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방법 논문

1차 인간 근위세뇨관 상피 세포의 분리 및 신장 근위세뇨관의 미세생리학적 모델 생성에 사용

1.6K 조회수

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DOI:

10.3791/67997

⸱

2025년 5월 9일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy, University of Washington, 2Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Washington, 3Kidney Research Institute, Division of Nephrology, Department of Medicine, University of Washington, 4Barbara T. Murphy Division of Nephrology, Samuel Bronfman Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 원발성 신근위세뇨관 상피 세포를 분리 및 배양하기 위해 전체 인간 신장을 처리하기 위한 최적화된 프로토콜과 이러한 세포를 3차원, 미세유체, 미세생리학적 플랫폼에서 적용하여 신장 근위세뇨관을 재현하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

초록

신장 질환은 3,700만 명의 미국인을 포함하여 전 세계적으로 8억 5,000만 명 이상의 사람들에게 영향을 미칩니다. 만성 신장 질환의 위험 요인에는 환경적 영향, 유전적 소인, 공존하는 의학적 상태, 급성 신장 손상 병력 등이 있습니다. 이러한 요인은 개발되는 데 종종 몇 달 또는 몇 년이 걸리기 때문에 질병 병인학 및 병태생리학에 대한 종단 연구를 복잡하게 만듭니다. 질병 메커니즘에 대한 이해를 높이고 약물 개발에서 신독성 예측을 향상시키기 위해서는 고급 신장 모델이 필요합니다. 신장의 근위세뇨관 상피세포(PTEC)는 생체이물 및 독소 제거뿐만 아니라 필수 영양소의 재흡수에 중요한 역할을 합니다. 우리는 이전에 분리된 1차 PTEC로 채워진 3차원(3D) 미세생리학적 시스템(MPS) 플랫폼을 사용하여 신장 약물 상호 작용을 조사하고, 화합물의 신독성을 평가하고, 약물 제거를 예측할 수 있음을 입증했습니다. 여기에서는 전체 인간 신장에서 1차 PTEC를 분리 및 배양하고 생체 내 신장 생리학을 모방한 3D MPS 플랫폼에 파종하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 최대 6개월 동안 MPS 장치에서 주요 수송 단백질의 PTEC 생존력, 생리학적 형태 및 기능적 분극을 지원하는 장기 연구를 가능하게 합니다.

서론

신장은 신체에서 다양한 생체이물, 독소 및 내인성 화합물을 제거하고 제거하는 데 중요한 역할을 합니다. 이는 혈액을 여과하여 노폐물을 제거하고 전해질 균형, 체액 수준 및 pH를 조절함으로써 달성됩니다. 인간의 각 신장에는 약 100만 개의 네프론이 포함되어 있는데, 네프론은 신장의 구조적, 기능적 단위이다1. 이 네프론 내에서 근위세뇨관 상피세포(PTEC)로 알려진 근위세뇨관의 특수 상피 세포는 포도당, 아미노산 및 이온과 같은 필수 분자를 재흡수하고 약물 기질 및 잠재적인 독성 물질을 소변으로 분비하는 역할을 합니다 2,3,4. 어떤 경우에는 PTEC가 소변의 화합물을 혈류로 다시 재흡수할 수도 있습니다4. 약물 및 독소 상호 작용에서 중요한 역할을 하기 때문에 인간의 신장에서 분리된 1차 PTEC는 신장 약물-약물 상호 작용(DDI)을 연구하고 화합물의 신독성을 평가하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

약물 유발 신독성은 급성 신장 손상 및 만성 신장 질환을 유발할 수 있기 때문에 임상적으로 심각한 문제를 야기한다5. 따라서 신장 근위세뇨관 생리학에 대한 더 깊은 이해는 약물 및 독소의 신독성 가능성을 정확하게 예측하고 특성화하는 데 필수적입니다. 불멸화된 신세포주(예: RPTEC-TERT1, HK-2)를 포함한 전통적인 in vitro 모델은 in vivo 7,8 에서 동적인 층류(낮은 레이놀즈 수) 및 균일한 세포외 기질(ECM)에서 작동하는 인간 근위세뇨관6의 복잡한 구조와 기능을 모방하는 데 한계가 있습니다. 또한, 기존의 2차원(2D) 모델은 이러한 단백질의 급격한 분해 및 내재화로 인해 주요 신장 수송체(예: 유기 음이온 수송체 1 및 3(OAT1 및 OAT3), 유기 양이온 수송체 2(OCT2))를 기능적으로 발현하지 못하는 경우가 많습니다 6,9,10,11 . 동물 모델은 유익하기는 하지만 인간의 신장 생리학을 완전히 복제하지 못할 수 있으며, 수송체 발현과 활동의 종 차이로 인해 번역 가능성이 부족한 경우가 많다12. 예를 들어, mOct1은 마우스 PTEC에서 기저측으로 발현되는 반면, 인간에서는 신장에서 OCT1의 막 단백질 발현이 검출되지 않습니다13,14.

미세생리시스템(microphysiological system, MPS)과 장기 칩 기술의 발전으로 연구자들은 인간 장기의 3차원(3D) 구조와 동적 유체 흐름 조건을 밀접하게 모방한 체외 모델을 개발할 수 있게 되었습니다15. 우리 그룹은 이전에 PTEC16,17로 두 가지 MPS 모델을 특성화했으며, 이러한 모델을 사용하여 독성 연구18,19,20를 수행하고 약물 처분을 정확하게 예측했습니다 21. 이러한 모델에서 1차 PTEC를 사용하면 생체 내에서 관찰된 기능적 특성을 유지할 수 있기 때문에 상당한 이점을 얻을 수 있습니다.

여기에서는 UNOS(United Network for Organ Sharing)가 승인한 장기 조달 기관을 통해 사망한 기증자로부터 얻은 온전한 인간 신장에서 인간 PTEC를 분리하고 MPS 플랫폼 내에서 이러한 배양된 인간 PTEC를 적용하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

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프로토콜

모든 작업은 워싱턴 대학교의 인체 조직 취급 지침에 따라 수행되었습니다. 적합한 기증자는 다음 요구 사항을 충족합니다: 한허혈 시간(CIT)이 36시간 미만이어야 하며, 신장 질환, 투석 또는 기타 의학적 상태(예: 당뇨병 1형 또는 2형 당뇨병, B형 간염, C형 간염, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 바이러스성/세균성 뇌수막염, 메티실린 내성 황색포도상구균 감염, 매독, 패혈증 또는 코로나19). 이 연구에 사용된 전체 인간 신장은 UNOS가 승인한 OPO를 통해 공급되었습니다.

1. 생물 안전 캐비닛 준비

  1. 후드에 70% 에탄올을 뿌립니다. 캐비닛 내부의 모든 표면과 품목의 오염을 제거하여 멸균 환경을 조성하십시오.
  2. 파란색 흡수 패드를 깔아주세요. 이 패드 위에 모든 조직 작업을 수행하십시오.
  3. 생물 안전 캐비닛에 필요한 장비를 사용할 수 있고 적절하게 멸균되었는지 확인합니다(면도날, 혈청학적 피펫 팁, 혈청학적 피펫 건, 100μm 세포 여과기, p1000 팁, 1000μL 마이크로피펫, 15cm 원형 배양 접시 및 원뿔형 튜브).

2. 신장 전처리 준비

  1. 칼슘 및 마그네슘이 함유된 Dulbecco의 DPBS(Phosphate Buffered Saline)에 0.75mg/mL 콜라겐분해효소 IV + 0.75mg/mL 디스파제 II를 첨가하여 신장 소화 용액을 준비합니다. 0.2μm 멸균 멤브레인 필터를 통해 용액을 여과합니다.
    참고: 완전한 인간 성인 신장의 경우 각각 ~35mL의 소화 용액(총 500mL)을 포함하는 약 14개의 50mL 원뿔형 튜브가 필요합니다.
  2. 포도당이 없는 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)/F12 분말 4.425g, D-포도당 분말 0.5g, 중탄산나트륨 분말 0.6g, 100x 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충제 5mL(인슐린 1000mg/L 함유, 550mg/L 트랜스페린 및 0.67mg/L 아셀렌산나트륨 함유), 50μM 하이드로코르티손 0.5mL 및 100x 항생제-항진균 용액 5mL(페니실린 G 나트륨 10000단위/mL 함유, 10000μg/mL 스트렙토마이신 설페이트 및 0.85% 식염수 중 25μg/mL 암포테리신 B)를 500mL의 멸균 오토클레이브 초순수(유형 1) 물에 넣습니다. 0.2μm 멸균 멤브레인 필터를 통해 매체를 필터링합니다. 소 태아 혈청(FBS)을 해동하고 14개의 50mL 원뿔형 튜브에 10mL 부분 표본을 만듭니다.
  3. 50mL 코니컬 튜브의 추가 세트를 모아 라벨을 붙입니다. 이 단계에서는 50mL 튜브 14개씩 3세트가 있는지 확인합니다.
  4. 오비탈 셰이커를 37°C로 예열합니다.

3. 전체 신장에서 PTEC 분리

  1. 멸균 기술을 사용하여 조직 샘플이 담긴 선적 컨테이너를 생물 안전 후드에 넣습니다. 상자에서 가방을 제거하고 후드에 넣기 전에 외부에 70% 에탄올을 뿌립니다.
  2. 15cm의 둥근 배양 접시에 신장을 놓습니다. 나머지 미디어를 흡인/폐기합니다.
  3. 멸균 면도날을 사용하여 주변 지방과 신낭을 제거합니다. 신낭에 부드럽게 점수를 매겨 중앙을 따라 슬릿을 만듭니다.
  4. 핀셋을 사용하여 캡슐을 떼어내고 면도날을 사용하여 신장에 붙어 있는 지방을 잘라냅니다. 캡슐과 지방을 모두 15cm 배양 접시에 버립니다.
  5. 수질에서 피질(~1cm 두께)을 분리합니다. 수질은 버립니다.
    참고: 피질은 수질에 비해 더 밝은 갈색-노란색을 띱니다.
  6. 면도날을 사용하여 티슈를 슬러리처럼 보일 때까지 <1cm3 조각으로 다집니다.
  7. 접시에 소량의 신장 소화 완충액을 추가하고 슬러리를 35mL의 신장 소화 용액이 들어 있는 50mL 튜브의 첫 번째 세트로 옮깁니다. 고르게 분배하고 각 튜브에 대해 총 부피가 45mL를 초과하지 않도록 합니다.
  8. 모든 튜브를 37°C 오비탈 쉐이커에 옮기고 튜브가 빠지지 않는 최고 속도로 30분 동안 배양합니다. 튜브에 70% 에탄올을 분무한 후 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 다시 옮깁니다.
  9. 튜브를 뒤집어 섞고 더 큰 조직 조각이 바닥에 가라앉도록 합니다. 온전한 조직을 옮기지 않고 10mL의 소 태아 혈청(FBS)이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 가능한 한 많은 용액을 옮깁니다. 고르게 분배하고 각 튜브에 대해 총 부피가 45mL를 초과하지 않도록 합니다.
  10. 튜브를 200g에서 7분 동안 원 심분리합니다. 튜브에 70% 에탄올을 분무한 후 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 다시 옮깁니다.
  11. 상층액을 조심스럽게 흡입하십시오. 각 튜브에 10mL의 PTEC 매체를 추가하고 펠릿을 재현탁합니다.
  12. 생성된 세포 현탁액을 100μm 세포 스트레이너를 통해 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 변형시킵니다.
  13. 생성된 세포를 400g에서 5분 동안 여과액으로 원 심분리합니다. 튜브에 70% 에탄올을 분무한 후 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 다시 옮깁니다.
  14. DPBS 5mL로 펠릿을 세척합니다. p1000 팁을 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.
  15. 튜브를 400g에서 5분 동안 원 심분리합니다. 튜브에 70% 에탄올을 분무한 후 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 다시 옮긴 다음 상층액을 흡인합니다.
  16. 3.15단계를 두 번 더 반복하여 총 세 번 세탁합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 15mL의 PTEC 배지로 재현탁하고 멸균 세포 배양 T-75 플라스크에 세포를 플레이트화합니다.
  17. 플라스크에 적절하게 라벨을 붙이고 세포가 37°C 및 5% CO2의 멸균 인큐베이터에서 성장하도록 합니다. PTEC가 첫 번째 배지가 교체되기 전에 48시간 동안 인큐베이터에서 방해받지 않고 자랄 수 있도록 합니다.

4. 미디어 변경

  1. 플라스크에서 매체를 흡입합니다.
  2. 예열된 DPBS 5mL로 셀을 세척합니다.
  3. 예열된 PTEC 매체 5mL를 T-25 플라스크에 추가합니다.
  4. 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
  5. 플라스크가 계역 태징 또는 실험에 사용하기 위해 최소 70% 포화도에 도달할 때까지 48시간마다 매체를 교체하십시오.

5. PTEC 패스에이징

  1. 플라스크에서 매체를 흡입합니다. 각 T-25 플라스크에 예열된 0.05% 트립신-EDTA 5mL를 추가하고 트립신이 분해될 수 있도록 37°C에서 1-2분 동안 배양합니다.
  2. 세포가 분리되면 미리 데워진 정의된 트립신 억제제 용액 5mL로 트립신을 중화합니다.
  3. 플라스크에 아직 붙어 있는 세포를 제거하기 위해 5회 재현탁합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브로 옮기고 400g에서 5분 동안 원심분리합니다.
  4. 상층액을 흡입하십시오.
    참고: PTEC를 동결 보존하려면 여기에서 중지하고 해당 프로토콜로 이동합니다.
  5. 튜브당 14mL의 PTEC 배지로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포 현탁액을 T-75 플라스크(플라스크당 튜브 1개)로 옮깁니다.
  6. T-쉐이크를 수행하여 플라스크 전체에 세포를 고르게 분포시킵니다. 세포를 모니터링하고 48시간마다 매체를 교체하십시오.

6. PTEC를 동결 보존하는 것

  1. 5.6단계 후, 각 15mL 코니컬 튜브에 대해 2mL의 10% DMSO 및 90% 저포도당 PTEC 배지에 세포 펠릿을 재현탁하고 1mL를 하나의 극저온으로 옮깁니다.
  2. 냉동 연료를 온도 조절이 가능한 세포 동결 용기로 옮기고 용기를 -80°C 냉동고에 24시간 동안 보관합니다. -80°C에서 24시간 후 냉동 보관을 위해 액체 질소 탱크로 옮깁니다.

7. PTEC 해동

  1. 37°C 수조에서 -80°C에서 바이알을 해동합니다. 실온(RT)에서 해동하지 마십시오. 바이알이 부분적으로 해동되면(작은 얼음 조각이 보여야 함) 10mL의 예열된 PTEC 배지가 있는 15mL 원뿔형 튜브에 1mL의 세포 현탁액을 추가합니다.
  2. 400g에서 5분 동안 세포 현탁액 을 스핀다운합니다. 상층액을 흡인하고 5mL의 예열된 저포도당 PTEC 배지에 세포를 재현탁합니다.
  3. 5mL 세포 현탁액을 T-25 플라스크로 옮기고 T-쉐이크를 수행하여 플라스크 전체에 세포를 고르게 분포시킵니다. 여기에서 미디어 변경에 대한 섹션 4를 따릅니다.

8. MPS 장치를 유형 I 콜라겐 매트릭스로 코팅

  1. MPS 장치에서 PBS를 흡인하고 패키지에서 장치를 제거합니다. 의료용 물티슈로 장치를 닦고 원하는 대로 라벨을 붙입니다.
  2. MPS 장치를 15cm 원형 배양 접시에 넣고 사용할 준비가 될 때까지 4°C에 놓습니다. MPS 장치에 습기가 묻지 않도록 접시 바닥에 의료용 물티슈를 보관하십시오.
  3. 콜라겐 I 주사에 사용할 때까지 -20°C에서 부착된 22G Luer-Lok 바늘 둔기가 있는 1mL 주사기를 보관하십시오.
  4. 채워야 하는 MPS 장치 4개마다 15mL 원뿔형 튜브 1개를 얼음 위에 올려 놓습니다. 15mL 원뿔형 튜브마다 바늘 뭉툭한 바늘이 부착된 1mL 주사기 1개를 사용합니다.
  5. 생물 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 MPS 장치의 모든 포트를 엽니다. 각 나사 밸브 상단의 슬릿이 포트와 수직으로 정렬되었는지 확인하십시오.
  6. 1mL 주사기/바늘 무딘 어셈블리를 사용하여 1mL의 에탄올이 든 ECM 챔버를 포트 #1, #3 및 #6으로 세척합니다. 에탄올을 흡입하고 포트 #2, #4 및 #5에서 MPS 디바이스를 관통하지 않도록 완전히 증발하도록(최소 30초) 합니다.
  7. MPS 장치를 다시 4°C에 놓고 PTEC 매체, M199 및 1N NaOH를 얼음 위에 둡니다.
  8. 표 1(필요에 따라 스케일)에 따라 약 4개의 MPS 장치에 대한 Type I 콜라겐 혼합물 1mL에 대한 매트릭스 조성을 계산합니다. 생물 안전 캐비닛에서 위의 계산에 따라 PTEC 매체, M199 및 1 N NaOH를 순서대로 혼합하고 모든 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
  9. 1mL 주사기가 있는 Type I 콜라겐 스톡을 미리 만들어진 혼합물에 조심스럽게 추가합니다. 콜라겐 혼합물이 안정된 연어색-분홍색이 될 때까지 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
  10. 튜브를 짧게 원심분리하여 바닥에 용액을 수집합니다. 용액에 기포가 없는지 확인하십시오.
  11. 미리 냉각된 1mL 주사기와 22G Luer-Lok 바늘 둔기 및 MPS 장치를 생물 안전 캐비닛과 얼음 위에 놓습니다. 미리 냉각된 1mL 주사기에 콜라겐 혼합물을 채우고 거품이 생기지 않도록 합니다.
  12. 콜라겐 용액을 냉각 장치 챔버의 포트 #1, #3 및 #6에 매우 천천히 부드럽게 주입합니다. 포트가 아래를 향하도록 장치를 수직으로 잡고 기포가 포트 #2, #4 및 #5 밖으로 흐를 수 있도록 합니다.
    참고: 포트 #2, #4 및 #5에 콜라겐 혼합물의 방울이 있어야 하며, 이는 챔버가 완전히 코팅되었음을 나타냅니다.
  13. 주사기를 제거하고 얼음을 탄 15mL 튜브에 다시 넣습니다. 포트 #2, #4 및 #5의 나사 밸브를 돌려 채워진 칩을 밀봉하고 칩을 4°C에서 30분 동안 배양 접시에 놓습니다.
  14. 30분 후, 접시가 있는 칩을 멸균 방식으로 생물 안전 캐비닛에 옮기고 칩을 균일하고 개별적으로 펴서 균일하게 예열되도록 합니다.
  15. 물에 적신 의료용 물티슈를 각 접시에 넣고(콜라겐 I 매트릭스가 마르거나 MPS 장치 벽에서 벗겨지는 것을 방지하기 위해) 반투명 유연한 밀봉 필름으로 접시를 밀봉합니다. 콜라겐이 RT에서 하룻밤 동안 중합되도록 합니다.

9. MPS 장치에서 ECM으로 Type IV Collagen을 사용하는 관형 내강 생성

  1. 튜브를 초순수(유형 1) 물과 순수 에탄올로 세척하여 C-flex 튜브를 살균한 다음 전체 튜브 라인을 고압 멸균합니다.
  2. 생물 안전 캐비닛에서 유형 I 콜라겐으로 채워진 MPS 장치의 모든 포트(스크류 밸브는 포트와 수직임)를 열고 포트 #1, #3 및 #6에서 돌출된 와이어를 제거하여 관형 루멘을 형성합니다.
  3. 금속 커플러를 포트 #1, #3 및 #6에 삽입합니다.
  4. PTEC 배지에 5μg/mL IV형 콜라겐 10mL 용액을 준비합니다.
  5. 포트 #24, #1 및 #3에서 돌출된 금속 둔기에 6인치의 멸균 C-flex 튜브를 삽입합니다.
  6. 22-G Luer-Lok 니들 블런트가 장착된 1mL 주사기에 0.5mL의 IV형 콜라겐 용액을 채웁니다.
  7. 채워진 주사기를 주사기 주입 펌프에 놓고 포트 #1의 튜브를 주사기에 연결합니다. 포트 #3 및 #6에 대해 이 단계를 반복합니다.
  8. 주사기 펌프를 사용하여 IV형 콜라겐 용액을 30분 동안 10μL/분의 속도로 MPS 포트로 전달합니다. 포트가 주입되면 콜라겐이 37°C 인큐베이터에서 하룻밤 동안 응고된 후 다음 날 사용하십시오.
    참고: IV형 콜라겐 코팅 MPS 장치는 4°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.

10. MPS 장치에서 기본 PTEC 시딩

  1. 현미경으로 MPS 장치를 검사하여 루멘이 올바르게 형성되었는지 확인합니다.
  2. 5mL의 에탄올이 들어 있는 15mL 튜브에 22G 바늘이 있는 사전 멸균된 22mL 주사기를 놓습니다.
  3. 5.1단계에 따라 T-25 플라스크에서 15mL 원뿔형 튜브에 담긴 PTEC 세포 펠릿을 얻습니다. 5.3으로. 80μL의 PTEC 배지를 세포 펠릿에 추가하고 부드럽게 재현탁합니다.
  4. 세포 현탁액을 1.5mL 마이크로튜브로 옮깁니다.
  5. 인큐베이터에서 MPS 장치가 들어 있는 접시를 제거하고 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 포트 #2, #4, #5를 닫고 나사 밸브를 포트까지 수평으로 돌립니다.
  6. PTEC 함유 튜브를 부드럽게 튕겨 세포를 재현탁시킵니다. 주사기에 셀을 채우고 스크류 밸브 포트에서 가장 먼 주입 포트에 바늘을 삽입합니다.
  7. 주사기의 플런저를 조심스럽게 눌러 세포를 주입합니다. 현미경으로 주입 후 세포를 시각화합니다.
    참고: 세포는 내강을 통해 이동해야 합니다. 내강에서 세포가 관찰되지 않으면 바늘이 주입 포트에 단단히 삽입되었는지 확인하고 필요한 경우 바늘을 다시 삽입하십시오. 세포의 전체 주사기는 장치의 3 루멘을 모두 채울 수 있습니다.
  8. 다른 두 포트로 세포 주입을 계속합니다. 주입 후 포트 #2, #4 및 #5를 닫고 MPS 장치를 37°C 인큐베이터에 다시 넣습니다. 세포가 중력에 의해 내강 밖으로 이동하지 않도록 플레이트를 수평으로 유지하십시오.
  9. 추가 MPS 장치의 경우 주사기를 비운 후 에탄올로 주사기를 세척하고 세포를 추출하기 전에 DPBS로 세척합니다.
  10. MPS 장치를 밤새 방해받지 않고 그대로 두십시오.
  11. 다음 날에는 MPS 장치를 주사기 펌프에 연결합니다.
  12. 생물 안전성 작업대에서 5mL 주사기를 PTEC 배지로 채웁니다. 그런 다음 주사기에 부착된 24인치 C-flex 튜빙 섹션에 22G Luer-Lok 팁 블런트를 끼웁니다.
  13. PTEC 매체가 장착된 주사기를 주사기 펌프에 넣습니다. 라인을 프라이밍하여 기포를 제거합니다.
  14. 프라이밍된 튜빙 라인을 포트 #1, #3 및 #6에 연결하고 스크류 밸브를 수직 위치로 돌려 매체 흐름을 도입합니다.
  15. 실린지 펌프 유량을 0.5μL/min으로 설정합니다. MPS 장치가 있는 접시를 37°C 인큐베이터에 다시 넣고 실험을 시작하기 전에 세포가 지속적인 배지 관류에서 세뇨관을 형성하도록(5-7일 이내) 합니다.

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결과

2D 배양에서 시간 경과에 따른 고립된 1차 PTEC의 형태 및 포화도
신장 피질에서 분리된 후, PTEC는 첫 번째 배지 변경 전에 최소 48시간 동안 방해받지 않고 성장할 수 있었습니다. 세포를 배양한 후 약 일주일 후에 배양 플라스크 전체에 걸쳐 균일한 상피, 조약돌 같은 형태를 가진 작은 배치의 PTEC가 나타나야 합니다(그림 1A, B). 다른 공여자의 PTEC의 성장 속도에 따라 세포 밀도는 배양 10일 후(평균적으로) 약 50%-60%에 도달해야 합니다(그림 1C). 배양에서 약 14일이 지나면 세포가 완전한 포화도에 도달해야 하며(그림 1D) MPS 장치에서 계대배양, 동결 보존 또는 파종할 준비가 됩니다. 평균적으로 인간의 신장 ...

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토론

MPS(Organ-on-a-Chip) 기술은 인체 생리학의 주요 측면을 요약할 수 있는 관련성이 높은 체외 플랫폼을 제공하여 약물 개발 및 독성 평가에서 동물 모델에 대한 의존도를 줄입니다. 최근 FDA 현대화법 2.0(2022)은 임상시험용 신약 신청에 다른 대안 중에서 MPS를 포함할 수 있도록 허용했습니다29. 이 프로토콜은 인간 근위세뇨관 기능을 모델링하고 생체이물이물(xenobiotics)에 대한 신장 독성학적 반응을 평가하는 것을 목표로 인간 기증자 피질 조직에서 PTEC를 해리하고 MPS 플랫폼에서의 후속 사용을 위한 표준 운영 절차를 자세히 설명합니다(그림 2).

높은 PTEC 생존력을 유지하기 위한 중요한 요소는 온열 허혈 시간(WIT)을 최소화하는 것입니다. WIT가 1시간 미만인 신장을 사...

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공개 사항

저자는 이 연구와 관련된 이해 상충이나 재무 공개가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업의 일부는 NASA 계약 80ARC023CA001, NCATS(National Center for Advancing Translational Sciences)(U2CTR004867, UH3TR000504, UG3TR002158), NCATS와 CASIS(Center for the Advancement of Science in Space)(UG3TR002178), NIEHS(National Institute of Environmental Health Sciences)(P30ES00703), National Institute of General Medical Sciences(T32GM007750)의 지원을 받았으며, Northwest Kidney Centers가 Kidney Research에 제공한 무제한 기부 연구소 및 워싱턴 대학교 약학 대학(Ji-Ping Wang Award 및 Bradley Fellowship).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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1mL 루어-록 팁 주사기벡턴, 딕킨슨309628
1.5 mL 마이크로 원심분리관셀트리트 사이언티픽 프로덕츠229442
15 mL 멸균 원뿔형 폴리프로필렌 튜브피셔 사이언티브14-959-53A
3D 미세생리학적 장치노르티스TCC-001
5mL 루어-록 팁 주사기벡턴, 딕킨슨309646
50 mL 멸균 원뿔형 폴리프로필렌 튜브피셔 사이언티브12-565-271
항생제-항균제(100회)서모피셔 사이언티픽15240062
콜라게나아제, 타입 IV, 분말서모피셔 사이언티픽17104019
D-(+)-포도당밀리포어 시그마G8270
정의된 트립신 억제제서모피셔 사이언티픽R007100
디메틸 황산화, 바이오리시약, 서모 사이언티픽 케미컬스서모피셔 사이언티픽J66650-AK
디스파이즈 II, 분말서모피셔 사이언티픽17105041
둘벡코 s MEM (DMEM)/포도당 없는 F-12미국 생물생명과학D9807-02
둘벡코 인산염 완충 식염수(DPBS), 칼슘, 마그네슘서모피셔 사이언티픽14040117
태아 소 혈청(FBS), 프리미엄서모피셔 사이언티픽A5670701
핀피펫 F2 우수 실험실 피펫팅(GLP) 키트서모피셔 사이언티픽05-719-511마이크로피펫
피셔브랜드 슈어원 마이크로포인트 피펫 팁, 유니버설 핏, 비필터피셔 사이언티브02707407, 02707410, 02707438
신선한 인간 신장 통째노바바이오시스https://www.novabiosis.com/research-organ-allocation-services/인간 신장은 UNOS 승인 OPO인 노바비시시스를 통해 확보되었습니다
가습 인큐베이터 (37 & deg; C 및 5% CO2)피셔 사이언티브51033556
하이드로코르티손밀리포어 시그마H0888
인큐베이팅 궤도 셰이커아반토르12620-946
인슐린-트랜스페린-셀레늄 (100X) (ITS -G)서모피셔 사이언티픽41400045
내부 나사산 냉동 바이알코닝430487
킴텍 사이언스 킴와이프킴벌리-클라크 프로페셔널34120
루어 스텁(무딘 주니들), 22 G x 0.5인치인스테크 연구소 주식회사LS22
미디엄 199, 얼스 솔트 (10배)서모피셔 사이언티픽21180021
메가퓨지 8 소형 벤치탑 원심분리기서모피셔 사이언티픽75007210
금속 커플러 (둔탁)인스테크 연구소 주식회사SC 20/15
서리 냉동 용기 씨서모피셔 사이언티픽5100-0036
니콘 이클립스 Ti-S 현미경니콘 인스트루먼트https://www.thelabworldgroup.com/product/nikon-eclipse-ti-fluorescent-microscope/원래 모델은 단종되었습니다.
Nunc 비처리 플라스크, T-25서모피셔 사이언티픽169900
Nunc 비처리 플라스크, T-75서모피셔 사이언티픽156800
피펫, 10 mL, 눈금, 1/10 mL, 멸균그레이너 바이오-원607180
실리콘 튜빙, C-플렉스 튜빙, (내각: 0.020", 외경: 0.083")콜-파머06422-00
단면 면도날 (멸균)바이오실KI-205/50
중탄산나트륨밀리포어 시그마S6297
수산화나트륨밀리포어 시그마S8045
PES 멤브레인이 있는 멸균 일회용 필터 유닛서모피셔 사이언티픽567-0020
조직 배양 처리 접시, 150 mm  x 20mm 통풍구제네시 사이언티브25-203
트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드서모피셔 사이언티픽25300054
1형 콜라겐, 쥐꼬리코닝354236
IV 콜라겐, 쥐코닝354233

참고문헌

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