방법 논문

DNA/RNA 하이브리드 복합체에서 텔로머 반복 포함 RNA의 추정

DOI:

10.3791/67984

⸱

2025년 12월 5일

 ,  ,  ,  , 
1Betul-Ziya Eren Genome and Stem Cell Center, Erciyes University, 2Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 3INSERM-CNRS, Université de Nice

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 DNA:RNA 하이브리드와 그에 따른 RNA(TERRA 포함)를 여러 조직에 걸쳐 분리할 수 있게 합니다. 우리의 접근법은 하이브리드 상호작용의 일부를 포착하지만, 완전한 유전체 특성화를 위해서는 추가적인 게놈 매핑이 필요합니다.

초록

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텔로머 반복 포함 RNA(TERRA)는 고등 진핵생물의 모든 텔로미어에서 전사되는 긴 비암호화 RNA이며, 이 중 일부만이 텔로미어에서 안정적인 DNA/RNA 하이브리드를 형성합니다. 우리는 이러한 하이브리드 추정치를 식별하고 정제하기 위한 상세한 분자 프로토콜을 제시했습니다. 이 간소화된 방법은 생체 내에서 자연적으로 형성된 DNA/RNA 하이브리드 상호작용을 직접 추출할 수 있게 하며, 이러한 영역을 모두 검출하는 데 적용할 수 있습니다. 절차적 단계를 최소화함으로써 이 기술은 DNA에 부착된 RNA를 매우 효율적으로 분리하고, 후속 시퀀싱의 신뢰성과 재현성을 추정합니다. 구아니딘 이소티오시아네이트 시약은 전체 세포 용해와 균질화에 사용되며, 특히 DNA/RNA 하이브리드의 핵산(DNA 및 RNA)의 무결성을 보존합니다. 클로로포름을 첨가하면 원심분리(세 개의 뚜렷한 층)를 통해 상 분리가 시작됩니다: 하부 페놀-클로로포름 상, 간상, 상부 수용상. 핵과 세포질에서 방출된 RNA는 수상에 남아 있으며, DNA/RNA 하이브리드 영역을 포함한 고분자량 DNA는 간기에만 제한됩니다. 이소프로필 알코올을 사용한 후 원심분리를 통해 수용상(자유 RNA), 간기, 그리고 DNA, 특히 DNA/RNA 하이브리드가 회수됩니다. 남은 단백질 흔적을 제거하기 위해 샘플을 Proteinase K와 함께 배양합니다. DNase 처리, 페놀/클로로포름 추출, 이소프로필 알코올, 원심분리를 통해 DNA와 하이브리드화된 RNA를 방출합니다.

서론

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게놈의 전사는 임시 하이브리드 분자인 R-루프를 형성하는데, 이는 세 가닥 구조로 이루어져 있습니다. 이 구조에는 비암호화 및 암호화 DNA 가닥이 포함되며, 비암호화 가닥은 상보적 RNA1과의 잡종 형성에 의해 대체됩니다. 게놈 전사 과정에서는 두 DNA 가닥에서 다양한 속도로 많은 수의 비암호화 RNA가 생성됩니다. 이들 RNA의 대부분은 단명한 중간체 역할을 하지만, 일부는 텔로미어와 센트로미어와 같은 비암호화 영역에서 유래하는 유전체 생물학의 조절 네트워크에서 중요한 역할을 합니다. 게놈 내 DNA/RNA 하이브리드의 분포는 특정 시점의 세포 전사 활성도 반영할 수 있습니다.

비암호화 RNA의 조절 기능에 대한 관심이 커지면서, 특히 임시 DNA/RNA 하이브리드 형태로 유전체 전사와 분포를 추적하려는 관심도 커지고 있습니다. 이를 해결하기 위해 우리는 모든 생물학적 세포나 조직에 적용 가능한 안정적인 DNA/RNA 하이브리드를 검출하는 독립적인 분석법을 개발했습니다. 이 방법은 DNA와 함께 순제하는 상보적 RNA를 분리한 후 PCR 침전 또는 시퀀싱을 통해 분석할 수 있게 합니다.

세포 배양 모델 연구에 따르면, DNA 복제 및 전사 과정에서 위상학적, 구조적, 하이브리드화 사건들로 인해 복제 스트레스, DNA 손상, 복제 포크 충돌, RNA 중합효소 II 일시 중단이 발생할 수 있음이 밝혀졌습니다. 특히 DNA 이중 나선의 풀림 과정은 비틀림 응력을 도입하여 전사 과정에서 R-루프와 같은 비정상적인 구조가 형성될 수있습니다.

대부분의 R-루프 데이터는 효모나 배양된 암세포를 사용하여 생성되었으며, DNA-RNA 하이브리드 특이적 단일클론 항체 S9.6에 의존합니다. 구조 연구를 통해 S9.6의 항원 결합 조각(Fab)이 13bp RNA-DNA 하이브리드 이중결합체에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났습니다. 항체 기반 R-루프 검출은 주로 전사 과정에서 RNA-DNA 하이브리다이제이션이 증가할 가능성이 높은 구아닌 풍부 영역에서 형성되는 하이브리드를 확인했습니다. S9.6 항체를 이용한 시험관 내 연구는 5′ 말단 근처에 4개 이상의 연속된 구아닌을 포함하는 RNA가 더 쉽게 검출되며, 이는 R-루프 형성 증가와 상관관계가 있음을 시사합니다1. 헬리케이스, 토포이소머라제, RNase H1, RNase H2와 같은 다양한 효소가 전사 과정에서 R-루프 균형을 유지하는 데 도움을 줍니다. R-루프 항상성 파괴는 유전체 불안정성 증가와 연관되어 암과 신경퇴행성 질환과 같은 질병에 기여합니다2.

텔로미어는 한때 전사적으로 침묵하는 것으로 여겨졌으나, 텔로머 반복 포함 RNA(TERRA)3로 알려진 긴 비암호화 RNA를 전사하는 것으로 밝혀졌습니다. 이 전사체들은 서브텔로미어 영역에서 유래하며 텔로미어 반복을 포함하고 있어 텔로미어 항상성 유지에 필수적인 역할을 합니다. 이 논문에서는 'TERRA-하이브리드 RNA'를 DNase I 처리를 통해 DNA/RNA 하이브리드 복합체에서 방출되는 RNA 분자로, 추출 특성과 프라이머 특이성에 기반한 TERRA 서열을 포함하는 것으로 추정됩니다.

TERRA 전사는 센트로미어에서 텔로미어 방향으로 이루어지며, 길이는 100 bp에서 9 kb까지 다양하다. TERRA의 대부분은 수상 상태에서 자유 RNA 분자로 회수된다. 소량은 DNA에 붙어 있으며, 암과 노화와 같은 주요 생물학적 과정과 연관되어 있습니다. TERRA 수준은 아텔로미어 유위점에 따라 다르며, 텔로미어의 이색성 상태에 의해 조절됩니다. 세포 배양 연구는 또한 다양한 서브텔로미어 영역의 TERRA 전사체가 길이에서 이질성을 보인다는 것을 보여줍니다. 일부 종양 유래 세포 배양 연구에서 연구자들은 20q 서브텔로미릭 영역이 TERRA 전사체의 주요 공급원이며, 이 영역은 종종 CpG 섬 7,8,9에서 메틸화된다는 것을 발견했습니다. 쥐에서 18번 염색체의 아텔로미릭 영역은 TERRA 생성의 주요 부위입니다10,11. 또한, 배아 세포의 가의사상염색체 아텔로미르 영역에서 유래한 TERRA 전사체인 PAR-TERRA는 18번 염색체 1811,12에 비해 최대 200배 더 많은 TERRA를 가진 것으로 나타났습니다.

TERRA의 전사는 DNA 메틸화와 H3K9, H4K20 트리메틸화 같은 히스톤 변형에 의해 조절되며, 이들은 TERRA를 억제하며, 히스톤 아세틸화는 TERRA 전사 6,13,14와 양의 상관관계를 보입니다. TERRA는 또한 유전자 간 부위와 인트론을 포함한 외텔로머 영역에 결합하여 유전체 조절에서 더 넓은 역할을 함을 시사합니다.

또한 TERRA의 고갈은 특히 결합 부위 근처의 여러 유전자의 조절 이상을 초래하여, 염색질의 후생유전학적 조절과 유전자 발현에 관여하는 역할을 시사한다. 단축된 텔로미어에서의 TERRA 축적은 상동 재조합(HR) 기반 텔로미어 확장을 촉진하여 텔로미어 길이 항상성에 기여합니다15,16.

TERRA 및 기타 DNA/RNA 하이브리드의 역할을 다루기 위해, 우리는 안정적으로 DNA와 하이브리드화된 RNA 분자를 분리하도록 특별히 설계된 분석법을 사용했습니다. 간단히 말해, 핵을 분리하여 DNase 없는 RNase로 처리하여 보호되지 않은 RNA를 제거했습니다. 그 후 선택적 DNase 분해를 통해 DNA/RNA 하이브리드를 추출하는데, 이 분해는 원래 DNA와 하이브리드화된 RNA를 방출합니다. 이 분획은 "DNA/RNA 하이브리드 관련 RNA"라고 불리며, 이후 RNA-seq로 분석되어 표준 페놀-클로로포름 추출로 얻은 총 용해성 RNA와 비교되었다. 이 접근법을 통해 RNA-DNA 하이브리드 형성의 텔로머 및 비텔로머 부위를 모두 식별하고, DNA 결합 RNA 풀과 용해성 RNA 풀의 전사체 프로필을 비교할 수 있었습니다. 한때 텔로미어 전사의 부산물로 여겨졌던 TERRA는 이제 텔로미어 유지에 이중 역할을 하며, 텔로머라아제 활성과 상동 재조합에 영향을 주어 텔로미어 길이의 항상성에 중요한 역할을 합니다. 더불어, 검출 분석법의 발전으로 RNA와 DNA 간의 게놈 전반에 걸친 동적 상호작용에 대한 더 상세한 이해가 가능해졌습니다. 이 지식은 TERRA와 같은 DNA/RNA 하이브리드가 세포 과정에서 갖는 함의와 암 및 신경퇴행성 질환과 같은 질병과의 잠재적 연관성을 더 깊이 탐구하는 길을 열어줍니다. 이 분야의 지속적인 연구는 유전체 조절과 그것이 건강과 질병에 미치는 관련성에 대한 이해를 분명히 심화시킬 것입니다.

본 연구에서 TERRA 분자와 DNA/RNA 하이브리드를 식별하는 방법은 여기에 자세히 설명된 최적화된 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출 프로토콜과 동일합니다. 이 프로토콜은 RNA-DNA/RNA 하이브리드, 전체 RNA, 유전체 DNA를 통합된 워크플로우 내에서 동시에 분리할 수 있도록 개발되었습니다. 고전적인 3상 분리법을 전략적으로 수정함으로써, 이 프로토콜은 페놀 간기에서 DNA/RNA 하이브리드의 선택적 보존을 용이하게 하여 손실을 최소화하는데, 이는 기존 추출 기술의 본질적인 한계입니다.

전통적으로 DNA/RNA 하이브리드의 검출 및 분리는 DNA/RNA 하이브리드 구조를 특이적으로 인식하는 S9.6 단클론 항체에 의한 면역침전에 의존해 왔습니다18,19. 이 S9.6 기반 접근법은 널리 사용되지만, 항체 접근성, 비용, 그리고 잠재적 교차반응성에 의해 제한될 수 있습니다. 반면, 우리 프로토콜은 비용 효율적이고 항체 독립적인 대안을 제공하며, 세포 및 조직 유래 샘플 모두에 쉽게 적용할 수 있습니다.

분리된 DNA/RNA 하이브리드 분획의 순도와 구조적 완전성을 더욱 높이기 위해, 우리는 단백질분해효소 K 매개 탈단백화를 도입한 뒤 DNase I 처리를 진행하였습니다. DNase I 단계는 DNA/RNA 하이브리드의 DNA 가닥을 선택적으로 소화하여 하이브리드화된 RNA를 방출하여 이후 분리 및 하위 분자 분석에 사용한다20. 이 접근법은 회수된 RNA 종이 생체 내에서 안정적으로 DNA와 잡종화된 RNA 종임을 보장합니다. 모듈식 구성과 확장성 덕분에 우리의 프로토콜은 다양한 생물학적 맥락에 폭넓게 적응할 수 있으며, 연구자들에게 다양한 실험 시스템에서 DNA/RNA 하이브리드 생물학을 탐구할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

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프로토콜

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동물을 대상으로 한 모든 실험 프로토콜은 에르지예스 대학교 동물윤리 위원회(허가 번호 19-07-2019, 결정 번호 19/127)의 승인을 받았습니다. 이 연구에서는 Balb/c 쥐가 사용되었는데, 건강한 암컷 5마리(생후 6주 25g)와 수컷 5마리(8주 생후 30g)였습니다. 쥐는 실험동물 관리 원칙(유럽 규칙)에 따라 관리되고 관리되었습니다. 여기서 제시된 연구는 이전 연구 프로젝트에서 추출한 건강한 대조군 13명의 혈액 샘플을 사용했으며, 이 프로젝트는 에르지예스 대학교 인간윤리 위원회(결정 번호: 17/002)로부터 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 대한 그래픽 추상은 그림 1에 제공되어 있습니다. RNase 무첨가 재료와 무균 기술을 모든 단계에서 사용하여 RNA 분해를 최소화하세요.

1. 쥐 사육

  1. 안락사에 필요한 적절한 마취 용량을 결정하기 위해, 각 마우스의 무게를 재고 복막내 주사로 케타민 60 mg/kg, 자일라진을 10 mg/kg 용량으로 투여합니다.
  2. 마취 후에는 발가락 철회 반사(발가락 압박)가 없고 촉각 자극에 반응하지 않음을 통해 완전 마취를 확인한다. 마취가 확정되면 경추 탈구를 통한 안락사를 시행하세요.

2. 인간 샘플

  1. 만성 질환(예: 당뇨병, 심혈관 질환, 고혈압, 암), 급성 감염, 자가면역 또는 염증 질환, 신경학적 또는 정신과적 질환, 최근 처방약 사용 이력을 배제하기 위해 건강한 대조군으로 선정합니다17.
  2. 각 자원봉사자의 무릎 뒤쪽(슬와와)에서 2mm 펀치 도구를 사용해 피부 생검 샘플을 채취하세요. 시술 전에 국소 피하 마취를 시행하고, 모든 생검은 멸균 상태에서 수행하세요.

3. 모든 세포 유형에서 DNA/RNA 하이브리드 추출

  1. 조직 채취 및 용해
    1. 각 추출 시에는 500 μL의 심장혈, 전체 시상하부-뇌하수체 복합체, 전체 부신 또는 단일 쥐에서 채취한 정자 샘플을 사용하세요.
    2. 모든 채취된 샘플을 멸균 1.5 mL 튜브로 옮기세요. 각 튜브에 500 μL의 페놀을 추가하세요. 소용돌이 혈액 샘플을 철저히 섞어.
      1. 조직 샘플의 경우, 2mm 주사기로 완전히 균질화하여 보이는 조각이 남지 않을 때까지 진행합니다.
    3. 샘플의 완전성을 유지하기 위해 튜브를 냉각 블록 위에 올려놓으세요.
      참고: 페놀, 클로로포름, 아세트산 암모늄과 같은 유해 시약을 다룰 때는 항상 실험실 안전 지침을 준수해야 합니다.
  2. 상 분리
    1. 각 튜브에 180 μL의 클로로포름을 추가하고 잠시 소용돌이를 섞어 혼합합니다. 상이 분리될 수 있도록 튜브를 얼음 위에 15분간 배양하세요.
    2. 샘플을 검사하세요—수상이 깨끗한지 확인하세요. 위상이 흐리면 다시 소용돌이를 하고 다시 얼음으로 돌아와 5분간 더 머무르세요.
    3. 원심분리기는 12,000 × g, 4 °C에서 15분간 샘플링합니다.
  3. RNA 침전
    1. 투명한 수상을 냉각 블록 위에 놓인 새로운 무균 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 조심스럽게 옮깁니다.
    2. 수상에 같은 부피(1:1)의 이소프로판올을 넣고, 잠시 소용돌이를 섞어 얼음 위에 15분간 배양하세요.
    3. 원심분리기 온도는 12,000 × g, 4 °C에서 15분간 진행 중입니다.
      참고: RNA 펠릿은 튜브 바닥에 보여야 합니다.
  4. RNA 펠릿 세척
    1. 튜브를 조심스럽게 뒤집어 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 버리세요.
    2. 펠릿에 70% 에탄올 1.5mL를 추가하세요. 튜브를 5초간 살짝 두드려 세척하세요.
    3. 원심분리기 온도는 7,500 g, 4 °C에서 5분간 ×.
    4. 튜브를 뒤집어 상원액을 버리세요. 에탄올 세척을 2번 반복하세요(총 세 번 세척).
  5. RNA 정제
    1. 최종 에탄올 세척 후에는 튜브를 뒤집어 남은 에탄올을 자연 건조시키거나 피펫으로 조심스럽게 제거하세요.
    2. RNA 펠릿에 RNase 무첨가 물 100 μL을 추가하고, 튜브를 부드럽게 위아래로 움직이거나 튕겨 RNA를 완전히 재현지시킵니다.
      참고: 분해를 방지하기 위해 RNA 샘플은 항상 얼음이나 냉장 선반/냉각 블록에 보관하세요.
  6. RNA 정량화 및 저장
    1. 재현탁된 RNA가 담긴 튜브를 얼음 위에 올려놓으세요.
    2. 분광광도계를 사용해 RNA 농도와 순도를 측정합니다. RNA 농도를 결정하기 위해 260 nm(A260)에서 흡광도를 기록합니다. 순도를 평가하려면 A260/A280 및 A260/A230 비율을 계산합니다.
    3. 후속 응용용으로는 A260/A280 비율이 1.9에서 2.1 사이의 RNA 샘플만 사용하세요.
      참고: 본 연구에서 일반적인 RNA 농도는 100에서 180 ng/μL 사이였습니다.
    4. RNA 샘플은 추가 사용 전까지 −80 °C에 보관하세요.
  7. 단백질 제거 및 DNA 분리
    1. RNA 분리 후에는 페놀 추출 단계의 인터기를 유지합니다.
      참고: 이 단계는 간기에는 DNA가 포함되어 있어 페놀 첨가 및 원심분리 후 DNA 분리를 위해 추가 가공될 수 있기 때문에 필요합니다.
    2. DNA 추출은 3.2.1-3.4.1 단계를 따라 진행되며, 우선 중간 단계를 출발점으로 삼으세요. 페놀 추출 과정에서 DNA가 포함된 전체 간기를 냉각 랙에 보관하는 멸균된 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 조심스럽게 옮깁니다.
    3. 단백질 소화: 튜브에 0.5 mL의 용해 버퍼(20 mM Tris-HCl, pH 8.0; 100 mM EDTA; 0.1% SDS; 400 μg/mL 프로테�나제 K)를 첨가합니다. 단백질을 소화하기 위해 56°C에서 하룻밤 배양하세요.
    4. DNA의 염 침전
      1. 다음 날, 각 샘플에 5M 아세테이트 암모늄 100 μL 첨가하고 잠시 혼합합니다. 1,788 × g 에서 실온에서 20분간 원심분리기.
      2. 투명한 수용상을 새로운 무균 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 조심스럽게 옮기세요. 물상에 분자생물학용 이소프로판올(1:1 비율)을 같은 부피로 첨가하고, 부드러운 역전으로 혼합한 후 1,788 × g 에서 실온에서 10분간 원심분리합니다. DNA 알갱이를 손상시키지 않고 상청액을 버리세요.
      3. DNA 펠릿을 70% 에탄올 1mL로 세척한 후 1,788 × g 에서 원심분리기에서 10분간 가열합니다.
      4. 에탄올 워시를 제거하고 버리세요. DNA 펠릿을 잠시 공기 중에 말리게 하세요.
      5. 건조된 DNA 펠릿을 뉴클레아제 무첨가물 50 μL에 재현탁합니다.
  8. DNA를 정화하기 위해 자유 핵산을 제거하기:
    1. 용해된 DNA를 DNA 스핀 컬럼에 적재합니다. 15,000 g 에서 원심분리× 15초 동안 원심분리하고, 플로우스루를 버립니다.
    2. 컬럼을 70% 에탄올로 2번 세척하고, 15,000 × g에서 각각 1분간 원심분리합니다. 세탁 후에는 플로우스루를 버리세요.
    3. 스핀 컬럼을 깨끗한 1.5mL 채집관으로 옮깁니다. 컬럼 매트릭스에 뉴클레아제가 없는 물 30 μL를 추가하고, 실온에서 5분간 배양한 후 15,000 × g 에서 1분간 원심분리하여 DNA를 용출합니다.
    4. 용출된 DNA를 얼음 위에 올려놓으세요. 샘플을 두 개의 튜브로 나누세요: 하나는 4°C에서 DNA 저장용, 다른 하나는 이후 DNA/RNA 하이브리드 추출용입니다.
  9. DNA에 부착된 RNA 추출 (DNA/RNA 하이브리드)
    1. DNase 처리
      1. DNase I 5 μL(15 U)과 10x DNase 소화 버퍼 75 μL를 조합하여 DNase 소화 혼합물을 만듭니다.
      2. 건조된 DNA 펠릿에 DNase 혼합물 80 μL을 첨가합니다. 샘플을 실온에서 15분간 배양하세요.
    2. 페놀-클로로포름 추출
      1. 샘플에 페놀 300 μL을 첨가하고 실온에서 5분간 배양합니다.
      2. 혼합물에 클로로포름 180 μL을 추가하고 상온에서 추가로 5분간 배양합니다.
      3. 최대 속도(예: 15,000 × g)로 4°C에서 10분간 원심분리기를 사용하여 상을 분리합니다. 상부 수상(RNA:DNA 하이브리드 포함)을 조심스럽게 새 튜브로 옮기세요.
  10. DNA/RNA 하이브리드 분리
    1. 3.3단계부터 3.5.2단계까지 DNA/RNA 하이브리드 분리를 완료하세요.
    2. 수상에 같은 부피(1:1)의 이소프로판올을 넣고, 잠시 소용돌이를 섞어 얼음 위에 15분간 배양하세요.
    3. 원심분리기 온도는 12,000 × g, 4 °C에서 15분간 진행 중입니다. 튜브 바닥에 있는 RNA 펠릿을 찾아보세요. 튜브를 조심스럽게 뒤집어 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 버리세요.
    4. 펠릿에 70% 에탄올 1.5mL를 추가하세요. 튜브를 5초간 살짝 두드려 세척하세요. 원심분리기 온도는 7,500 × g, 4 °C에서 5분간 진행 중입니다. 튜브를 뒤집어 상원액을 버리세요. 에탄올 세척을 2번 반복하세요(총 세 번 세척).
  11. RNA 정제:
    1. 최종 에탄올 세척 후에는 튜브를 뒤집어 남은 에탄올을 자연 건조시키거나 피펫으로 조심스럽게 제거하세요.
    2. DNA/RNA 하이브리드 펠릿에 RNase 무첨가 물 30 μL을 추가하고, 튜브를 부드럽게 위아래로 움직이거나 튕겨 RNA를 완전히 재현탁시킵니다.
    3. DNA/RNA 하이브리드 샘플은 추가 사용 전까지 −80 °C에 보관하세요.

4. cDNA 합성

참고: RNase/DNase 없는 물질을 사용하고 시술 내내 샘플을 냉동해 보관하여 RNA, cDNA, DNA 무결성을 확인하세요.

  1. 각 샘플마다 6 μL(20 ng RNA; 자유 RNA는 3.6.5단계, DNA/RNA 하이브리드 RNA는 3.13.3단계에서 분리한 대로)를 사용한다. 필요한 양의 RNA를 표지된 PCR 튜브로 옮깁니다.
  2. 키트 제조사의 지침에 따라 cDNA 합성 마스터 믹스를 준비하세요. 각 반응마다 마스터 믹스에 역전사효소, dNTP, 프라이머, 완충제, RNase 억제제가 포함되는지 확인하세요. 각 반응마다 14 μL 마스터 믹스와 6 μL RNA 샘플을 PCR 튜브에 결합합니다(총 부피: 반응당 20 μL). 역전사효소 효소를 첨가하지 않고 동일한 RNA량을 사용하여 병행 반응을 준비하여 최소 하나의 무역전사효소(-RT) 대조군을 포함시켰습니다.
  3. 표 1에 명시된 온도 프로그램을 사용하여 열 사이클러에서 cDNA 합성을 수행합니다.
  4. 생성된 cDNA를 뉴클레아제 무첨가물로 1:5로 희석한 후 −80 °C에서 qPCR 분석할 때까지 보관합니다.

5. Q-PCR을 통한 TERRA 발현 수준 결정

  1. 제조사의 지침에 따라 SYBR Green 기반 qPCR 키트를 사용해 qPCR 반응 혼합물을 준비하세요. 각 반응마다 SYBR 그린 마스터 믹스 1 μL, TERRA용 순방향 프라이머 0 μL( 표 2 참조), 역프라이머 0 μL TERRA(b 참조), 그리고 뉴클레아제 무첨가 물 μL를 혼합합니다.
  2. 각 웰에 16 μL의 반응 혼합물을 96웰 qPCR 플레이트에 분포합니다.
  3. 각 웰에 희석된 cDNA 4 μL(Step 4.6에서 나온 것)을 추가하여 최종 반응 부피는 20 μL로 만듭니다.
    참고: 각 샘플에 대해 최소 두 개의 기술적 복제와 두 개의 생물학적 복제를 포함하세요. 오염 여부를 확인하기 위한 무틀 대조(NTC)와 RNA 유래 신호에 대한 특이성을 보장하기 위한 무역전사효소 대조군을 포함합니다.
  4. 표 3에 명시된 온도 프로그램을 사용하여 qPCR을 수행하세요.
  5. 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 TERRA 발현을 β-Actin(하우스키핑 유전자)으로 정규화합니다.

6. 텔로미어 길이 결정

  1. qPCR 혼합물을 텔로미어 길이 측정을 준비합니다. 21. 각 반응마다 SYBR 그린 마스터 믹스 1 μL, 텔로미어 순방향 프라이머 0 μL(표 2 참조), 텔로미어 역프라이머 0 μL( 표 2 참조), 그리고 뉴클레아제 무첨가 물 μL를 혼합합니다.
  2. 96웰 qPCR 플레이트의 각 웰에 텔로미어 반응 혼합물을 16 μL씩 투여합니다.
  3. 각 웰에 4 μL 유전체 DNA (Step 3.10.5에 따른 것)를 추가하여 최종 반응 부피는 20 μL가 됩니다.
  4. 제조사가 지정한 적절한 프로그램 매개변수에 따라 qPCR을 수행하세요(표 3 참조).
  5. 동행하여 동일한 농도와 최종 부피를 사용하여 단일 참조 유전자(36B4)에 대한 반응을 설정합니다.
  6. 표준 곡선은 합성 텔로머 올리고뉴클레오타이드의 연속 희석을 사용하여 상대적 풍부도와 증폭 효율을 추정하였습니다(표 2). 절대적인 수치화는 수행되지 않았습니다. 상대 텔로미어 길이는 ΔCt 방법21을 사용하여 T/S 비율(텔로미어 반복 복제 수에서 단일 복제 유전자 수에 대비)으로 계산됩니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에서는 여러 마우스 조직(혈액, 정자, 피부, 시상하부, 뇌하수체, 부신)과 인간 혈액 및 피부 샘플에서 자유 TERRA, DNA/RNA 하이브리드 TERRA, 텔로미어 길이의 수준을 정량 및 비교하여 조직 특이적 역학과 텔로미어 생물학과의 관계를 조사하였습니다. 페놀-클로로포름 추출(프로토콜 단계 3.6.1-3.6.5) 후 수상에서 자유 TERRA를 분리하여, 크로마틴이나 DNA와 연관되지 않은 TERRA 분자를 포함한 세포질 및 핵소질RNA를 농축하였습니다. 텔로미어에서 DNA/RNA 하이브리드에 관여하는 TERRA를 대표하는 하이브리드 TERRA는 DNase I 처리 후 간기 분획에서 분리되어 텔로머 DNA와 안정적으로 연관된 TERRA만 회복되도록 했습니다.

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서 제시된 프로토콜의 핵심 강점은 복잡한 조직 샘플에서 자유 TERRA 및 DNA/RNA 하이브리드 TERRA를 단계별로 추출하고 구별하는 데 있습니다. 중요한 단계에는 페놀-클로로포름 추출 중 수성 및 간기 분획을 신중히 분리하는 것이 포함되며, 교차 오염은 자유 TERRA와 하이브리드 TERRA의 구분을 혼동시킬 수 있습니다. 이후 간기 분획에 대한 DNase I 처리도 매우 중요합니다. 소화가 부족하면 DNA 결합 RNA가 접근하기 어려워질 수 있고, 과소화는 하이브리드를 분해할 위험이 있습니다. RNase H 처리와 같은 검증된 하이브리드 특이적 효소 대조군과 qPCR용 프라이머 세트의 사용은 분획 특이성을 확인하고 인공물을 피하는 데 필수적입니다22,23. qPCR에 의한 텔로미어 길이의 정확한 측정은 분리된 DNA의 품질과 순도, 그리고 단일 복제 유...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 TYL-2019-9224 및 TSA-2022-11929 연구비 번호로 이 연구를 지원해 준 에르지예스 대학교 과학연구부에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2 mL PCR 튜브 및 nbsp;그라이너671201
15 mL 팔콘 튜브아이솔랩078.02.001
2 mL 주사기하야트해당 없음
96- 멀티웰 플레이트그라이너50-720-3203
절대 에탄올머크1070172511
아모늄 아세테이트시그마238074-500G
cDNA 합성 키트로슈07 912 439 001
클로로포름머크1024451000
DNAse I Kit  자이모E1010
EDTA시그마E9884-1KG
유리병아이솔랩LB. IS.061.01.901
눈금식 실린더아이솔랩그리고 nbsp; 015.01.901
구아니딘 이소티오시아네이트 시그마G9277-100G
등프로필머크1096342511
라이트 사이클러 480 II로슈5015278001
마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 mL)그라이너616201
마이크로피펫(10 및 마이크로; L)길슨FD10001
마이크로피펫(100 및 마이크로; L)길슨FD10004
마이크로피펫(1000 및 마이크로; L)길슨FD10003
마이크로피펫(2 및 마이크로; L)길슨GFAM00064
나노드롭시마즈C101-E112
PBS 태블릿시그마P4417-50TAB
PCR 장치센소퀘스트T3-0140
PGL3 기본 벡터프로메가 #212936
피펫 팁 (10 & 마이크로; L, 200 및 마이크로; L, 1000 및 마이크로; L)그라이너772352
플라스틱 페트리 접시그라이너627102
프로테인나제 K시그마P6556-10MG
SDS시그마8170342500
혈청학적 피펫그라이너760107
스핀길슨PMC880
시브르 그린 마스터로슈4707516001
열믹서에펜도르프#5355
트리즈마 기지시그마1503-1KG  그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp;
트리졸바이오라드7326890
유니맥스 1010 DT 셰이커하이돌프543-12310-00-6
소용돌이하이돌프541-10000-00-1
자이모-스핀 I 컬럼자이모C1003-50

참고문헌

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