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방법 논문

말 혈액에서 혈소판이 풍부한 혈장을 얻는 간단한 이중 원심분리관 방법

2.4K 조회수

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DOI:

10.3791/67985

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2025년 8월 15일

 ,  , 
1Grupo de Investigación Terapia Regenerativa, Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, 2Grupo de Investigación Patología Clínica Veterinaria, Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, 3Grupo de Investigación DICOVI, Departamento de Diseño, Universidad de Caldas

이 논문에서

요약

혈소판 풍부 혈장(PRP)은 말 근골격계 질환의 치료에 사용됩니다. 다양한 기술은 다양한 혈소판 및 백혈구 농도로 PRP를 생성합니다. 이 기사에서는 말의 혈액에서 PRP를 얻는 방법에 대해 설명합니다.

초록

혈소판 풍부 혈장(PRP)은 골관절염, 건병증, 체세포병증과 같은 말의 만성 근골격계 질환에 대한 일상적인 치료법으로 널리 활용됩니다. 이러한 효과는 내인성 또는 외인성 활성화에 관계없이 이 정형생물학적 제제의 활성화 시 방출되는 고농도의 성장 인자와 항염증 사이토카인에서 비롯됩니다. 인기가 높아지고 있음에도 불구하고 말에서 PRP를 얻는 기술을 보여주는 교육용 비디오가 눈에 띄게 부족합니다.

이 연구는 말에서 PRP를 얻기 위한 이중 원심분리 튜브 방법을 조사합니다. 6마리의 말의 전혈을 구연산나트륨 튜브에 채취하여 120× g 에서 5분, 240×g에서 5 분 동안 두 번 원심분리했습니다. PRP의 평균 혈소판 농도는 103/μL× 360.95 ± 56.31 혈소판(PLT)이었고, 평균 백혈구 농도는 103/μL× 3.53 세포 3.05 ±이었습니다. PRP의 혈소판 수는 전혈보다 2.41배 더 높은 반면, PRP의 백혈구 농도는 0.44배 낮았습니다. PRP에서 PLT에 대한 수집 효율은 17%였고, PRP에서 백혈구에 대한 수집 효율은 3.1%였습니다. PRP에서 형질전환 성장 인자 베타 1 및 혈소판 유래 성장 인자 BB의 평균 농도는 각각 2601.82(95% 신뢰 구간(CI): 2358.88-2844.76) pg/mL 및 1208.05(95% CI: 1051.09-1365.02) pg/mL였습니다. 이러한 결과는 말 의사가 사용하기에 적합한 간단하고 비용 효율적인 방법을 통해 PRP를 효율적이고 재현 가능하게 얻을 수 있음을 나타냅니다.

서론

혈소판 풍부 혈장(PRP)은 건병증, 체염병증, 골관절염 및 후궁염과 같은 만성 말 근골격계 질환을 치료하는 데 일반적으로 사용되는 정형생물학적 제품입니다 1,2,3. 사지 상처 및 안구 표면 질환 치료에도 효과적입니다 4,5. 사용의 근거는 주로 혈소판에 의해 방출되는 고농도의 성장 인자(GF)를 기반으로 합니다6. 백혈구는 또한 조절 및 항염증 사이토카인을 방출함으로써 기여합니다7. 형질전환 성장 인자 베타 1(TGF-β1) 및 혈소판 유래 성장 인자 BB(PDGF-BB)와 같은 GF는 강력한 동화 작용, 증식, 혈관신생 및 항염증 효과를 발휘합니다8. 외인성 또는 내인성 활성화 시 PRP는 혈소판이 풍부한 겔로 중합되어 세포 수송, 고정 및 분화를 촉진합니다 6,9. 이러한 방식으로 PRP는 GF 및 사이토카인을 위한 용기뿐만 아니라 복잡한 살아있는 스캐폴드 역할을 합니다10.

여러 시스템은 인간과 말 모두에게 사용되는 PRP 제품을 분류합니다 6,11,12. 가장 간단하고 일반적인 시스템 중 하나는 백혈구 농도를 기준으로 이러한 혈액 성분을 분류합니다11,12. 이 분류에 따르면, 말의 전혈 수치에 비해 백혈구 농도가 낮거나 무시할 수 있고 혈소판 농도가 낮거나 중간 정도인 PRP 제품을 순수 PRP(P-PRP)6,11,12라고 합니다. 대조적으로, 검출 가능한 백혈구 농도에서 높은 혈소판 농도와 중간 내지 높은 혈소판 농도를 갖는 PRP 제품을 백혈구 및 혈소판 풍부 혈장(L-PRP)이라고 합니다6,11,12.

P-PRP 제품은 일반적으로 구연산나트륨 및 구연산염, 인산염 및 포도당과 같은 항응고제가 들어 있는 튜브에 말로부터 전혈을 채취하는 튜브 간 원심분리에 의해 얻어집니다13. 혈액을 두 번 원심분리하여 혈소판을 다른 성분으로부터 분리합니다14. 대조적으로, L-PRP 제품은 주로 인간 혈액용으로 설계된 반자동 키트를 사용하여 준비되며, 그 중 일부는 말에 사용하도록 검증되었습니다 6,15. 이러한 반자동 키트는 일반적으로 특수 원심분리기가 필요하고 비용이 더 높을 뿐만 아니라 무균 처리에 대한 잠재적인 우려가 있어 임상 환경에서의 실제 사용을 복잡하게 만들 수 있습니다17. 또한, 이러한 키트는 과도한 백혈구 또는 적혈구의 원치 않는 농도를 초래할 수 있으며, 이는 특정 임상 상황에서 해로울 수 있습니다18. 예를 들어, 증가된 백혈구 수는 과도한 염증을 유발할 수 있으며, 과잉 적혈구는 치유 과정을 방해하거나 조직 자극 또는 거부반응과 같은 합병증을 유발할 수 있습니다15; 그러나 말 L-PRP를 생산하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 특수 장비를 필요로 하지 않는 중력 과정을 포함한다19.

이러한 한계에 비추어 볼 때, PRP 준비를 위한 더 간단하고 비용 효율적인 대안이 매우 바람직합니다. 다양한 시험관 내 연구, 근골격계 질환의 실험 모델 및 말 관찰에 따르면 P-PRP 및 L-PRP 제품 모두 처리된 세포와 조직에 유익한 효과가 있는 것으로 나타났습니다 1,2,20. 이러한 제품은 치유를 촉진하고 염증을 줄이며 조직 재생을 향상시킵니다6. 그러나 말을 치료하기 위해 P-PRP 또는 L-PRP를 사용하기로 한 결정은 기술적, 경제적 요인의 영향을 받을 수 있습니다.

저자에 따르면, 말 혈액에서 PRP 제품을 얻기 위해 널리 검증된 단계별 절차를 설명하고 완전히 입증하는 발표된 연구는 없습니다. 이 기사에서는 말로부터 전혈을 안전하게 채취하고 실험 및 임상 용도 모두에 적합한 PRP 제품을 생산하는 데 필요한 절차를 간략하게 설명합니다. 또한 혈소판 및 백혈구의 정량화와 치료 효과에 필수적인 TGF-β1 및 PDGF-BB의 농도 측정에 의한 이 정형생물학적 검증도 포함됩니다. 이 연구는 프로세스를 표준화하고 제품의 효능을 입증함으로써 말 의사가 자신감 있고 정확하게 PRP를 준비할 수 있는 신뢰할 수 있고 접근 가능한 방법을 제공하고자 합니다.

말 PRP를 생산하기 위한 이중 원심분리 방법은 2006년 Argüelles et al.14 에 의해 처음 기술되었지만, 프로토콜이 비디오로 완전히 제시된 것은 이번이 처음입니다. 이 비디오는 근골격계 질환이 있는 말을 위해 보다 정교하고 값비싼 PRP 키트를 사용할 수 없는 기술적 한계와 예산 제약에 직면한 말 실무자를 위한 실용적인 리소스 역할을 하기 위한 것입니다.

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프로토콜

이 연구는 콜롬비아 마니살레스에 있는 Universidad de Caldas의 수의학 교육 병원에서 말의 PRP 준비 및 사용에 대한 내부 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 연구는 우리 기관에서 임상적으로 치료받은 절름발이 말로부터 데이터를 얻었기 때문에 내부 동물 관리 위원회의 승인이 필요하지 않았습니다. 평균 연령이 7.4세(± 2.6)세인 콜롬비아 크리올 말 6마리, 암말 3마리, 겔딩 3마리의 데이터를 사용하여 이 프로토콜을 개발했습니다. 말의 소유자는 연구의 성격에 대해 통보를 받고 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다. 연구에 포함된 모든 말은 치료 중인 근골격계 문제를 제외하고 임상적으로 건강했습니다. 기초 혈소판 수가 100 × 103/mL 전혈을 초과하는 동물만 포함되었습니다. 혈소판 농도가 낮은 말은 혈소판 감소증으로 간주될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다14. 또한, 이 동물들은 말 종에 대해 정상 범위 내의 정상 혈구 수, 간 및 신장 임상 생화학 매개변수, 소변 분석 값을 나타냈습니다.

1. 말 제한 및 피부 소독

  1. 말과 수의사 모두의 안전을 위해 동물의 행동에 따라 말(Eqqus caballus)을 임상 검사 슈트 또는 굴레(그림 1A)에 안전하게 구속하십시오. 그런 다음 전기 면도기로 목 한쪽 중간 3분의 1의 경정맥 위에 5cm x 5cm 크기의 머리카락을 끼웁니다.
    알림: 일부 소유자는 말이 잘리지 않는 것을 선호합니다. 한 연구에 따르면 P-PRP21의 박테리아 오염을 방지하기 위해 정맥 천자 부위의 머리카락 깎기가 필요하지 않습니다. 따라서 이 절차는 수의사의 재량에 따릅니다.
  2. 경정맥의 잘린 부위에 약 3분 동안 비멸균 거즈와 장갑을 사용하여 최소 10cm 동안 예비 비멸균 피부 준비를 수행합니다. 방부제 폼에 적신 거즈 여러 장을 원형 패턴으로 바릅니다(그림 1B).
  3. 멸균 장갑과 소독제에 적신 거즈를 모두 사용하여 정맥 천자 부위를 무균적으로 준비합니다. 목 부위의 피부를 약 5분 동안 원을 그리며 문지릅니다. 95% 에틸 알코올에 적신 멸균 거즈로 해당 부위를 청소하십시오.

2. 무균 채혈

  1. 95% 에틸 알코올에 적신 거즈로 미리 세척한 16mL 구연산나트륨 튜브 16개를 깨끗한 플라스틱 선반에 놓습니다. 진공관의 고무 캡에 95% 에틸 알코올, 특히 니들 커플링의 홈에 함침시킵니다.
    참고: 일반적으로 2.5mL의 PRP를 얻으려면 8개의 4.5mL 구연산나트륨 튜브가 필요합니다. 특정 경우에 사용되는 튜브의 수는 치료되는 연조직 또는 특정 관절에 따라 다릅니다.
  2. 소독된 경정맥 부위에 나비 바늘을 멸균 상태로 삽입하고(그림 2A) 4.5mL 구연산나트륨 튜브를 홀더에 부착합니다(그림 2B). 튜브를 부드럽게 흔들어 플라스틱 랙에 놓습니다.
    참고: 4.5mL 구연산나트륨 튜브는 자동 헤모그램 및 경회전 원심분리 후 혈장을 준비하는 데 사용됩니다. 그런 다음 이 혈장을 PRP와의 성장 인자 및 사이토카인 농축 비교를 위한 음성 대조군으로 사용됩니다.

3. 혈소판 풍부 혈장 조달

  1. 전혈이 들어 있는 4.5mL 구연산나트륨 튜브를 벤치 원심분리기에서 90° 각도로 4개 스윙 아웃 로터에 넣습니다. 튜브를 실온에서 5 분 동안 120×g으로 원심분리합니다. 원심분리 후, 구연산염 혈액이 들어 있는 4.5mL 튜브와 추가로 10mL 일반 튜브 2개를 랙에 놓고 랙을 멸균 불투과성 드레이프 위의 클래스 II 층류 후드 내부의 작업자의 주로 사용하지 않는 손에 놓습니다.
    참고: 한 연구에 따르면 클래스 II 층류 후드는 PRP 조달 중 박테리아 오염을 방지하는 데 필수적이지 않습니다21. 대신 PRP는 기류와 먼지가 없는 클린룸에서 준비할 수 있습니다. 이 시나리오에서는 혈액 튜브 랙을 멸균되고 불침투성 드레이프로 덮인 테이블 위에 놓을 수 있습니다.
  2. 첫 번째 원심분리: 안면 마스크와 멸균 장갑을 착용하고 층류 후드 내부의 주로 사용하는 손 쪽에 멸균 바늘(21G 5/8")과 결합된 10mL 멸균 루어 주사기를 놓습니다.
    알림: 이 순간부터 장갑을 낀 주로 사용하는 손은 항상 멸균 상태를 유지하며 구연산나트륨 튜브의 고무 캡은 장갑을 낀 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 제거해야 합니다.
  3. 버피 코트 위 3mm 떨어진 각 원심분리된 구연산 혈액 튜브에 멸균 바늘을 삽입하고(그림 3A) 혈장 분획의 50%를 부드럽게 흡인하여 유체 난류 및 혈액 흡인을 피합니다. 4개의 4.5mL 튜브에서 10mL의 혈장을 흡인한 후 5-10mL 멸균 일반 튜브에 분배합니다(그림 3B).
    알림: 주로 사용하지 않는 손으로 이 튜브의 고무 캡을 제거하고 드레이프의 멸균 부위 위에 놓거나 박테리아 오염을 방지하기 위해 잡으십시오.
  4. 두 번째 원심분리: 고무 마개로 튜브를 다시 닫고 벤치탑 원심분리기에서 90° 각도로 4개 스윙 아웃 로터에 평형 상태로 놓고 이 튜브를 실온에서 5분 동안 240 × g 으로 회전시킵니다.
    참고: 상대 원심분리력(RCF 또는 g)의 선택은 말 혈액에서 PRP를 얻기 위한 이 방법을 처음 설명한 중요한 연구14 를 기반으로 합니다. 또한, 이 방법은 다른 저자에 의해 재현성에 대해 평가되었습니다22.
  5. 튜브를 랙에 놓고 이전에 놓인 멸균 불투과성 드레이프 위에 클래스 II 층류 후드 내부의 비우세한 쪽에 배치합니다.
  6. 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 고무 캡을 제거하고 멸균 주로 사용하는 손을 사용하여 10mL 멸균 루어 주사기에 부착된 18G, 90mm 척추 바늘을 사용하여 혈장의 처음 75%를 천천히 흡인합니다(그림 3C). 이 주사기는 혈소판 부족 혈장(PPP)을 포함하므로 폐기하거나 다른 실험 또는 임상 용도로 남겨두십시오. 다음으로, 이전에 사용한 멸균 척추 바늘을 5 또는 10 mL 멸균 루어 주사기에 부착하여 5-10 mL 멸균 일반 튜브에서 남은 혈장(25%)을 흡인합니다. 이 분획을 P-PRP라고 합니다(그림 3D).
    참고: 특정 임상 및 실험 조건에서 0.5-1mL의 PRP의 분취량을 자동 헤모그램에 사용한 후 효소 결합 면역흡착 분석에 의한 성장 인자(TGF-β1 및 PDGF-BB) 분석에 사용됩니다. 이들 매개체의 측정은 칼슘염 또는 트롬빈23 으로 P-PRP를 활성화한 후 3시간 후에 또는 온도 변화 또는 비이온성 세제24의 첨가에 의해 세포 손상을 유도한 후에 수행될 수 있다.
  7. 정형생물학적 제품의 박테리아 오염을 방지하기 위해 PRP가 포함된 멸균 루어 주사기를 부착된 멸균 바늘 또는 캡이 있는 작은 불투과성 멸균 드레이프에 감쌉니다(그림 4A).
    참고: 치료할 말의 해부학적 구조는 이 프로토콜의 섹션 1에 설명된 대로 무균 주입을 위해 준비되어야 합니다. 말은 불편함을 최소화하고 말과 수의사 모두의 안전을 보장하기 위해 적절하게 구속되고 진정되어야 합니다. PRP 제품은 멸균 장갑과 바늘을 사용하여 취급해야 하며 의사의 선호도에 따라 활성화될 수도 있고 활성화되지 않을 수도 있습니다(그림 4B).

4. 통계 분석

  1. 전혈 및 PRP의 혈소판 및 백혈구 수에 대한 데이터를 수집합니다. Kolmogorov-Smirnov 테스트를 사용하여 정규성에 대한 데이터를 평가합니다. 데이터가 정규 분포(P > 0.05)인 경우 t-테스트를 사용하여 세포 데이터를 비교하고 분석합니다. 혈소판 및 백혈구 농도 데이터가 정규 분포가 아닌 경우(P < 0.05) Wilcoxon 테스트를 사용하여 데이터를 비교하고 분석합니다.
  2. 다음 공식25에 따라 P-PRP의 혈소판 및 백혈구 효율 농도를 결정합니다.
    혈소판 수집 효율 = figure-protocol-1 × 100
    백혈구 수집 효율 = figure-protocol-2 × 100
  3. 혈장(음성 대조군) PRP 상청액(글루콘산칼슘으로 활성화 3시간 후) 및 비이온성 세제 용액을 첨가하여 얻은 PRP 용해물에서 TGF-β1 및 PDGF-BB 농도에서 데이터를 수집합니다.
  4. 일반화된 선형 혼합 모델을 사용하여 혈장, PRP 상청액 및 PRP 용해물 간의 성장 인자 농도를 비교합니다. 유의미한 통계적 차이가 있는 경우 Tukey의 사후 테스트를 적용합니다.
  5. 모든 검정에 대해 통계적으로 유의한 0.05 값< p 를 고려합니다.

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결과

평균 혈소판 수(혈소판 × 103/μL)는 전혈보다 PRP에서 유의하게 높았습니다(p < 0.001). 대조적으로, PRP의 평균 백혈구 농도(백혈구 × 103/μL)는 전혈의 백혈구 농도(p < 0.001)보다 유의하게 낮았습니다(표 1). 구체적으로, PRP의 혈소판 수는 전혈보다 2.41배 더 높은 반면, PRP의 백혈구 농도는 0.44배 낮았습니다. PRP에서 PLT에 대한 수집 효율은 17%인 반면, PRP에서 백혈구 수집 효율은 3.1%였습니다.

TGF-β1 농도는 혈장, PRP 상청액 및 PRP 용해물 간에 유의한(p < 0.001) 차이가 있었으며, PRP 용해물의 농도가 가장 높았고, PRP 상청액과 혈장이 그 뒤를 이었습니다(그림 5A). 한편, PDGF-BB 농도는 혈장에 비해 PRP 상청액 및 PRP ...

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토론

만성 근골격계 질환 치료를 위한 인간 및 수의학에서 PRP의 사용이 증가하고 있습니다 1,8,26,27. 그러나 실험 및 임상 환경에서 PRP 적용에 대한 주요 비판은 이러한 혈액 성분을 준비하는 데 사용되는 기술 및 프로토콜에 대한 기본 데이터가 부족하다는 것입니다28. 또한, 최종 PRP 생성물의 세포 구성, 특히 혈소판 및 백혈구의 농도 및 성장 인자 함량에 대한 정보가 불충분하다28,29.

이러한 맥락에서 우리는 시험관 내<...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 기사를 출판할 수 있도록 재정 지원을 해주신 콜롬비아 마니살레스 칼다스 대학의 Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10mL 일반 정맥 채혈 튜브 BD Vacutainer, 프랭클린 레이크스, 뉴저지, 미국참조 번호 366430이것은 단지 예일 뿐이며 다른 브랜드의 튜브를 사용할 수 있습니다.
4.5mL 구연산나트륨 튜브(105M/3. 2%) BD Vacutainer, 프랭클린 레이크스, 뉴저지, 미국107451이것은 단지 예일 뿐이며 다른 브랜드의 튜브를 사용할 수 있습니다.
벤치 원심분리기Rotofix 32A, Hettich GmbH, 투틀링겐, 독일다른 벤치 원심분리기를 사용할 수 있습니다.
버터플라이 바늘(21G &0.75인치), 12인치. 튜빙 및 사전 부착 홀더&NBSP;Safety-Lok 채혈 세트, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, 미국참조 367296이것은 단지 예일 뿐이며 다른 브랜드의 나비 바늘을 사용할 수 있습니다.
2.3-4% 의 클로르헥시딘 폼 용액;이러한 제품의 브랜드 또는 상표명은 국가마다 다를 수 있습니다.
클래스 II 층류 후드Thermo Fischer Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬다른 클래스 II 층류 후드를 사용할 수 있습니다.
ELISA 판독기Thermo Fischer Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬
에틸 알코올 95%이러한 제품의 브랜드 또는 상표명은 국가마다 다를 수 있습니다.
인간 PDGF-BB 듀오셋 ELISAR& D Systems, Inc, 미국 미네소타주 맥킨리 플레이스디220
인간 TGF-베타 1 DouSet ELISAR& D Systems, Inc, 미국 미네소타주 맥킨리 플레이스디240
4-10% 의 포비돈 요오드 폼 용액;이러한 제품의 브랜드 또는 상표명은 국가마다 다를 수 있습니다.
SPSS 25.0 소프트웨어IBM Corp, SPSS, NY, USA
다양한 부피의 멸균 루어 주사기 Discardit Syringe, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, 미국이것은 단지 예일 뿐이며 다른 브랜드의 주사기를 사용할 수 있습니다.
멸균 척추 바늘(18G &x; 90mm) BD Quincke 스피넬 바늘, 프랭클린 레이크스, 뉴저지, 미국이것은 단지 예일 뿐이며 다른 브랜드의 척추 바늘을 사용할 수 있습니다.

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