방법 논문

De Novo 및 In Silico 단백질 설계를 위한 I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, HADDOCK 서버 및 HEX loria 적용

DOI:

10.3791/68003

⸱

2025년 7월 8일

 , 
1Facultad de Ciencias Naturales, Doctorado en Ciencias Biológicas, Campus Aeropuerto. Laboratorio de Biología Cuantitativa y Sistemas Complejos, Universidad Autónoma de Querétaro

이 논문에서

요약

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단백질 설계에는 아미노산 염기서열의 구축과 기능적 변이체를 만들기 위한 특정 모티프의 통합이 포함됩니다. 이 접근 방식은 항생제 내성 병원체와 싸우기 위한 항균 펩타이드(AMP)의 개발에 매우 중요합니다. 본 논문은 다양한 생물정보학 도구를 이용한 단백질 구축 절차를 제시합니다.

초록

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단백질 설계의 경계는 아미노산 염기서열의 구축과 결합 부위와 같은 특정 모티프를 수용체, 이온 채널 또는 기타 단백질에 통합하는 데 있습니다. 이 접근법을 사용하면 특정 기능과 목적을 가진 단백질 변이체를 생산할 수 있습니다. 이러한 생물정보학 자원의 예시적인 응용 분야는 항균 펩타이드(AMP)의 개선 또는 합성 AMP의 설계입니다. 이러한 발전은 최근 신종 질병이 증가하고 있기 때문에 중요한데, 이는 종종 박멸하기 어렵고 항생제 내성을 보이는 병원체에 의해 유발됩니다. 이러한 추세의 결과에는 전 세계적인 동물 종의 멸종과 인간의 죽음이 포함됩니다. 따라서 새롭고 효과적인 AMP의 신속한 합성이 필수적입니다. 이러한 서버와 프로그램은 이러한 병원체에 대한 백신, AMP 또는 효과적인 치료법의 신속한 개발을 촉진할 수 있습니다. 이 작업의 목적은 염기서열로부터 단백질을 구성하는 절차를 제시 및 제안하고 이러한 분자를 단계별로 구축하기 위해 다양한 도구를 사용하는 과정을 설명하는 것이었습니다.

서론

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동물질병의 발병률이 증가하고 있으며, 이러한 현상은 기후변화의 영향을 받고 있다. 지구 온도의 상승은 미생물의 증식과 기회주의적 병원체의 출현으로 이어졌고, 이는 악성 및 약물 내성 질병의 발병에 기여했다1. 기후 변화는 토양, 물, 피부 및 장내 마이크로바이옴에 영향을 미쳐 동물의 생리학 및 환경 적응에 지속적인 스트레스를 초래합니다. 이러한 현상은 면역 반응을 손상시켜 동물을 신종 병원체에 더 취약하게 만드는 것으로 입증되었으며, 이는 치명적인 결과를 초래할 수 있으며 잠재적으로 특정 종의 멸종으로 이어질 수 있습니다 2,3,4,5. 두드러진 예는 흰코 증후군(WNS)으로, 곰팡이 Pseudogymnoascus destructans에 의해 발생하는 질병으로 동면 박쥐에 영향을 미칩니다. 이 질병 및 기타 질병은 2006년 아메리카 대륙에서 상당한 사망률이 발생하기 전까지 확인되지 않았습니다6. 이러한 병원체로 인한 피해를 완화하기 위해 연구자들은 이트라코나졸(itraconazole) 및 케토코나졸(ketoconazole)과 같은 항진균제와 유익한 미생물군(Pseudomonas fluorescens) 접종을 포함한 프로바이오틱스를 투여하기 시작했습니다 7. 곰팡이에 의해 유발되는 질병의 또 다른 예는 포획 된 뱀과 야생 뱀 모두에서 피부염 및 다계통 질환을 일으키는 곰팡이 인 Ophidiomyces ophiodiicola입니다 4,8.

이러한 연구는 실질적인 해결책을 신속하게 구현하기 위해 야생동물의 곰팡이 질병에 대한 인식과 이해를 높여야 할 필요성을 강조합니다. 양서류에서 곰팡이 감염이 보고되었으며, 이 동물에 영향을 미치는 널리 퍼진 병원체 중 하나는 키트리디오진균증을 일으키는 수생 곰팡이 Batrachochytrium dendrobatidis (Bd)입니다. 이 질병은 감염되기 쉬운 동물에게 심각한 피부 병변을 일으키고 정상적인 피부 기능을 방해하여 잠재적으로 폐사를 초래할 수 있다9. 이 병원체는 20세기 이후 광범위하게 퍼져 90종의 양서류를 멸종시키는 데 기여했습니다. 이러한 감염의 만연은 다양한 생태학적, 생리학적, 마이크로바이옴 및 기타 요인에 대한 고려가 필요하기 때문에 이를 예방하고 효과적인 치료법을 찾는 데 상당한 어려움을 초래합니다10.

병원성 미생물이 유전자 코딩을 통해 내성 기전을 신속하게 진화시킬 수 있는 능력을 가지고 있다는 것은 잘 알려진 현상이며, 이러한 과정은 약물 및 항생제를 위한 외부 유출 펌프의 생산으로 예시될 수 있습니다11. 또한, 이러한 미생물은 특정 분자의 영향을 중화할 목적으로 막 지질 조성을 변형하는 것으로 관찰되었습니다12. 단백질 염기서열 분야는 특히 치료 접근법에 대한 통합과 단백질 구조 모델의 구축이라는 맥락에서 상당한 관심을 받았습니다. 이러한 모델은 단백질 합성을 시작하기 전에 실험실 시간과 자원을 최적화하도록 설계되었습니다13. 이러한 사례에서 감염을 예방하는 것은 여러 생태학적, 생리적, 미생물군집 요인을 포함하는 복잡한 작업이다14. 이 접근 방식은 실험실에서 시간과 자원을 보다 효과적으로 관리하고 작업의 복잡성을 강조합니다.

기존 화합물의 실제 적용 가능성을 높이고 이러한 응용 분야에 대한 더 중요한 잠재력을 가진 새로운 화합물을 만들기 위해서는 화학, 분자 생물학, 물리학 및 프로그래밍을 포함한 다양한 분야의 전문 지식을 활용하는 것이 필수적입니다. 이를 위해 I-TASSER(Iterative Threading ASSembly Refinement)15,16 및 trRosetta 17,18(TRansform-restrained Rosetta에 의한 단백질 구조 예측)을 포함한 여러 도구를 사용할 수 있습니다. 분자 도킹 및 PDB 파일 편집을 위한 구조 단백질 예측 및 UCSF Chimera(샌프란시스코 캘리포니아 대학의 탐색적 연구 및 분석을 위한 시각화 시스템)19 및 HEX loria(대화형 단백질 도킹 및 분자 중첩 프로그램)20.

I-TASSER는 구조와 기능을 예측하는 자동화된 온라인 서버입니다. 이 프로그램은 웹 브라우저를 통해 또는 다운로드로 액세스할 수 있습니다. 제출 페이지에서 사용자는 FASTA 형식으로 시퀀스를 입력하거나 .txt 형식으로 아카이브를 다운로드할 수 있습니다. 서버 프로세스에는 로컬 메타 스레딩 서버 LOMETS 20,21,22,23,24,25에 설명된 대로 어느 정도의 상동성을 가진 구조적 템플릿을 식별하는 작업이 포함됩니다. 서버에서 100만 개의 잠재적 결과를 처리한 후 여과 프로세스가 시작되고 RMSD(Root Median Square Deviation), TM(두 모델 간의 구조적 유사성을 평가하는 데 사용되는 메트릭) 및 C-score(도구로 생성된 단백질 구조 모델의 신뢰도를 평가하는 데 사용되는 메트릭)를 기반으로 조각이 선택됩니다. 사용자는 프로그램에 제공된 미리 결정된 매개 변수를 기반으로 결과를 사용자 정의하거나 특정 순서 또는 구조 적 기대치20,21,22,23,24,25에 따라 자신의 값을 입력 할 수 있습니다.

trRosetta 는 단백질 구조 예측을 위한 매우 효과적인 프로그램입니다. 이 서버에서 사용자는 아카이브 형식, TXT, FASTA, 입력 시퀀스 또는 MSA(Multiple Alignment Sequences)로 시퀀스를 제출할 수 있습니다. 이 프로그램을 통해 사용자는 템플릿 중에서 선택하거나 시퀀스 폴딩을 위해 trRosetta-single을 실행할 수 있습니다. 이러한 서버는 딥 러닝 네트워크를 활용하여 구조적 예측을 생성합니다. 염기서열 예측 과정은 접촉 및 거리 지도 예측의 초기 단계, 최종 모델을 위한 상위 5개 템플릿의 선택, 그리고 접힘 및 미세 조정을 위한 에너지를 최소화하는 단계17을 포함한다.

HADDOCK(High Ambiguity Protein-Protein Docking) 서버는 단백질, 펩타이드, 리간드 및 수용체 구조를 포함하는 두 개 이상의 PDB 파일의 유연한 도킹을 용이하게 하는 계산 도구입니다. 이 서버는 도킹 프로세스 중에 예측되거나 식별된 단백질의 정보를 인코딩하는 AIR(Ambiguous Interaction Restraints)을 통합하는 접근 방식을 사용합니다. AIR은 아미노산 제한을 포함하며 수동 또는 활성 아미노산으로 분류합니다. 활성 아미노산의 통합은 단백질 수용체 사이의 잠재적인 결합 또는 상호 작용 부위를 나타내기 때문에 특히 중요합니다. 이 프로그램의 설계는 용제 노출을 모델(26)에 통합합니다.

HEX Loria 는 단백질 복합체 분석 및 분자 도킹을 용이하게 하는 온라인 대화형 서버입니다. 이 서버는 PDB(Protein Data Bank) 형식의 좌표 아카이브를 읽고 NVIDIA 또는 CUDA 그래픽 대상을 사용하여 도킹 계산을 빠르게 생성할 수 있습니다. 이 프로그램은 최대 1,000개의 도킹 예측을 생성할 수 있으며 두 분자27의 전체 방향에 대해 상관 푸리에를 활용합니다. HEX Loria 인터페이스는 사용자 친화적으로 설계되어 연구원들이 단백질 구조를 원활하게 업로드하고 도킹 시뮬레이션을 위한 매개변수를 구성할 수 있습니다. NVIDIA 또는 CUDA 그래픽 처리 장치를 활용할 수 있는 서버의 용량은 계산 시간을 크게 단축하는 것으로 나타났으며, 이를 통해 연구원들은 보다 편리하게 결과를 얻을 수 있습니다. 또한 HEX Lori는 결과 도킹을 위한 다양한 시각화 옵션을 제공하여 사용자가 예측된 단백질-단백질 상호 작용에 대한 자세한 분석을 수행할 수 있도록 합니다.

UCSF 키메라의 활용은 연구 결과의 정확성을 보장하는 데 필수적입니다. 이 소프트웨어는 현재 프로토콜의 실행을 위해 설치를 필요로 하며, 그에 따른 기능, 즉 원자 간 거리 측정 및 기타 다양한 분석 작업이 사용됩니다. 이 소프트웨어는 라벨링, 채색, 표면 렌더링 및 JPG 또는 PNG 형식의 그림 내보내기와 같은 기능을 자랑합니다. 라벨과 색상의 통합은 수용체와 설계된 항균 단백질 사이의 접촉 확률이 높은 아미노산의 식별을 용이하게 합니다. 또한 이러한 아미노산 사이의 거리를 정확하게 측정할 수 있습니다.

이 프로토콜은 양서류를 괴롭히는 새로운 건강 문제에 대한 대체 치료 옵션을 식별하는 것을 목표로 합니다. 피부의 곰팡이 감염인 키트리디오진균증(Chytridiomycosis)은 양서류 발달의 다양한 단계에서 관찰되었습니다. 이 동물들의 주요 감염원은 일반적으로 거주하고 다양한 활동에 참여하는 수역입니다. 효과적인 항진균제의 개발은 적어도 세 가지 분자 표적의 식별을 필요로 합니다: 전하를 사용하여 세포벽과의 상호 작용, 원형질막에 결합, 마지막으로 곰팡이 Bd에서 중요한 역할을 하는 막 수준에서 수용체 단백질과의 결합 및 상호 작용.

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프로토콜

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1. Bd에서 분자 표적 염기서열 식별

참고: 염기서열에서 아미노산의 선택은 문헌의 권장 사항을 기반으로 합니다. 주요 아미노산에는 K, W, G, A, V, I, L이 포함됩니다. 사용할 프로그램을 확인하려면 재료 표를 확인하십시오.

  1. NCBI 데이터베이스에서 대상 시퀀스를 검색합니다.
    1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 에서 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스에 액세스하십시오.
    2. All Databases(모든 데이터베이스)를 선택하고 Nucleotide(뉴클레오타이드)를 검색 범주로 선택합니다.
    3. 검색창에 Batrachochytrium dendrobatidis를 입력하고 균주 및 종별로 결과를 필터링합니다.
    4. 추가 분석을 위해 염기서열을 다운로드하여 텍스트 편집기 또는 FASTA 형식으로 저장하십시오 .

2. BLAST 또는 SMART BLAST로 시퀀스 분석

  1. BLAST 검색을 수행합니다.
    1. 웹 브라우저를 열고 BLAST(기본 로컬 정렬 검색 도구)로 이동합니다.
    2. Protein BLAST를 선택하여 쿼리 시퀀스를 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 단백질 데이터베이스와 비교합니다.
  2. 대상 특이성을 확인합니다.
    1. 선택한 분자 표적이 다른 종에 존재하지 않는지 확인합니다. 표적이 여러 종에 나타나는 경우, 특이성이 확인될 때까지 염기서열 선택을 반복합니다( 그림 1 참조).
      참고: 이 단계는 바람직하지 않은 2차 분자 표적이 AMP 또는 항진균 단백질 기능을 방해하지 않도록 합니다.
  3. 단백질 염기서열에서 상동성을 확인합니다.
    1. 설계된 아미노산 염기서열이 다른 종의 상동 단백질과 일치하지 않는지 확인합니다.
      참고: 이 단계는 항진균 기능이 의도한 표적에 특이적임을 확인합니다.

3. 항균 단백질 염기서열 설계

참고: 아미노산 함량과 염기서열은 원하는 단백질 기능, 특히 항진균 활성에 맞게 조정되어야 합니다. 설계된 염기서열은 Bd에 대한 항진균 효과가 있는 단백질을 암호화해야 합니다. Antifp 예측 서버28에서 이를 확인하십시오.

  1. 문헌 검토 및 시퀀스 설계
    1. Bd의 주요 특성과 잠재적인 항균 메커니즘을 식별하기 위해 최근 문헌을 종합적으로 검토합니다.
      참고: 이전 연구에서는 다양한 동물과 미생물에 의해 합성된 Bd에 대한 항균 펩타이드(AMP)에 대해 설명합니다. Shai의 포뮬러29는 합성 항진균 펩타이드를 설계하기 위한 프레임워크를 제공합니다. 이 방법은 최대 항진균 활성을 위해 단백질 서열을 최적화하는 데 사용해야 합니다.

4. I-TASSER를 이용한 3D 구조 예측

참고: 이 프로토콜은 분자 표적 및 설계된 항균 서열에 적용됩니다.

  1. 염기서열에 액세스하고 제출하려면 단백질 구조 및 기능 예측 https://zhanggroup.org/I-TASSER/ 위한 I-TASSER 서버를 방문하십시오.
  2. 교육기관 이메일을 사용하여 등록하면 도구 접근을 위한 사용자 이름과 비밀번호를 받을 수 있습니다.
  3. 분자 표적 또는 설계된 염기서열을 FASTA 형식, .txt 파일로 제출하거나 입력 필드에 직접 복사하여 붙여넣을 수 있습니다.
  4. 시퀀스에 고유한 이름을 할당합니다.
  5. 제출을 클릭하고 프로그램이 시퀀스를 분석하도록 하여 예상 처리 시간을 제공합니다.
    참고: 결과를 받을 때까지 프로토콜을 일시 중지합니다. 처리 시간은 일반적으로 작은 단백질(≤50개 아미노산)의 경우 24시간에서 72시간 사이이며 큰 단백질(최대 3,000개 아미노산)의 경우 더 오래 걸릴 수 있습니다.
    도구 선택 지침: 설계된 항균 펩타이드와 같은 작은 단백질에 대해 I-TASSER를 사용합니다. 큰 단백질의 경우 복잡한 구조 모델링에 최적화된 trRosetta를 사용하십시오.

5. trRosetta를 사용하여 3D 구조 예측

  1. trRosetta 웹 서버 방문: https://yanglab.qd.sdu.edu.cn/trRosetta/.
  2. 타겟 수용체 염기서열을 FASTA, .txt 또는 MSA 형식으로 입력하거나 서버에 직접 붙여넣습니다.
  3. 구조적으로 예측된 단백질에 이름을 할당합니다.
  4. Submit(제출)을 클릭하여 템플릿을 제외하는 옵션이 선택되어 있는지 확인합니다. trRosettaX-single homolog를 선택하여 예측 프로세스를 시작합니다.
    참고: 결과를 받을 때까지 프로토콜을 일시 중지합니다.
  5. 성공적으로 제출되면 확인 이메일을 기다립니다.
  6. 예측 결과를 분석합니다.
    1. TM-score가 모델 품질의 척도인지 확인합니다.
    2. 접촉 맵, 아미노산별 거리 맵, 각도 ω(오메가), θ(세타), φ(파이)에서 알파 탄소와 베타 탄소에 대한 회전 맵을 검토합니다.
  7. 추가 분석을 위해 결과를 ZIP 형식으로 다운로드합니다.

6. 분자 도킹 및 상호 작용 분석(HADDOCK 사용)

  1. HADDOCK 도킹 서버에 액세스: https://wenmr.science.uu.nl/haddock2.4/.
  2. 교육기관 이메일을 사용하여 계정을 등록하고 계정을 확인한 후 로그인합니다.
  3. 홈 페이지로 돌아가서 새 작업을 선택하고 제출을 시작합니다 .
  4. HADDOCK 제출 페이지에서 작업 이름, 분자 번호(이 경우 2)와 같은 필수 정보를 입력합니다. 모두 선택합니다.
  5. 업로드 도킹을 위한 분자. 수용체와 리간드에 대한 PDB 구조를 업로드합니다. 둘 다에 대해 단백질-리간드 도킹 을 선택합니다.
  6. 리간드 제출에 대한 단계를 반복하고 모든 체인을 선택한 다음 나머지 설정은 기본값으로 둡니다.
  7. 후속 제출 단계에 대해 다음을 클릭합니다.
    참고: 섹션 1 및 2에서 수용체-리간드 상호 작용에 관여하는 아미노산 목록을 추가하고 활성 잔기로 표시합니다. 수동 잔류물은 미리 정의된 상태로 유지됩니다. 활성 부위는 상호 작용 부위이며 설계된 단백질의 특성과 수용체 단백질에 노출된 아미노산에 따라 선택해야 합니다.
  8. 도킹 프로세스를 완료하고 실행합니다.
    1. Next(다음)를 클릭하여 기본 도킹 매개변수를 변경하지 않고 유지합니다.
    2. 제출을 클릭하여 처리를 시작합니다.
      참고: 예상 처리 시간은 24시간에서 72시간 사이입니다.
  9. 도킹 결과를 검토합니다.
    1. 서버는 최상의 도킹 결과를 자동으로 선택하고 순위를 매깁니다. 구조 시각화 소프트웨어(예: PyMOL 또는 UCSF Chimera)를 사용하여 아미노산 상호 작용을 분석합니다.
  10. 추가 연구를 위해 최종 도킹된 구조물을 PDB 형식으로 다운로드합니다.
    참고: 보충 파일 1: 보충 그림 S1, 보충 그림 S2, 보충 그림 S3, 보충 그림 S4 및 보충 그림 S5를 참조하십시오.

7. 거리 측정(선택 사항) [보충 파일 1 참조: 보충 그림 S6, 보충 그림 S7 및 보충 그림 S8.]

  1. PDB(구조 시각화 프로그램)를 사용하여 도킹 결과를 분석할 수 있습니다. UCSF Chimera에서 분자 도킹 PDB 파일을 열고 구조적 근접성 및 잠재적 결합 부위(측정된 거리)를 평가합니다.
  2. Chimera 아이콘을 두 번 클릭하여 PDB를 엽니다. 파일, 열기를 선택하고 문서 디렉토리 창에서 파일을 선택합니다.
  3. 원자를 식별합니다. actions, atoms/bonds로 이동하여 show를 선택합니다.
  4. 리간드와 수용체에 가장 가까운 원자를 선택합니다. Ctrl+클릭으로 원자 1을 선택하고 Ctrl+Shift+클릭으로 원자 2를 선택합니다.
  5. 도구, 구조 분석으로 이동하여 거리를 선택합니다.
  6. Create(생성)를 클릭합니다(Atom 선택 확인). 이 창에는 아미노산과 원자 1 및 2의 위치가 표시됩니다.
    참고: 거리 열은 원자 사이의 각도를 보여줍니다.
  7. 테이블을 다운로드하여 로컬 컴퓨터에 저장합니다.
    참고: 자세한 내용은 추가 파일 1 을 참조하십시오.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

개발 중인 시퀀스는 K(X)3KW(X)2K(X)2K 공식을 사용하며, 여기서 (X)는 G, A, V, I 또는 L28일 수 있습니다. 얻어진 검색 결과에는 300개 이상의 아미노산의 단백질 서열이 포함되었으며, 이는 부분 서열과 반대되는 완전한 단백질 서열로서의 상태로 인해 선택되었습니다. 이 연구에는 완전한 염기서열이 필수적이라는 점에 유의해야 합니다. 각 수용체/멤브레인 채널의 기능은 또한 염기서열 정보 내에서 또는 별도의 데이터베이스 검색에서 검색되었습니다. 얻어진 결과에는 모든 유형의 단백질이 포함되었습니다. 그러나 모든 것이 이 프로토콜에 유용한 것은 아닙니다. 결과적으로, Na/H 반운반체에 초점을 맞추기 위해 선택은 양서류의 피부에서와 같이 세포가 수생 환경에서 육상 환경으로 이동하는 것과 같은 환경 변화를 겪을 때 미생물 세포의 모양을 유지하고 삼투압 조절과 관련성을 고려하여 이루어졌습니다.

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토론

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단백질 구조 예측에 사용되는 생물정보학 접근 방식은 계산 프로그램에 의존하기 때문에 고유한 한계가 있습니다. 이러한 프로그램은 실제 단백질 구조를 근사화하려고 시도하지만 온도, 용해도 및 용매 존재와 같은 요인에 의해 제약을 받으며, 이는 생체 조건 내에서 완전히 복제되지 않을 수 있습니다. 또한 이 방법은 다중 정렬 및 선별된 데이터베이스를 통해 보존된 주요 단백질의 정확한 식별에 의존하므로 이러한 데이터베이스의 신뢰성은 의미 있는 결과를 얻는 데 매우 중요합니다.

한계에도 불구하고 이 방법은 병원체, 수용체 또는 결정화된 수용체 단백질의 기존 염기서열 데이터와 통합할 때 상당한 이점을 제공합니다. 천연 또는 합성 항균제를 포함하고 그 효능을 향상시키기 위해 변형할 수 있는 경우 이 방법의 다양성이 향상됩니다. 염기서열분석 및 실험 테스트를 통한 검증은 구조 모델의 신뢰성을 더욱 강화합니다. 정확성을 보장하기 위해 설...

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공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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Jimena R. Villarreal은 Universidad Autónoma de Querétaro (UAQ)의 Doctorado en Ciencias Biológicas의 박사 과정 학생이며, Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCyT) 펠로우십 (1003112)을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BLASTN/AN/A온라인 서버
컴퓨터AMDN/ASO: XP, W7, W8, W10, ubuntu, linux
HADDOCK 서버BONVINLABN/A온라인 서버
HEX 5.2BBSRC-INRIAN/A 다운로드 온라인 서버
I-TASSERZHANG LABN/A 다운로드 온라인 서버
MUSCLEN/AN/A온라인 서버
NCBIN/AN/A온라인 서버
PYMOLSCHRÖ DINGERN/ADownload-XP, W7, W8, W10, W11, LINUX
SWISS-MODELBIOZENTRUMN/A온라인 서버
trRosetta 서버YANG LABN/A 온라인 서버
USCF CHIMERARBVIN/ADownload-XP, W7, W8, W10, W11, LINUX

참고문헌

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