방법 논문

U2 OS 세포 배양을 사용한 라이브 셀, 형광 현미경 검사를 위한 전기천공법 세포 분석 프로토콜

DOI:

10.3791/68005

⸱

2025년 6월 13일

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Toronto Metropolitan University, 2Institute for Biomedical Engineering, Science and Technology (iBEST), a partnership between St. Michael's Hospital, a site of Unity Health Toronto, and Toronto Metropolitan University, 3Keenan Research Centre for Biomedical Science at St. Michael's Hospital

이 논문에서

요약

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전기천공법(Electroporation)은 펄스 전기장(PEF)을 사용하여 세포 배양에 일시적인 공극을 만들어 분자 화물을 도입하는 것입니다. 이 기술은 최근 연구 및 임상 환경에서 널리 사용되고 있습니다. 여기에서는 최근 개발된 "Electroporation Cytometry System"을 사용하여 살아있는 세포, 형광 현미경 검사를 수행하기 위한 전기천공법 기술에 대해 설명합니다.

초록

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펄스 전기장(PEF)은 의료 연구 및 임상 응용 분야에서 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다. 주요 연구 분야는 전기천공법(가역적 또는 비가역적)에 중점을 둡니다. 가역적 전기천공법은 일반적으로 유전자 전기전달(GET)이라고 하는 플라스미드 DNA와 같은 세포막을 통해 분자를 전달하기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔습니다. 반대로, 비가역적 전기천공법은 암 치료에서 인기 있는 기술이 되었으며, PEF를 사용하여 세포를 영구적으로 파열시킴으로써 무독성 대안을 제공합니다. 이것은 전기 화학 요법 (ECT)으로 알려진 효과를 향상시키기 위해 다양한 유형의 약물 또는 시약과 결합 될 수 있습니다. 그러나 실제 응용 분야에서의 광범위한 성공에도 불구하고 현재 기술을 개선하기 위해서는 추가 지원 기술 및 연구가 필요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 전기천공법 세포 분석 시스템이 개발되어 장기 형광 현미경 검사를 수행할 수 있는 능력으로 라이브 셀 PEF 실험을 지원했습니다. 이는 PEF 노출에 대한 반응으로 세포주기의 변화를 평가하기 위해 안정적으로 발현되는 FUCCI(CA)5 U2-OS 세포주와 결합되었습니다. 이를 통해 최대 30시간의 타임랩스 현미경 검사가 이루어졌으며, FUCCI(CA)5 리포터를 기반으로 세포 활동의 실시간 변화를 제공했습니다. 그 결과, 다운스트림 분석을 위해 위상별 변화를 정량화할 수 있었습니다.

서론

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펄스 전기장(PEF)은 생물학 및 임상 응용 분야의 다양한 응용 분야에서 일반적인 도구로 성장했습니다1. 이는 전기천공법(EP)과 전기자극법(ES)으로 크게 분류할 수 있습니다. Electroporation에는 가역적 및 비가역적 electroporation으로 알려진 두 가지 하위 분야가 있습니다. 가역적 전기천공법(RE)은 수십 년 동안 플라스미드 DNA와 같은 분자 화물을 포유류, 박테리아 및 효모와 같은 다양한 유형의 세포로 전달하는 효과적인 도구로 사용되어 왔습니다2. 보다 최근에는 비가역적 전기천공법(irreversible electroporation, IRE)이 현재의 암 치료에 대한 무독성 대안으로 부각되고 있다3. 새롭게 떠오르는 하위 분야는 펄스장 절제(Pulsed Field Abblation, PFA)라고 하며, 이는 특히 특정 심장 기능 장애를 치료하기 위한 비열 조직 제거에 중점을 둡니다4. 약물 및 기타 시약과 함께 이것은 전기 화학 요법 (ECT)의 개발로 이어졌습니다. 그러나 PEF 치료에 대한 현재의 이해는 임상 적용에 비해 앞서고 있다5. 여기에서는 전기화학요법을 조사하기 위한 전기천공법 세포분석 시스템을 소개합니다. 세포주기는 세포 생존력의 핵심 지표이며, 변화는 위상별 효과를 식별할 수 있습니다. 이러한 도구를 개발함으로써 프로토콜을 더 빠르게 조정할 수 있으며, 더 넓은 범위의 암에 대해 보다 효과적인 치료법을 제공할 수 있습니다.

당사의 맞춤형 electrocytometry 시스템(그림 1)은 알루미늄 평행판 전극과 커버글라스 바닥이 있는 챔버와 간단한 지수 감쇠 펄스 발생기로 구성됩니다. 챔버는 3D 프린팅 챔버로 구성되며 #1.5 커버 유리 바닥에는 의료용 감압 접착제가 부착되어 있습니다. 전극은 챔버에 내장된 지지대 위에 놓인 접착 알루미늄 필름으로 형성되어 0.4cm 떨어진 두 개의 평행 전극을 제공합니다. 이는 상용 전극의 일반적인 구성이며 전류 프로토콜을 빠르게 조정할 수 있는 견고한 설계를 제공합니다. 이 챔버는 25mm x 55mm 슬라이드용으로 설계된 환경 인클로저에 맞을 수 있으며, 이는 상용 현미경 공급업체에서 지원하는 일반적인 슬라이드 형식이기도 합니다. 펄스 발생기는 최대 330V의 지수 감쇠 펄스를 제공하여 가역적 및 비가역적 전기천공을 포함한 광범위한 실험을 수행할 수 있습니다.

PEF가 세포주기에 미치는 영향을 연구하기 위해 형광 살아있는 세포주기 리포터 구조인 Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (CA)5 (FUCCI(CA)5)를 발현하는 형질전환 인간 골육종 세포주(U2 OS)를 사용했습니다. 이 시스템은 두 가지 형광색의 잘린 형태의 Geminin과 Cdt1을 도입하며, 이들은 세포주기 동안 특정 속도로 생산되고 재활용됩니다. 또한 안정적으로 발현되는 U2-OS 세포의 FUCCI(CA)5 라인을 사용하여 실험 중에 세포사멸을 직접 모니터링할 수 있습니다. 세포주기 동안, 리포터는 세포에서 자연적으로 발현되는 기능적 버전과 동일한 속도로 생성되고 분해되기 때문에 각 단계에서 예측 가능하게 작동합니다. 세포사멸이 발생하면 세포 주기가 빠르게 중단되면서 이 주기가 중단됩니다. 전형적으로, 이것은 세포주기 내에서 형광 staling으로 시각적으로 나타나고, 이어서 핵에 대한 극적인 형태학적 변화가 뒤따르며, 이는 리포터가 핵6에 국한되어 있기 때문에 명확하게 볼 수 있습니다. 이를 통해 시간이 지남에 따라 단일 세포의 각 단계를 시각적으로 식별할 수 있습니다(그림 2). 가역적 전기천공법은 세포 내 조건의 변화를 일으키고 조사를 위해 180V 지수 붕괴 펄스가 선택되었습니다. 이 펄스는 세포 사멸을 가능한 한 제한하는 동시에 대다수의 인구에서 전기천공을 보장하기 위해 선택되었습니다. 이는 6개의 포유류 세포주에 대한 최적의 전기천공법 펄스 매개변수를 조사한 선행 연구를 기반으로 결정되었습니다. 180V 펄스의 에너지 밀도는 최적의 transfection 파라미터보다 약간 낮았으며, 높은 poration7에서 더 나은 세포 생존율을 제공했습니다. 펄스의 효과는 PEF 적용 유무에 관계없이 티미딘 이중 블록을 사용하여 동기화되지 않은 세포와 S상 동기화된 세포에서 연구되었습니다(그림 3). 그 결과, 대조군에 비해 S와 G2의 평균 길이가 감소한 것으로 나타났습니다. 이는 S상이 PEF 노출에 민감하여 세포 주기가 더 빨라진다는 것을 나타냅니다. 이는 전기천공법 세포분석 시스템이 세포주기 연구를 위해 PEF의 전달과 장기 살아있는 세포 이미징을 결합할 수 있음을 보여주었습니다. 이 플랫폼을 사용하여 PEF에 대한 반응으로 세포주기를 통한 세포 진행을 관찰했지만, 이는 PEF 및 세포 배양에 대한 다양한 응용 분야 및 조건을 연구하는 데 유용한 도구입니다.

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프로토콜

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1. 세포 배양 준비

  1. 0.4cm 큐벳에 5μg의 플라스미드 DNA가 있는 100μL의 재현탁된 U2 OS 세포(6 × 106 cells/mL) 및 10ms 동안 180V 구형파 펄스를 사용하여 가역적 전기천공법을 사용하여 안정적인 라인을 준비합니다.
  2. 적절한 3D 프린터와 폴리락트산(PLA)과 같은 생체 적합성 플라스틱을 사용하여 맞춤형 챔버 설계를 D-프린팅합니다( 보충 파일 1 참조). 완성된 챔버는 에탄올(70%)을 사용하여 소독하고 사용하기 전에 멸균 용기에 보관하십시오.
  3. 10% 소 태아 혈청과 1% 펜스트렙을 함유한 Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM)-High Glucose 10mL와 함께 10cm 플레이트에 U2-OS FUCCI(CA)5 세포를 배양하고 37°C 및 5% CO2에서 배양합니다.
  4. 배양액이 80% 포화도에 도달하면 배지를 흡인하고 PBS(Phosphate-buffered Saline)로 세포 배양액을 세척한 다음 1.5분 동안 0.25% 트립신 1mL를 사용하여 세포를 해리합니다.
  5. 5mL의 DMEM-High Glucose(10% FBS 및 1% PenStrep 함유)에서 세포 배양을 재현탁하여 트립신을 중화합니다.
  6. 재현탁된 세포 배양액에서 100μL 샘플을 얻어 하단 유리 커버슬립의 전기천공법 세포 분석 시스템 챔버에 넣습니다. 샘플을 도입한 후 챔버가 30% 합류하는지 확인하십시오. 배양 전에 샘플이 과도하게 유입되는 것으로 보이면 샘플을 흡입하고 샘플 부피를 줄이십시오.
  7. 천천히 4mL의 DMEM-High Glucose(10% FBS 및 1% PenStrep 함유)를 챔버의 맨 끝에 첨가하여 액체가 샘플에서 흘러나오는 것을 방지합니다.
  8. 챔버 상단에 표준 현미경 슬라이드를 놓고 24시간 동안 37°C 및 5% CO2 에서 챔버를 배양하여 배양액이 챔버 바닥에 완전히 부착되었는지 확인합니다. 선택적으로 Hoechst 33342(1 μg/mL)를 사용하여 세포핵을 염색하면 다운스트림 세포를 보다 쉽게 정량화하고 세포사멸을 수행할 수 있습니다. 타임랩스 현미경 검사 30분 전에 염색을 수행합니다.

2. 현미경 준비

  1. 먼저, 환경 제어 장치와 챔버가 있는 도립 형광 현미경을 켜서 전기천공법을 수행하기 전에 조건이 안정화될 수 있도록 합니다.
    참고: 25mm x 55mm x 16mm 챔버 슬라이드를 수용할 수 있는 환경 시스템이 있는 모든 도립 형광 현미경. 이 설계는 원래 참조된 도립 현미경( 재료 표 참조) 및 해당 환경 시스템에서 작동하도록 설계되었습니다.
    스테이지를 가열하면 금속 팽창으로 인해 이미지가 드리프트될 수 있습니다.
  2. 환경 시스템이 최적의 온도에 도달하는 동안 적절한 전기 케이블을 사용하여 디지털 멀티미터를 펄스 발생기 커패시터 및 고전압 스위치에 연결합니다. 이 프로토콜을 따르려면 "앨리게이터" 클립 케이블을 사용하여 전기천공설 챔버로 빠르게 조립 및 분해할 수 있습니다.
  3. 다음으로, 20배 배율 을 선택하고 현미경의 소프트웨어를 사용하여 FUCCI(CA)5 시스템의 두 형광 단백질에 해당하는 FITC(GFP) 및 A594(TexRed/mCherry) 채널(선택적으로 Hoechst 33342의 경우 DAPI 채널) 이 선택되었는지 확인합니다. 저노출 설정 (일반적으로 <0.05초)을 사용하여 장시간의 타임랩스로 인한 사진 손상을 방지합니다.
  4. 타임랩스를 시작하기 전에 테스트 이미지를 촬영하여 이미지 초점과 품질을 최적화합니다.
    참고: 형광은 색상 시각화에 필요한 만큼만 밝아야 합니다.
  5. 24시간 동안 10분마다 3 - 6개의 시점을 캡처하도록 타임랩스를 프로그래밍하여 사진 손상을 완화하면서 타임랩스당 많은 양의 세포 주기 데이터를 얻을 수 있습니다.
    참고: 시간의 길이는 세포 활동의 시간 척도에 따라 달라질 수 있습니다.
  6. 타임 랩스 동안 세포 배양을 추적하는 최상의 결과를 위해 A594 채널에 대해 자동 초점이 활성화되어 있는지 확인하십시오.
  7. electroporation이 수행될 때까지 소프트웨어를 대기 모드로 둡니다. 펄스가 전달되면 즉시 타임 랩스를 활성화하여 가능한 최고의 데이터 정확도를 보장합니다.

3. Electroporation

  1. electroporation cytometry 챔버를 적절한 환경 챔버가 있는 현미경에 놓습니다. 전기천공법을 주입하기 전에 세포 주기가 영향을 받지 않도록 환경 시스템을 작동 중인 상태에서 챔버를 닫은 상태로 두십시오.
  2. 펄스 발생기에 디지털 멀티미터를 부착하고 환경 챔버를 열어 앨리게이터 클립 케이블을 사용하여 펄스 발생기를 챔버 전극에 연결합니다.
  3. 펄스 발생기의 커패시터를 180V로 충전하고 디지털 멀티미터가 0볼트를 읽을 때까지 펄스를 챔버로 빠르게 방전합니다.
  4. 챔버에 대한 전기 연결을 제거하고 가능한 한 빨리 뚜껑을 교체하여 적절한 배양 조건을 보장하십시오.
  5. 현미경 환경 시스템이 설치되면 즉시 타임랩스를 활성화하십시오.

4. 타임랩스 데이터 수집

  1. 타임랩스가 완료된 후 현미경 소프트웨어를 사용하여 타임랩스 길이에 걸쳐 캡처된 이미지를 기반으로 타임랩스를 단일 비디오로 저장합니다. 이 단계에서 시각적 품질을 개선하여 수동 정량화를 지원합니다.
    참고: 모든 프레임 속도를 선택할 수 있습니다. 그러나 6 frames/s는 1 비디오 초로 1시간의 실시간을 생성하는 적당한 재생 속도를 제공합니다.
  2. 타임랩스 비디오가 준비되면 FITC 및 A594 신호의 변화를 관찰하여 시간 경과에 따른 세포상을 추적합니다

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결과

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FUCCI 시스템(그림 2)을 사용하여 단백질 발현 및 비퀴틴화(unbiquitination)의 결과로 세포에서 각 색상이 발현되는 시간을 측정하여 시각적 세포 주기 데이터를 얻었습니다. 비동기식 및 동기화된 실험의 결과를 바탕으로 (그림 3) S상 PEF 노출이 세포 주기를 상향 조절하는 것이 분명했습니다. 이는 평균 상 길이의 감소로 입증되었으며, 이는 세포 주기가 더 빠르다는 것을 나타냅니다. 또한, 그것은 또한 세포주기에 대한 thymidine의 장기적인 효과를 입증했다. 동기화된 집단에 대한 대조군 데이터는 동기화되지 않은 집단에 비해 평균 세포 주기가 더 긴 것으로 나타났습니다. 반대로, S-위상 동기화된 집단이 펄스된 후 평균 세포주기 길이는 비동기 대조군과 비슷했습니다.

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토론

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올바르게 수행되면 최대 24시간 동안 많은 양의 단일 세포에 대해 세포 주기 데이터를 정량화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 FAC과 같은 대체 방법과 비교할 수 있는 세포주기 데이터를 산출했습니다. 이것은 세포가 세포주기를 통해 진행됨에 따라 형광 표지를 받는 일반적으로 사용되는 방법입니다. 최소 24 시간 동안 배양 한 후, 그들은 특정 단계8의 개체군 수와 관련된 형광 강도에 따라 분류됩니다. 이 방법을 사용한 이전 연구에서는 U2 OS 세포가 약 23-24시간 내에 세포 주기를 수행한다는 것을 보여주었습니다9. 이는 FUCCI(CA)5 시스템을 사용한 결과와 일치했으며, 현재 프로토콜이 기존의 세포주기 보고 기술과 유사한 정확도를 복제할 수 있음을 나타냅니다.

이 프로토콜은 U2 OS 셀의 사용을 간략하게 설명하지만, FUCCI...

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공개 사항

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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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실험실 안팎에서 지속적인 지원을 해주신 Gupta Lab과 Rackus Group 구성원 모두에게 감사드립니다. Mitacs와의 파트너십을 통해 아낌없이 제공되는 보조금 자금.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
챔버 슬라이드(3D 프린팅/조립) N/AN/A
배양 플레이트(10 cm)Sarstedt83.3902
Delta VisionOlympusN/A대체 현미경 모델도 사용할 수 있습니다. 스테이지 및 환경 시스템이 전기천공 챔버슬라이드(55mm x 
DMEM – 고포도당Gibco11965092
태아 소 혈청 써모피셔A5256701 
i3 MK3S 3D 프린터PrusaN/ASTL 파일을 사용할 수 있는 대체 프린터 모델을 사용할 수 있습니다. 
펜 연쇄상구균ThermoFisher15070063
인산염 완충 식염수Gibco10010031
tFUCCI(CA)5Addgene153521
트립신Sigma-Aldrich9002-07-07
U2-OS 세포주ATCCHTB-96

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
  2. Kandušer, M., Miklavčič, D. Electroporation in biological cell and tissue: An overview. Electrotechnologies for extraction from food plants and biomaterials. Food Engineering Series. , Springer. New York. (2009).
  3. Cemazar, M., Sersa, G. Recent advances in electrochemotherapy. Bioelectricity. 1 (4), 204-213 (2019).
  4. Iyengar, S. K., Iyengar, S., Srivathsan, K. The promise of pulsed field ablation and the challenges ahead. Front Cardiovasc Med. 10, 1235317(2023).
  5. Miklavčič, D., Mali, B., Kos, B., Heller, H., Serša, H. Electrochemotherapy: From the drawing board into medical practice. Biomed Eng Online. 13 (1), 29(2014).
  6. Ando, R., Sakaue-Sawano, A., Shoda, K., Miyawaki, A. Two coral fluorescent proteins of distinct colors for sharp visualization of cell-cycle progression. Cell Struct Funct. 48 (2), 132-144 (2023).
  7. Nesmith, T., Vieira, C., Rackus, D., Gupta, G. An electroporation cytometry system for long-term, live cell cycle analysis. Biomicrofluidics. 18 (4), 044105(2024).
  8. Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166 (3906), 747-749 (1969).
  9. Chao, H. X., et al. Evidence that the human cell cycle is a series of uncoupled, memoryless phases. Mol Sys Bio. 15 (3), e8604(2019).
  10. Diehl, F. F., Sapp, K. M., Vander Heiden, M. G. The bidirectional relationship between metabolism and cell cycle control. Trends Cell Bio. 34 (2), 136-149 (2024).
  11. Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382(2013).
  12. Klein, S. G., et al. Toward best practices for controlling mammalian cell culture environments. Front Cell Dev Bio. 10, 788808(2022).

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