위 도킹에서 조용한 실패를 방지하고, 클러스터링 전에 SMILES의 무결성을 검증하면 ADMET 예측에서 연쇄 오류를 방지합니다. 표는 또한 교육 설계를 강조하며, 각 문제 해결 팁은 최소한의 계산 배경(예: "텍스트 편집기에서 .complex.pdb 열어 체인 ID를 확인한다")으로도 실행 가능하며, 청각장애인, 학부생, 고등학생 학습자의 접근성 목표와 일치합니다. 더불어, 비교 PRODIGY 점수를 통한 선택성 평가와 같이 결과가 결과에 불균형적으로 영향을 미치는 단계를 표시함으로써 사용자가 주의력과 자원을 우선순위로 정할 수 있도록 돕습니다.

이 통합 워크플로우의 주요 강점은 상호 보완적인 계산 예측 간의 불일치를 드러내어 단일 방법의 한계를 드러내는 예외 사례를 드러낼 수 있다는 점입니다. 예를 들어, PLK1-PBD용 리간드 5는 강한 CB-Dock2 Vina 점수(−7.9 kcal/mol)와 우수한 PRODIGY 친화도(ΔG = −9 kcal/mol, 그림 4)를 보였으나, 여러 ADMET 필터에는 실패했습니다. 이 물질은 삶은 달걀 흡수-분포 모델에 부합하지 않았고, 혈장 제거 값이 낮게 나타났습니다(9.3 mL/min/kg, 그림 6). 이는 빠른 제거를 시사했으며, Toxtree에 의해 5개의 독성포어를 포함한 Cramer Class III(고독성)로 분류되었습니다(그림 7A). 반면, 리간드 33은 PRODIGY 예측 PLK1 친화도(−5.4 kcal/mol)를 보였으나, 낮은 독성(클래스 I), 최적 LogP(0.7), 우수한 흡수-분포 및 혈장 클리어런스를 모두 충족하였다. 친화력이 약함에도 불구하고, 리간드 33은 약물에 더 가까운 후보입니다. 이 대조는 초기 신약 개발에서 중요한 원리를 보여줍니다: 높은 결합 친화력만으로는 유리한 약동학과 안전성 없이는 불충분합니다. 동시에, 리간드 5와 같은 화합물은 ADMET 성능이 낮더라도 효능을 저해하지 않으면서 안전성이나 대사 안정성을 개선할 미래 최적화에 유용한 아이디어를 제공할 수 있습니다.

이 워크플로우의 초기 필터들은 영구적인 배제가 아니라 분류 및 우선순위 지정을 위한 것이지만, 50개 후보를 더욱 간소화하면 ADMET 도구와 문헌에서 제공하는 바람직한 한계를 적용하여 일부를 '상위 히트'로 지정하게 되었습니다. 114개의 ADMET 관련 및 전자 기술자에서 평가된 50개의 선별 리간드 중 13개가 최소 95가지 이상의 바람직한 특성 기준을 충족했습니다. 이 중 6가지 화합물(10, 13, 14, 32, 43, 47)은 PLK2/3보다 우수한 ADMET-S 프로필과 PLK1-PBD에 대한 결합 친화도를 모두 보여 상위 후보 억제제로 지정되었습니다(그림 10). 구조-기능적 및 정량적 유사성 비교 분석 결과, 확인된 히트가 알려진 PLK1-PBD 억제제와 주요 약리적 특성을 공유하여 결합 행동에서 수렴 가능성을 시사합니다. 모든 히트는 TQ, 폴록신, 알로폴레-A의 소수성 고리 시스템을 반영하는 방향족 또는 이종 방향족 스캐폴드를 포함하여, PBD 주머니 내에서 π–π 및 소수성 상호작용을 가능하게 했습니다. 기능적 중복은 참조 억제제에서 주요 극성 접촉을 매개하는 수소 결합 모티프(카복실, 아마이드, 카보닐기)를 통해 명확히 나타났다. 여러 히트에서 존재하는 유연한 지방산 및 고리형 링커는 폴록신 유사체의 구조적 적응성과 유사하여 필수 결합 잔기로 방향을 맞추는 데 도움을 줍니다. 정량적으로 타니모토 유사도 점수(0.36–0.54)는 히트와 알려진 억제제 사이에 중간 정도의 구조적 유사성을 확인했으며, 히트 10, 13, 14가 폴록신과 가장 유사했고, 히트 32는 TQ, 히트 43과 47은 Allopole-A와 유사했다. 이 결과들은 명확한 구조적·기능적 중복을 강조하며, 히트가 검증된 PLK1-PBD 억제제의 결합 위상 및 상호작용 패턴을 모방하면서도 추가 최적화를 위한 충분한 신규성을 유지함을 보여준다(그림 10).

계산 워크플로우의 견고성을 평가하기 위해, 알려진 PLK1-PBD 억제제(폴록신판¹⁴ 및 알로폴-A¹⁵)를 양성 대조군으로 분석하였고, 메트포르민과 이메글리민(구조적으로 관련 없고 보고된 활성이 보고되지 않은 두 가지 항당뇨제)은 ADMET-S, 도킹, 결합 친화도 분석에서 음성 대조군으로 평가되었습니다. 양성 대조군은 각각 –5.8 kcal/mol의 결합 친화도를 보였고, 음성 대조군은 메트포르민의 결합 친화도가 –5.1 kcal/mol, 이메글리민의 –4.8 kcal/mol로 약한 친화도를 보였으며, 이는 PBD 결합 활성이 부족했음을 반영합니다. 흥미롭게도 ADMET-S 평가에서는 음성 대조군이 양성 대조군(114개 중 80개)보다 더 바람직한 특성(114개 중 88개)을 충족하여, 약물동학 호감성과 표적 특이적 결합 잠재력을 구분하는 워크플로우의 능력을 검증했습니다. 이러한 결합은 균형 잡힌 관점을 유지하는 것의 중요성을 강화합니다: 강한 표적 친화도를 보이는 화합물을 최적이 아닌 ADMET 예측만으로 조기 폐기해서는 안 되며, 이러한 스캐폴드는 여전히 최적화의 중요한 출발점이 될 수 있습니다. 반대로, 우수한 약물동학적 특성을 가지지만 결합이 약한 분자는 유사체 개발의 저위험 템플릿이 될 수 있습니다. 이러한 계산적 관찰을 확인하고 우선순위 기준을 정교화하기 위해 추가적인 생화학적 및 세포 검증이 필요합니다.

그림 1: 준비되지 않은 4HCO 구조와 CHARMM-GUI 준비된 4HCO 구조 간의 구조적 비교. (A) PDB에서 직접 업로드된 4HCO 구조물, 누락된 잔여물을 강조하는 것. (B) CHARMM-GUI 준비 프로토콜 후 4HCO 구조. 4HCO(TQ에 결합된 PLK1-PBD)는 유기 리간드가 결합된 몇 안 되는 PLK1-PBD 결정 중 하나로, 이 구조 기반 소분자 억제제 발견에 직접 적용 가능하기 때문에 선택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 분자 지문 인식과 타니모토 유사성을 기반으로 한 K-평균 군집화 후 999개의 리핀스키 준수 천연물에 대한 주성분 분석(PCA). 각 점은 화합물을 나타내며, 할당된 군집(1–50)으로 색칠되며, 화학적 유사성을 강조하기 위해 군집은 회색 타원으로 묶여 있습니다. 클러스터 내 밀접한 군집화와 클러스터 간 분리는 타니모토 기반 클러스터링이 구조적 중복성을 성공적으로 줄이면서 데이터셋 전반에 걸친 화학적 다양성을 유지했음을 시사합니다. 이러한 다양성은 하류 도킹에 선택된 50개의 대표 리간드가 광범위한 화학 공간에 걸쳐 있음을 보장하여, 가상 스크리닝 결과의 견고성과 일반화 가능성을 높입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: CB-Dock2 블라인드 도킹은 PLK1 폴로박스 도메인(PBD) 내 리간드 1의 고친화도 결합 포즈를 식별합니다. 표시된 CurPocket C2 구조(Vina 점수 = −7.5 kcal/mol)는 예측된 다섯 개 결합 부위 중 최적 자세를 나타내며, 반데르발스 접촉과 주요 PBD 잔기(Trp414, His538, Lys540)와의 수소 결합이 특징입니다. 이 결과는 구조 기반 블라인드 도킹을 통해 공동결정화된 리간드가 없을 때 생물학적으로 중요한 결합 주머니를 찾는 것을 검증하여, 워크플로우가 가장 강한 예측 결합 에너지를 가진 자세를 우선시하여 후속 선택성 분석을 수행함을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: PRODIGY 웹 서버의 히트맵은 단백질-리간드 조합에 따른 친화도를 예측했습니다. 히트맵은 PLK1, PLK2, PLK3에 결합된 리간드 간 겹침을 직접 다룹니다. 일부 리간드(리간드 45 포함)는 세 PLK 아이소폼 모두에서 유사한 결합 친화도를 보여 선택성이 낮음을 시사하지만, 다른 리간드(특히 리간드 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35, 49)는 강한 PLK1 선호도를 보이며(ΔΔG ≥ 3.0 kcal/mol 대 PLK2/PLK3), 이는 PBD 선택적 억제 목표와 일치합니다. 정량적으로, 50개 리간드 중 20개는 PRODIGY가 예측한 ΔG 값을 기반으로 PLK2와 PLK3 모두에 비해 PLK1에 대해 거의 2배에 달하는 선택성을 보입니다. 이 차등 결합은 블라인드 도킹 프로토콜이 포착하는 PBD 결합 포켓의 미묘한 변동에 기인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: ADMETlab3.0과 SwissADME에서 결합된 물리화학적 특성 표현. 매개변수는 nHD = 수소 공여체 수, nHA = 수소 수용체 수, 염기성 pKa, 산성 pKa, nStereo = 입체중심 수, LogP = n-옥탄올/물 분포 계수, LogD = n-옥탄올/물 분포 계수(pH=7.4), LogS = 수용도, Fsp3 = sp3 혼종 탄소 수/총 탄소 수, nHet = 헤테로아트 수 등입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: ADMETlab3.0과 SwissADME의 조합 결과. (A) 와일드먼-크리핀 LogP (WLOGP) 대 SwissADME의 위상 극지방 표면적(TPSA)은 노란색(노른자) 영역의 흡수 및 분포 혈액-뇌장벽(BBB) 투과성, 흰색 타원의 위장관을 통한 흡수(HIA), 파란색과 빨간색 점의 P-당단백질 기질과 비기질을 나타냅니다. "난자" 밖에 있는 분자는 흡수와 분포가 좋지 않은 것으로 간주됩니다. (B) 다양한 시토크롬 P450(CYPs) 식별자를 이용한 대사 열맵으로, 인간 간 대사(HLM) 안정성과 관련된 것으로, 빨간색은 억제제/기질, 녹색은 비억제자/비기질로 사용되어 녹색이 바람직함으로 남습니다. (C) 배설은 매개변수, 혈장 클리어런스, 반감기가 포함됩니다. 점선 빨간색은 바람직한 혈장 클리어런스(<5 mL/min/kg)를 나타내며, 5-15 mL/min/kg과 >15 mL/min/kg은 각각 중간과 높은 클리어런스를 나타냅니다.  이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 7: 통합 독성 프로파일링은 선별된 리간드의 치명적인 안전 책임을 드러낸다. (A) ADMETlab3.0이 예측한 50가지 대표 천연 생성물 전체에 걸친 독성포자 수치의 분포. (B) 빨간색으로 강조된 클래스 III 독성을 나타내는 리간드 1의 샘플 독성 결과, 아래 텍스트 박스에 나열된 관련 크레이머 규칙에 대한 상세한 설명. 이 이중 평가 접근법(독성포자 + 크레이머 클래스)은 고위험 화합물의 조기 분류를 가능하게 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 8: 50개의 대표 자연산물 유래 리간드에 대한 HOMO–LUMO 밴드갭 에너지(eV 단위), B3LYP/def2-TZVP 이론 수준에서 ORCA를 사용해 계산됨. 음영 영역(3.6에서 5.0 eV)은 최적의 안정성 창을 나타내며, 밴드 갭이 3.6 eV 미만은 높은 화학 반응성이나 잠재적 광분해를 의미하며, 5.0 eV 이상은 전자 편극성이 낮고 결합 적응성이 감소할 수 있음을 나타냅니다. 이 범위 내에 속하는 리간드는 동역학적 안정성과 분자 반응성의 균형이 우호적이어서 PLK1-PBD 억제제 후보로 우선순위를 정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 9: 이중언어 계산 신약 개발 워크플로우의 흐름도. 파이프라인은 PLK1-PLK3 PBD 구조 준비로 시작하며, 이후 SuperNatural 3.0 데이터베이스의 질병 중심 스크리닝과 Lipinski의 Rule of Five(분자량 ≤ 500 Da, 수소 결합 공여체 ≤ 5, 수용체 ≤ 10, LogP ≤ 5) 을 통한 필터링이 이어집니다. 대표적인 화합물은 클러스터링 후 선정된 후, 단백질-리간드 도킹, 결합 친화도 예측, 그리고 흡수, 분포, 대사, 배설, 독성, 양자력 균형 평가 등 포괄적인 ADMET-S 프로파일링을 통해 평가됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 10: 상위 후보 리간드와 알려진 PLK1-PBD 억제제 간의 구조적·기능 유사성 비교. 이 그림은 가상 스크리닝, 클러스터링, 결합 친화도, ADMET-S 프로파일링 분석을 결합해 확인된 6가지 주요 후보 화합물(10, 13, 14, 32, 43, 47)을 강조합니다. 이 리간드는 114개의 바람직한 물리화학적 및 약동학 기술자 중 최소 95가지를 만족했으며, PLK2/3에 비해 PLK1-PBD에 대한 결합 친화도가 더 높았습니다. 구조적 및 기능적 수렴 가능성을 평가하기 위해, 각 리간드는 공유된 핵심 약물 모티프와 쌍별 타니모토 유사 계수(ECFP4 지문)를 기반으로 알려진 PLK1-PBD 억제제인 TQ, 폴록신, 알로폴레-A와 비교하였다. 중간 정도의 유사도 점수(0.36–0.54)와 방향족 또는 이종방향족 고리, 수소결합 공여체/수용체 쌍, 소수성 링커와 같은 공통 작용기는 결합 특징의 부분 중첩을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

워크플로우 단계	중간 체크포인트 (성공 확인 방법)	중요한 단계(성공/실패를 결정하는 이유)	일반적인 문제 및 문제 해결 안내
1. 표적 단백질 준비	• PDB 파일이 Mol* 뷰에서 오류 없이 로드됩니다. • 바인딩 포켓에 누락된 잔여물이 없음(육안 검사). • "HIS"로 표기된 히스티딘 잔기(HSD/HSE가 아님)	부정확한 단백질 구조→ 가짜 결합 포켓→ 오해를 불러일으키는 도킹 자세. CHARMM-GUI는 올바른 프로톤화, 수소 배치, 그리고 물/리간드의 제거를 보장합니다.	문제: CB-Dock2가 PDB 파일을 거부합니다. 수정: 비표준 잔기(nonstandard residus)를 제거하고, 단백질 사슬만 존재하도록 하며, 원자/잔기 이름을 텍스트 편집기로 표준화합니다.
2. 천연 제품 필터링 (리핀스키의 5가지 법칙)	• "all.csv"는 유효한 SMILES(비공허, 화학적으로 해석 가능)만 포함합니다. • 예상 경기 카운트 (예: 999/1,193)	유효하지 않은 SMILES는 RDKit, 도킹 서버, ADMET 도구가 다운됩니다. 필터링은 화학적 타당성을 유지해야 합니다.	문제: 클러스터링 중에 스크립트가 실패합니다. 수정: Python에서 Chem.MolFromSmiles(smiles, sanitize=True)를 사용해 SMILES 검증을 추가하세요; 진행하기 전에 유효하지 않은 항목을 기록하고 삭제하세요.
3. 군집 표본 추출	• "rep_struct.txt"에서 50가지 독특한 미소. • PCA 플롯(그림 2)은 명확한 군집 분리를 보여줍니다.	불필요한 군집 형성→ 중복되거나 다양성이 부족한 대표자들→ 비효율적인 선별이 있습니다.	문제: 모든 분자가 한 그룹으로 모입니다. 수정: 지문 유형(예: Morgan/ECFP4), Tanimoto 임계값, SMILES 표준화를 검증하세요. 다양성이 낮다면 군집 수를 늘리는 것을 고려하세요.
4. 단백질-리간드 도킹(CB-Dock2)	• 각 리간드는 ≥1개의 ".complex.pdb" 파일을 반환합니다. • 비나 점수는 음수(예: ≤ −5 kcal/mol). • 리간드는 CurPocket(표면이 아님)에 위치합니다.	도킹은 바인딩 자세와 친화도를 정의합니다. 잘못된 포즈→ 거짓 PRODIGY 예측.	문제: 작업 실패, 또는 리간드가 도킹되지 않음. 수정: CB-Dock2에서 SMILES를 사용해 리간드를 다시 그리기; 파일명에 특수 문자가 없도록 보장; 채용 상태를 확인하려면 이메일을 확인하세요. 계속 사용한다면 백업으로 SwissDock을 시도해 보세요.
5. 결속 친화력 (PRODIGY)	• PRODIGY는 모든 복합체에 대해 ΔG 값을 반환합니다. • 친화도는 CB-Dock(Vina) 점수(추세 일관성)와 상관관계가 있습니다.	선택성 평가는 PLK1과 PLK2/PLK3의 정확한 ΔG에 달려 있습니다. 체인/리간드 ID가 잘못 할당되면 잘못된 예측→ 있습니다.	문제: "체인을 찾을 수 없습니다" 오류. 수정: .complex.pdb를 텍스트 편집기에서 엽니다; 단백질 사슬 식별자(예: "P")와 리간드 잔기 이름(예: "UNL")을 확인; PRODIGY에서 올바르게 입력하세요.
6. ADMET-S 평가	• 50개의 SMILES 반환 결과는 모두 SwissADME, ADMETlab3.0, ToxTree에서 나옵니다. • 출력 CSV에 "N/A" 또는 "Error" 행이 없습니다.	일관성 없는 ADMET 데이터→ 결함 있는 후보자 순위. 플랫폼은 이국적인 천연 제품 스캐폴드에서 실패할 수 있습니다.	문제: ADMETlab3.0이 SMILES를 거부함. 수정: RDKit(MolToSmiles(MolFromSmiles(...)))를 사용해 SMILES를 정규화하기. ToxTree의 경우, 한 번에 한 분자씩 입력하고 구조 렌더링을 검증하세요.
7. 양자 안정성 (ORCA)	• 각 ORCA 작업은 "SCF 미수렴" 또는 "기하학적 오류" 없이 완료됩니다. • 출력(.out) 파일에 존재하는 HOMO/LUMO 값.	밴드갭은 화학적 안정성과 반응성을 결정합니다. 실패한 작업 = 키 필터의 누락된 데이터.	문제: ORCA 작업 충돌. 수정: Avogadro에서 지오메트리를 다시 최적화; 중복된 원자가 없도록 보장하고; 큰 분자의 경우 maxcore 비율을 높이거나 def2-SVP 기지로 전환하세요.
8. 통합 ADMET-S 필터링	• 최종 리간드 목록은 모든 기준을 충족합니다(예: LogP 0–3, 밴드 갭 3.6–5 eV, 크레이머 클래스 I/II). • ≥1 리간드는 PLK1 선택성(ΔΔG ≥ 2 kcal/mol vs. PLK2/3)을 보입니다.	지나치게 엄격하거나 일관성이 없는 임계값은 유효한 리드를 사라지게 합니다; 너무 관대한 임계값은 독성이나 불안정한 화합물을 진전시킵니다.	문제: 모든 필터를 통과하는 리간드가 없습니다. 수정: 한 번에 한 가지 기준을 완화하고(예: LogP가 4개 또는 3개 독성포어≤ 허용), 그 트레이드오프를 문서화하세요. 벤치마킹을 위해 알려진 약물과 비교하세요.

표 1: 선택적 PLK1-PBD 억제제를 식별하기 위한 8단계 이중언어 계산 워크플로우 전반에 걸친 중요한 품질 관리 체크포인트, 고영향력 결정 지점 및 문제 해결 전략. 각 행은 단백질 준비부터 통합 ADMET-S 필터링까지의 주요 프로토콜 단계에 해당하며, (i) 성공 여부를 검증하는 방법(중간 체크포인트), (ii) 이 단계가 전체 성공 또는 실패에 결정적인 이유(중요한 단계 근거), (iii) 일반적인 기술적 실패에 대한 실질적 해결책(문제 해결 지침)을 명시합니다. 이 표는 학문적 또는 자원이 제한된 환경에서 프로토콜을 실행하는 학생과 연구자에게 검증 로드맵이자 교육 보조 자료 역할을 합니다.

보조 파일 1: 파이썬 스크립트. Lipinski 규칙 적용용 Python 스크립트를 포함하고 있습니다; 클러스터링 분석에 사용되는 Python 스크립트; 물리화학적 특성 계산을 위한 Python 스크립트; 대사 분석을 위한 R 스크립트; 배설물 분석을 위한 파이썬 스크립트; 독성 예측을 위한 파이썬 스크립트; 안정성 평가를 위한 Python 스크립트; 그리고 분석된 50가지 화합물의 SMILES 실도 포함됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

Discussion

본 연구는 가상 스크리닝, 도킹, ADMET-S 분석을 통해 잠재적 PLK1-PBD 억제제를 식별하고 평가하는 탐색적 계산 워크플로우에 중점을 둡니다. 파이프라인은 예측된 결합 경향과 약동학적 특성을 바탕으로 화합물을 효과적으로 우선순위를 정합니다. 이 프로토콜에서는 가능한 PLK1 억제제 집합을 확인하고, 이들의 ADMET 특성과 PLK1–3 단백질에 대한 결합 친화도를 평가합니다. 이 프로토콜은 약 73,400개의 데이터베이스에서 50개의 분자를 질병 중심으로 식별하는 방식을 사용합니다(그림 9). 그 후 이 50개 분자는 ADMET-S 평가를 거쳐 약동학적 및 약리역학적 특성, 약물 유사성, 안정성을 계산했습니다. 또한, PLK1–3 단백질에 대한 결합 친화도를 계산하여 PLK1에 대한 억제 효능과 선택성을 평가하였습니다. 결과에 따르면 여러 분자가 더 바람직한 특성을 보였습니다. 이후 신약 발견 연구에서는 일부 분자를 제거하고 일부에 집중하거나, 초기 제거를 보류하고 이 결과를 약물 설계 과정 후반에 활용해 ADMET의 특성을 최적화할 수도 있습니다.

PLK1, PLK2, PLK3에 집중하고 PLK4와 PLK5는 제외하는 생물학적 근거는 구조적·기능적 고려 모두에 기반합니다. PLK4와 PLK5는 PLK1과 뚜렷한 구조적·기능적 차이와 암 치료에서의 한계 영향으로 인해 이 연구에서 제외됩니다. PLK1은 키나제 도메인과 폴로박스 도메인(PBD)으로 특징지어지며, 유사분열 사건 조절에 중요한 역할을 하여 암 치료의 핵심 표적입니다⁴¹. 반면, PLK4와 PLK5는 구조적으로 다릅니다: PLK4는 정형적인 PBD 대신 암호화 폴로박스(CPB)를 포함하며 주로 중심립 중복 기능을 수행합니다. 동시에 PLK5는 기능적 키나제 도메인이 없고 거의 전적으로 뇌에서만 발현^됩니다. PLK1-PBD와의 구조적 중복이 미미하고 암에서 유사분열 조절 이상과의 관련성이 제한적이기 때문에, 이들의 포함은 PLK1-PBD 억제제의 선택성에 의미 있는 영향을 미치지 못합니다. 따라서 선별 전략은 선택성 평가를 위한 생물학적으로 관련성 있고 계산적으로 다루기 쉬운 틀을 제공합니다. 중요하게도, 상위 6개 후보 리간드(10, 13, 14, 32, 43, 47)는 알려진 억제제인 TQ와 Allopole-A보다 더 유리한 결합 에너지와 ADMET-S 프로필을 보여, PLK1-PBD 변조제로서 부각시켰습니다.

특히 계산 신약 발견 도구에 익숙하지 않은 학생이나 연구자들의 견고한 구현을 지원하기 위해, 표 1에는 주요 체크포인트(프로토콜 섹션에도 있음), 중요한 단계, 워크플로우에 대한 문제 해결 지침 요약이 제공됩니다. 이 테이블은 적응성을 지원합니다; 예를 들어, 사용자가 HPC 접근이 부족하면 ORCA 안정성 분석이 연기 가능하다는 점을 인지할 수 있고, 웹 서버가 다운되면 SwissDock과 같은 대안을 제안할 수 있습니다. 이러한 유연성은 다양한 기관 환경에서 워크플로우가 지속 가능하도록 보장하면서도 과학적 엄격성을 유지하고, 연구가 초기 신약 개발에 포용적이고 이중언어적이며 교육 지향적인 기여로서 새로움을 강화합니다. 전체 워크플로우가 통합된 파이프라인으로 설계되었지만, 성공 또는 실패를 결정하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다( 표 1 참조). 또한, 동반된 영상에는 동기화된 영어 자막과 미국 수화(ASL) 수화자가 포함되어 있어 방해받지 않고 공평하게 접근할 수 있도록 설계되었습니다. 서명자의 지시는 화면 동작과 시간적으로 정렬되어 있는데, 예를 들어 "다음" 수화를 한 후 커서가 "다음" 버튼을 클릭할 때 일시정지합니다. 4HCO 준비 단계에서 서명자는 손가락 표시("A"와 "B")를 사용해 체인 선택을 안내하며, 이는 화면 녹화에 정확히 반영됩니다. SuperNatural 3.0 스크리닝 구간에서는 서명자의 창이 크기 조정되어 오른쪽 상단으로 이동하며, "경로" 아이콘에 주의를 집중시키고 커서가 따라오는 동안 멈춥니다. 이러한 디자인 선택은 청각장애인 및 난청 시청자도 청각 사용자와 동일한 통합 실시간 안내를 받도록 보장하여, 강사 주도 실습 경험을 효과적으로 재현합니다.

이점 외에도 워크플로우를 개선할 수 있는 다양한 방법이 있습니다. 첫째, 초기 필터링을 수정할 수 있습니다; 질병 중심 및 클러스터 샘플링 방법 대신, 천연 제품 데이터베이스 내 모든 분자의 도킹 시뮬레이션을 통해 리간드-표적 단백질 결합에 가장 적합한 화합물을 식별할 수 있습니다. 또한, 결합 친화도를 정확히 예측하기 위해서는 보다 상세한 추정이 필요합니다.  PRODIGY의 단백질-리간드 친화력 계산은 상호작용에 관여하는 분류된 원자 접촉 유형(탄소-탄소, 질소-질소, 산소-산소 및 기타 원자)을 훈련된 다중 선형 회귀 모델에서 4배 교차 검증을 적용하는 것을 포함하며, 이 방법은 여러 경우에 실험적 친화도와 유의미하게 상관관계를 맺는 것입니다^42,43.  FoldX⁴⁴, fastDRH⁴⁵, 딥러닝 모델⁴⁶, 고급 샘플링이 포함된 MD와 같은 대체 접근법도 사용할 수 있으며, 각 방법의 정확도⁴⁷에 따라 예측의 일치 정도가 다양할 것으로 예상됩니다.

또 다른 측면은 ADMET-S 평가에 사용되는 다양한 소프트웨어 도구가 수많은 지표를 생성하며, 약물 적합성 평가에 사용되는 각 지표를 이해하는 것이 매우 중요하다는 점입니다. 정확성을 보장하는 한 가지 방법은 시중에 나와 있는 여러 약물을 프로토콜에 적용해 기준을 충족하는지 확인하는 것입니다.  이러한 맥락에서 독성은 추가 연구가 필요하며, 분자가 크레이머 규칙과 같은 미묘한 의사결정 트리의 독성 프로필만으로 폐기되지 않기 때문입니다. 사용 가능한 많은 약물이 유사한 분류를 가지고 있기 때문입니다.  독성포어의 수는 독성 프로필과 함께 측정해도 독성에 대해 완전히 정보를 제공하지는 않습니다.  이 맥락에서 워크플로우의 확장은 해석을 돕기 위해 사용 가능한 약물을 가진 소분자 샘플의 비교 검토를 수행하는 것입니다.  예를 들어, 연구자들은 HOMO–LUMO 밴드갭 값을 QM 계산으로 측정한 안정성을 해석할 때 타목시펜⁴⁸, 레트로졸⁴⁹, 시스플라틴⁵⁰과 같은 현재 유방암 약물에서 DFT 계산의 적용과 관찰을 문서화한 이전 문헌을 인용했습니다. 이전에도 유사한 워크플로우가 다양한 질병/장애 표적에 대한 잠재적 억제제를 식별하는 데 채택되었습니다⁵¹. 최근 Stafford 등은 PLK1-PBD 억제제 설계 전략과 암에서의 치료 ^{기회를 검토했습니다} . 최근 연구에서는 구조 유도 약물 포어 모델링, 가상 스크리닝, 분자 도킹, 분자 동역학(MD) 시뮬레이션, 생물학적 평가⁵²를 통해 PLK1-PBD와 PLK4-PB3에 대한 이중 표적 억제제가 확인되었습니다. Zhou 등은 3D QSAR 약물포어, ADMET, 스캐폴드 호핑, 분자 도킹, MD⁵³을 사용하여 해양 천연 제품 라이브러리에서 PLK1-PBD 억제제를 확인했습니다.

전반적으로 이 연구의 새로움은 네 가지다. 첫째, 미국 수화와 영어로 제공되는 이중언어 계산 프로토콜로, 특히 청각장애인 및 난청 학생과 연구자들을 위한 STEM 분야의 접근성과 포용성을 증진시킵니다. 이러한 이중 언어 전달은 계산 신약 발견에서 드물며, 갤러뎃 대학교가 공평한 과학 교육을 선도하려는 사명과 일치합니다. 둘째, PLK1이 여전히 매력적인 항암 표적이지만, PLK1, PLK2, PLK3 전반에 걸친 선택성을 통합된 구조적, 에너지적, ADMET-S 기준을 이용한 엄격한 계산 연구는 드물다. 대부분의 이전 연구들은 키나제 도메인 억제에만 집중하거나 비교 선택성 프로파일링이 부족합니다. 이 연구는 세 개의 PLK-PBD에 대한 초기 탐색적 동시 스크리닝 프로토콜을 제공하고, 높은 PLK1 친화도와 최소한의 오프타겟 결합을 기반으로 화합물을 우선순위로 선택하는 필터를 제공함으로써 이 격차를 해소합니다. 셋째, 워크플로우는 특히 교육적이고 자원이 제한된 환경에서 효율성과 사용성을 고려하여 설계되었습니다. 데이터베이스 필터링부터 ADMET-S 평가까지 전체 파이프라인은 표준 학술 하드웨어(8GB RAM의 노트북)에서 무료 웹 기반 소프트웨어(CB-Dock2, PRODIGY, SwissADME, ADMETlab)를 활용하여 2주 이내에 완료할 수 있습니다. 도킹 및 결합 친화도 계산은 시간 소모적인 단계가 아닙니다(리간드당 ~30초). 가장 시간 소모적인 단계는 ORCA를 이용한 양자역학 안정성 분석으로, 이는 후속 단계로 미루거나 고성능 컴퓨팅 자원에서 실행할 수 있음을 보여줍니다. 스크립트는 모듈화되어 기본 명령줄이나 Jupyter 노트북 편집만 필요로 기존 커리큘럼에 원활하게 통합됩니다. 실행 시간은 적당하며 데이터베이스 필터링과 Lipinski 준수는 몇 분 만에 걸립니다; ~1,000개의 분자 클러스터링은 일반적인 데스크톱에서 30분 이내에 완료됩니다. 모든 소프트웨어 도구는 학술 용도로 무료로 제공되며, 크로스 플랫폼(Windows, macOS, Linux)이 지원되며, 상업용 라이선스가 필요 없어 진입 장벽을 크게 낮춥니다. 넷째, 확인된 리간드는 나노몰라 범위 상호작용과 일치하는 유망한 결합 친화도를 보여주며, 약물 유사성, 대사 안정성, 낮은 독성 프로필을 보였습니다. 여러 후보가 ADMET-S 특성을 가진 강력하고 선택적인 PLK1-PBD 결합체로 나타나 분자 역학 시뮬레이션이나 시험관 내 분석법을 통한 추가 검증이 필요합니다.

따라서 방법론적 유용성을 넘어, 이 연구는 접근성 높고 오픈소스이며 효율적인 계산 도구를 고부가가치 생의학 과제를 해결하고 포용적인 과학 교육을 촉진하는 출발점으로 활용할 수 있음을 보여줍니다. PLK1-PBD 억제제가 종양학에서 계속 주목받음을 얻으면서, 이 워크플로우는 초기 신약 개발을 위한 재현 가능하고 교육 친화적인 청사진을 제공합니다. 다재다능함 덕분에 고등학교, 학부생, 대학원 환경에 적합하며, 학생들에게 진정성 있고 실습 중심의 연구 기회를 제공하는 CURE의 훌륭한 기초를 제공합니다. 키나아제 도메인 도킹이나 단일 단백질 스크리닝에만 의존하는 파이프라인과 달리, 이 접근법은 PLK1–3 전반에 걸쳐 PBD의 선택성을 동시에 평가하는데, 이는 >38%의 구조적 상동성과 생물학적 역할의 차이를 고려할 때 필수적입니다. 더불어, 클러스터링, ADMET-S, QM 안정성을 오픈 액세스 프레임워크에 결합함으로써 중복 및 소실 위험이 무차별 대입 가상 스크리닝에 비해 감소했습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADMETLab3	시뮬레이션 플러스. 주식회사	V3.0	ADMET 특성
알파폴드	구글 딥마인드와 이소모픽 랩스 (알파벳 자회사)	V3.0.1	3D 단백질 모델링
아나콘다/콘다	아나콘다 주식회사	V24.9.2	오픈 소스 패키지 관리 시스템
CB-독2	양초연구소	V2.0	단백질-리간드 블라인드 도킹
참므-귀	리하이 대학교	V3.8	생체분자 조작 및 시뮬레이션
접근성에 관한 다윈	델라웨어 대학교	해당 없음	고성능 컴퓨팅
ORCA	FAccTs GmbH	V6.1.0	양자 화학 패키지
단백질 데이터 뱅크	전 세계 단백질 데이터 뱅크	RRID:SCR_006555	단백질 데이터베이스
RDKit	오픈 소스	RRID:SCR_014274	화학정보학 프로그래밍
슈퍼내추럴 3.0	생리과학 연구소-IT (베를린)	V3.0	자연분자 라이브러리
스위스 ADME	스위스 생물정보학 연구소	리드:SCR_017865	ADME 특성
톡스트리	아이디어컨설트 Ltd	V3.1.0	독성 분류