우리는 원발성 신근위세뇨관 상피 세포를 분리 및 배양하기 위해 전체 인간 신장을 처리하기 위한 최적화된 프로토콜과 이러한 세포를 3차원, 미세유체, 미세생리학적 플랫폼에서 적용하여 신장 근위세뇨관을 재현하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다.
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방법 논문
1차 인간 근위세뇨관 상피 세포의 분리 및 신장 근위세뇨관의 미세생리학적 모델 생성에 사용
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
신장 질환은 3,700만 명의 미국인을 포함하여 전 세계적으로 8억 5,000만 명 이상의 사람들에게 영향을 미칩니다. 만성 신장 질환의 위험 요인에는 환경적 영향, 유전적 소인, 공존하는 의학적 상태, 급성 신장 손상 병력 등이 있습니다. 이러한 요인은 개발되는 데 종종 몇 달 또는 몇 년이 걸리기 때문에 질병 병인학 및 병태생리학에 대한 종단 연구를 복잡하게 만듭니다. 질병 메커니즘에 대한 이해를 높이고 약물 개발에서 신독성 예측을 향상시키기 위해서는 고급 신장 모델이 필요합니다. 신장의 근위세뇨관 상피세포(PTEC)는 생체이물 및 독소 제거뿐만 아니라 필수 영양소의 재흡수에 중요한 역할을 합니다. 우리는 이전에 분리된 1차 PTEC로 채워진 3차원(3D) 미세생리학적 시스템(MPS) 플랫폼을 사용하여 신장 약물 상호 작용을 조사하고, 화합물의 신독성을 평가하고, 약물 제거를 예측할 수 있음을 입증했습니다. 여기에서는 전체 인간 신장에서 1차 PTEC를 분리 및 배양하고 생체 내 신장 생리학을 모방한 3D MPS 플랫폼에 파종하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 최대 6개월 동안 MPS 장치에서 주요 수송 단백질의 PTEC 생존력, 생리학적 형태 및 기능적 분극을 지원하는 장기 연구를 가능하게 합니다.
서론
신장은 신체에서 다양한 생체이물, 독소 및 내인성 화합물을 제거하고 제거하는 데 중요한 역할을 합니다. 이는 혈액을 여과하여 노폐물을 제거하고 전해질 균형, 체액 수준 및 pH를 조절함으로써 달성됩니다. 인간의 각 신장에는 약 100만 개의 네프론이 포함되어 있는데, 네프론은 신장의 구조적, 기능적 단위이다1. 이 네프론 내에서 근위세뇨관 상피세포(PTEC)로 알려진 근위세뇨관의 특수 상피 세포는 포도당, 아미노산 및 이온과 같은 필수 분자를 재흡수하고 약물 기질 및 잠재적인 독성 물질을 소변으로 분비하는 역할을 합니다 2,3,4. 어떤 경우에는 PTEC가 소변의 화합물을 혈류로 다시 재흡수할 수도 있습니다4. 약물 및 독소 상호 작용에서 중요한 역할을 하기 때문에 인간의 신장에서 분리된 1차 PTEC는 신장 약물-약물 상호 작용(DDI)을 연구하고 화합물의 신독성을 평가하는 데 유용한 도구를 제공합니다.
약물 유발 신독성은 급성 신....
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프로토콜
모든 작업은 워싱턴 대학교의 인체 조직 취급 지침에 따라 수행되었습니다. 적합한 기증자는 다음 요구 사항을 충족합니다: 한허혈 시간(CIT)이 36시간 미만이어야 하며, 신장 질환, 투석 또는 기타 의학적 상태(예: 당뇨병 1형 또는 2형 당뇨병, B형 간염, C형 간염, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 바이러스성/세균성 뇌수막염, 메티실린 내성 황색포도상구균 감염, 매독, 패혈증 또는 코로나19). 이 연구에 사용된 전체 인간 신장은 UNOS가 승인한 OPO를 통해 공급되었습니다.
1. 생물 안전 캐비닛 준비
- 후드에 70% 에탄올을 뿌립니다. 캐비닛 내부의 모든 표면과 품목의 오염을 제거하여 멸균 환경을 조성하십시오.
- 파란색 흡수 패드를 깔아주세요. 이 패드 위에 모든 조직 작업을 수행하십시오.
- 생물 안전 캐비닛에 필요한 장비를 사용할 수 있고 적절하게 멸균되었는지 확인합니다(면도날, 혈청학적 피펫 팁, 혈청학적 피펫 건, 100μm 세포 여과기, p1000 팁, 1000μL 마이크로피펫, 15cm 원형 배양 접시 및 원뿔형 튜브).
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결과
2D 배양에서 시간 경과에 따른 고립된 1차 PTEC의 형태 및 포화도
신장 피질에서 분리된 후, PTEC는 첫 번째 배지 변경 전에 최소 48시간 동안 방해받지 않고 성장할 수 있었습니다. 세포를 배양한 후 약 일주일 후에 배양 플라스크 전체에 걸쳐 균일한 상피, 조약돌 같은 형태를 가진 작은 배치의 PTEC가 나타나야 합니다(그림 1A, B). 다른 공여자의 PTEC의 성장 속도에 따라 세포 밀도는 배양 10일 후(평균적으로) 약 50%-60%에 도달해야 합니다(그림 1C). 배양에서 약 14일이 지나면 세포가 완전한 포화도에 도달해야 하며(그림 1D) MPS 장치에서 계대배양, 동결 보존 또는 파종할 준비가 됩니다. 평균적으로 인간의 신장 .......
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토론
MPS(Organ-on-a-Chip) 기술은 인체 생리학의 주요 측면을 요약할 수 있는 관련성이 높은 체외 플랫폼을 제공하여 약물 개발 및 독성 평가에서 동물 모델에 대한 의존도를 줄입니다. 최근 FDA 현대화법 2.0(2022)은 임상시험용 신약 신청에 다른 대안 중에서 MPS를 포함할 수 있도록 허용했습니다29. 이 프로토콜은 인간 근위세뇨관 기능을 모델링하고 생체이물이물(xenobiotics)에 대한 신장 독성학적 반응을 평가하는 것을 목표로 인간 기증자 피질 조직에서 PTEC를 해리하고 MPS 플랫폼에서의 후속 사용을 위한 표준 운영 절차를 자세히 설명합니다(그림 2).
높은 PTEC 생존력을 유지하기 위한 중요한 요소는 온열 허혈 시간(WIT)을 최소화하는 것입니다. WIT가 1시간 미만인 신장을 사.......
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공개 사항
저자는 이 연구와 관련된 이해 상충이나 재무 공개가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업의 일부는 NASA 계약 80ARC023CA001, NCATS(National Center for Advancing Translational Sciences)(U2CTR004867, UH3TR000504, UG3TR002158), NCATS와 CASIS(Center for the Advancement of Science in Space)(UG3TR002178), NIEHS(National Institute of Environmental Health Sciences)(P30ES00703), National Institute of General Medical Sciences(T32GM007750)의 지원을 받았으며, Northwest Kidney Centers가 Kidney Research에 제공한 무제한 기부 연구소 및 워싱턴 대학교 약학 대학(Ji-Ping Wang Award 및 Bradley Fellowship).
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참고문헌
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatr Nephrol. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Zhang, X., et al. Tubular secretion of creatinine and kidney function: an observational stu....
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재인쇄 및 허가
