방법 논문

복잡한 분변 군집의 지속적인 배양을 위한 Bioreactor Assembly

DOI:

10.3791/68035

⸱

2025년 4월 25일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Florida College of Medicine, 2Department of Medicine, Department of Infectious Diseases and Immunology, Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 혐기성 조건에서 복잡한 배설물 군집의 연속 유동 배양에 활용되는 미니 생물반응기 어레이의 조립에 대해 자세히 설명합니다. 또한 추가 분석을 위해 반응기의 조립, 접종 및 샘플링 방법에 대해서도 논의합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

미생물총(microbiota), 특히 박테리아는 미량 및 다량 영양소, 약리학적 화합물 및 염증 매개체와 같은 다양한 환경 노출에 반응하여 군집 구성과 미생물 대사 산출량을 동적으로 변화시킵니다. 생리학적 배양 조건이 미생물 군집과 다양성 및 신진대사 능력에 미치는 영향을 이해하는 것은 건강과 질병에 미치는 영향에 대한 중요한 지식에 기여할 것입니다. 여기에서는 Auchtung et al.이 발표한 템플릿에서 채택된 프로토콜을 제시하여 복잡한 분변 군집을 배양하고 영양소 가용성, 온도, 유속, pH 및 산소 함량을 포함한 정확한 조건에서 박테리아 컨소시엄 또는 단일 균주를 정의할 수 있는 미니 생물반응기 어레이를 만듭니다. 우리는 발표된 프로토콜의 한계를 개선하기 위한 조정을 포함하여 미니 생물반응기 시스템을 구축하는 프로세스를 설명합니다. 또한 다양한 박테리아의 성장을 지원하는 풍부한 배지인 MEGA 배지(Han 등에서 수정)를 사용하여 혐기성 조건에서 미니 생물반응기 시스템을 설정하는 방법에 대해서도 논의합니다. 장내 인간화 마우스 배설물 샘플을 미니 생물반응기 시스템에 접종한 다음, 미니 생물반응기 시스템 내에서 복잡한 군집 배양을 확립하는 방법을 설명하며, 이는 군집 구성을 모니터링하기 위해 무균 샘플링을 통한 지속적인 흐름으로 성장할 수 있습니다. 이 시스템은 식단 변화 및 기타 문화적 수정에 적응할 수 있습니다. 여기에 설명된 기술을 사용하면 역동적인 조건 하에서 또는 숙주 유래 요인과 격리된 섭동에 반응하여 다양하고 까다로운 분변 군집을 특성화할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

장내 미생물총(microbiota)은 박테리아, 곰팡이, 고세균 및 바이러스를 포함한 미생물의 광대한 네트워크로, 인간 숙주보다 훨씬 더 많은 거대한 유전 및 대사 레퍼토리를 포함하고 있습니다1. 마이크로바이옴의 풍부한 대사 능력에는 식이 영양소의 박테리아 처리로 생성된 대사 산물, 박테리아에 의해 화학적으로 변형된 숙주 대사 산물, 미생물총(microbiota2)에 의해 고유하게 합성된 대사 산물이 포함됩니다. 미생물총(Microbiota)은 거의 모든 숙주 생물과정뿐만 아니라 염증성 장 질환, 암, 대사 장애, 심지어 신경 장애와 같은 질병 상태에도 관여합니다 2,3. 미생물총(microbiota)과 숙주(host)의 기여도를 해부하는 것은 건강과 질병에서 특정 미생물 또는 복잡한 군집의 역할을 이해하는 데 필수적입니다. 이러한 해부를 가능하게 하는 한 가지 접근 방식은 역동적인 조건에서 다양한 미생물 군집을 배양하는 미생물 생물 반응기를 사용하는 것입니다. 대규모 바이오 제품 배양 또는 대사 과정 연구를 위한 특정 영양 인자의 정확한 제어를 포함하여 거의 모든 목적으로 분변 박테리아 군집의 성장을 허용하는 상업적으로 이용 가능한 많은 생물 반응기가 있습니다. 그러나 이러한 시스템은 비용이 많이 들고 광범위한 준비가 필요하며 다양한 실험 조건을 병렬로 검사할 수 없습니다. 비용이 적게 들고 적응력이 뛰어나며 많은 병렬 조건을 허용하는 단순화된 접근 방식을 위해 Auchtung et al.4에서 채택한 연속 흐름 하에서 미니 생물 반응기 어레이의 설정 및 사용에 대한 프로토콜을 제시합니다.

미니 바이오리액터 시스템의 전체 설정은 그림 1A에 나와 있습니다. 이 미니 바이오리액터 시스템은 서로 완전히 독립적이며 연동 흐름의 혐기성 챔버에 설정된 6개의 반응기 웰 어레이를 사용하여 지속적인 매체 전달 및 제거가 가능합니다(그림 1A). 각 반응기 어레이는 60개 위치의 자기 교반 플레이트에 있으며, 소스 매체 및 폐기물 흐름을 위한 2스톱 튜빙을 유지하는 2개의 48개 카세트 연동 펌프가 있습니다(그림 1A). 혐기성 챔버에는 산소 함량을 측정하는 CAM-12 혐기성 모니터, 가열 용량으로 산소를 제거하는 촉매 상자, 박테리아 대사에서 과도한 가스를 흡수하는 황화수소 제거 컬럼이 장착되어 있습니다. 각 반응기 우물에는 소스 매체 유입구, 폐기물 배출구 및 샘플 포트가 장착되어 있어 각 개별 반응기 우물을 접종하거나 샘플링할 수 있습니다(그림 1B).

앞서 설명한 바와 같이, 바이오리액터 시스템은 온도, 매체 소비량 및 영양분 가용성을 동적으로 제어하여 분변 군집의 배양 및 유지를 지원합니다. 온도는 가열 용량이 있는 촉매 상자에 의해 조절되어 전체 혐기성 챔버의 온도 변화를 신속하게 구현할 수 있습니다. 매체 소비는 연동 펌프 유량에 의해 조절되며, 이는 반응기의 매체 회전율을 변경하기 위해 수정할 수 있습니다. 미디어 회전율은 반응기에서 배양되는 커뮤니티 유형에 맞게 사용자 정의할 수 있으며, 예를 들어 느리게 성장하거나 매우 빠르게 성장하는 표적 균주에 맞게 조정됩니다. 마지막으로, 영양분 가용성은 각 반응기 웰의 개별 샘플 포트를 통해 구성 요소를 추가하여 동적으로 수정할 수 있습니다. 실험 시작 시 수정할 수 있지만 시스템에서 동적 제어가 없는 정적 조건은 매체 유형, 산소 함량 및 동시 반응기 수입니다. 조사자는 원하는 소스 미디어를 구현하도록 선택할 수 있으며, 여기에 하나의 미디어가 설명되어 있지만 끝없는 다른 소스 미디어 유형이 성공적으로 구현되었습니다. 호기성 또는 미세호기성 조건에서 반응기를 작동할 수 있습니다(미호기성 챔버의 가용성에 따라 다름). 마지막으로, 연구자의 실험 요구에 따라 필요한 만큼 많은 반응기를 설정할 수 있습니다. 반응기는 어레이 내에서 6개의 세트로 되어 있지만 각 반응기는 다른 반응기와 독립적으로 작동하며 원하는 경우 각각 다른 소스에 연결할 수 있습니다.

이 모듈식 바이오리액터 시스템은 약 $25,000(혐기성 챔버 또는 챔버별 구성 요소 제외)로 완전히 설정할 수 있으며, 재사용할 수 없는 유일한 부품은 시스템 실행당 $100 미만으로 교체할 수 있는 튜빙입니다. 이 시스템은 대부분 자동화되어 있지만 배지 소스 병이 비어 있을 때 교체해야 하므로 미디어 레벨을 매일 확인해야 합니다. 또한 모든 샘플링은 수동으로 완료해야 하며 시스템에 대한 동적 조건부 변경은 수동으로 시작해야 합니다(예: 온도 변경). Auchtung et al.이 발표한 원래 시스템 프로토콜에서 전반적인 성능과 유용성4을 개선하기 위해 몇 가지 수정 사항이 구현되었습니다. 첫째, 생물 반응기 어레이의 3D 프린팅 재료는 ABS와 같은 반투명 투명 플라스틱으로 수정되어 반복되는 고압증기멸균을 통해 시스템의 구조적 무결성을 향상시킵니다. 또한 1/8인치(3.2mm) OD PTFE 튜빙 대신 E-LFL, 2.06mm ID, 100피트 튜빙이 대신 사용되는데, 이는 붕괴에 더 강하여 시스템의 흐름을 막을 수 있는 더 견고한 소재로 인해 사용됩니다. 마지막으로, 1/4 -28mm 나사산을 사용하여 미늘 수 어댑터에 추가 피팅을 사용하여 매체 소스 병에서 튜브 미끄러짐의 변화를 줄입니다. Han et al.에 따르면, 적응된 MEGA 배지 레시피는 까다로운 혐기성 미생물의 배양을 가능하게 하는 정의되지 않고 복잡하며 매우 풍부한 배지를 제공합니다5. 배지는 원본이 더 이상 상업적으로 이용 가능하지 않기 때문에 히스티딘-헤마틴 성분의 대체 제제를 활용하도록 수정됩니다. 수산화나트륨은 매체를 7.0 또는 원하는 pH로 pH하는 데에도 사용됩니다. 전반적으로 이 시스템은 예산이 저렴하고 사용자 친화적이며 최적화되어 있으며 연속 유동 배양 시스템의 훌륭한 진입점입니다.

이 프로토콜에서는 재료, 시스템 멸균 및 장내 인간화 쥐 배설물 샘플의 배양을 위한 후속 사용을 포함하여 이 미니 생물 반응기 어레이 시스템의 설정에 대해 자세히 설명합니다. 이 방법의 전반적인 목표는 통제된 조건에서 미생물 군집을 배양하는 데 사용할 수 있는 적응 가능하고 비용 효율적인 생물 반응기 시스템을 구축하는 것입니다. mini-bioreactor 시스템 조립을 위한 워크플로우의 자세한 개략도는 그림 2 에 나와 있으며 프로토콜 내의 적절한 단계에서 참조됩니다. 이 예에서는 인간화된 장내 마우스의 동일한 배설물 샘플로 두 개의 반응기에 접종하고 MEGA 배지의 연속적인 흐름 하에서 미생물 군집 구조를 설명합니다.

figure-introduction-1
그림 1: 혐기성 챔버에서 mini-bioreactor 어레이 설정의 개략도. (A) 혐기성 챔버에서 완료된 mini-bioreactor 어레이 설정의 전체 보기. 6웰 바이오리액터 어레이는 60개 위치 마그네틱 교반 플레이트에 위치합니다. 소스 루어 티 네트워크는 두 개의 구멍이 있는 병 뚜껑을 통해 왼쪽의 소스 미디어에 연결됩니다. 두 개의 연동 펌프가 각각 왼쪽과 오른쪽의 소스 및 폐기물 네트워크에서 2스톱 튜빙을 고정합니다. waste luer 티 네트워크는 오른쪽에 있는 쓰레기통으로 비워집니다. CAM-12 모니터, 가열 용량이 있는 촉매 상자 및 황화수소 제거 컬럼을 포함한 혐기성 챔버 작동을 위한 필수 장비는 어레이 시스템 주변의 챔버 내에 배치됩니다. (B) 상단 view 반응기의 적절한 높이에 매체가 있는 하나의 반응기 웰에 부착된 소스, 샘플 및 폐기물 포트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-introduction-2
그림 2: mini-bioreactor array assembly workflow의 개략도. (A) 미니 생물반응기 어레이의 하향식 보기, 공급원, 폐기물 및 샘플 포트의 방향을 보여줍니다. (B) 프로토콜의 단계 2.3-2.4를 보여주는 보기가 있는 미니 생물반응기 어레이의 측면 모습. 1/8인치 PTFE 튜브와 피팅(1)이 부착되어 폐기물 및 샘플 포트에 삽입됩니다. PTFE가 없는 피팅(1)이 소스 포트에 삽입됩니다. (C) 프로토콜의 2.5-2.6단계를 보여주는 미니 생물반응기 어레이의 측면도. 피팅(2)은 소스 및 폐기물 포트에 부착됩니다. 샘플 포트에 피팅(3)이 부착되고 그 위에 피팅(4)이 삽입됩니다. (D) 2.9-2.11단계를 보여주는 미니 생물반응기 어레이의 측면 모습. E-LFL 2.06mm 튜빙은 소스 및 폐기물 포트에 연결되고 다른 쪽 끝은 피팅 (5)에 연결된 다음 (6)에 연결됩니다. 그런 다음 적절한 직경의 2스톱 튜빙을 피팅(6)에 연결합니다. 그런 다음 2스톱 튜빙의 끝에서 역 연결을 반복하여 피팅(6)을 2스톱 튜빙에 연결하고 피팅(5)을 2스톱 튜빙에 연결합니다. 마지막으로, E-LFL 2.06mm 튜빙은 루어 티 네트워크에 연결하기 위해 피팅 (5)에 연결됩니다. (E) 2.12-2.15 단계에 설명된 소스 및 폐기물 루어 티 네트워크 설정을 표시하는 미니 생물 반응기 어레이의 하향식 보기. 피팅 (5)로 끝나는 E-LFL 2.06mm 튜브는 각 반응기를 여러 피팅 (7)에 연결하는 데 사용되며, 마지막 개구부는 소스 또는 폐기물 병의 캡에 연결됩니다. (F) 측면 view 2.16-2.17단계에 설명된 두 개의 구멍 병뚜껑 어셈블리. 캡의 한 구멍은 병 내부에 있는 PTFE 튜브에 연결됩니다. 이 개구부에는 피팅(1)이 삽입된 후 피팅(2)과 피팅(5)에 연결된 E-LFL 2.06mm 튜빙이 삽입됩니다. 이 피팅은 소스 또는 폐기물 루어 네트워크에 연결됩니다. PTFE 튜빙에 연결되지 않은 개구부에 피팅(1)을 삽입한 다음 피팅(2)을 삽입하고 E-LFL 2.06mm 튜빙을 다른 피팅(5)에 연결합니다. 이 끝단은 멸균 0.22μM 주사기 필터에 나중에 부착할 수 있도록 오토클레이브 멸균 중에 호일로 덮여 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에 사용된 배설물 샘플은 플로리다 대학교(University of Florida, UF)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에서 승인한 실험에서 얻어졌으며 UF 동물 보호 시설(IACUC 프로토콜 #IACUC202300000005)에서 수행되었습니다. 간단히 말해서, 혼합 성별 무균 야생형(GF WT; C57BL/6) 마우스(UF Animal Care Services Germ-free Division에 의해 아이솔레이터에서 사육 및 유지됨)를 번식 아이솔레이터에서 옮겨 ISOcage P 생물배제 시스템에 넣어 미생물 조작을 허용했습니다. 인간 기증자 배설물로부터의 동등한 집락 형성 단위(CFU)를 모아 쥐에 주입하였다. 접종 2주 후, 이 마우스에서 배설물 샘플을 무균 상태로 수집하여 보관하고 이 프로토콜에서 후속 사용했습니다.

참고: 여기에 설명된 배설물 샘플 수집 및 준비는 수집된 샘플의 유형(인간, 생쥐, 기타 동물)과 이러한 샘플의 보관에 따라 이 절차가 크게 다를 수 있으므로 적절한 절차의 예시일 뿐입니다. 개인은 개별 연구자의 필요에 따라 대변 샘플 수집 및 보존을 위한 프로토콜을 설계하기 위해 적절한 문헌을 참조해야 합니다.

1. -80 °C 보관을 위한 배설물 샘플의 일반적인 준비

  1. 혐기성 생존도 보존 배지를 선택합니다(여기서는 Cary Blair를 사용했습니다). 보존 배지 1mL를 멸균에 분취하고 생물 안전 캐비닛에 있는 캡 2mL 튜브를 조인 다음 혐기성 챔버로 옮깁니다.
  2. 배설물 샘플을 받기 전에 모든 공급품(오토클레이브 주걱, 멸균 식염수 및 보존 매체가 들어 있는 나사 캡 극저온 바이알)이 혐기성 챔버에서 24시간 동안 미리 감소되었는지 확인하십시오.
  3. 오토클레이브 대변 수집 컵과 겸자를 사용하여 생물 안전 캐비닛의 멸균 스냅 캡 튜브를 사용하여 마우스의 대변 샘플을 무균 상태로 수집합니다. 채취 즉시 튜브를 액체 질소로 급속 동결합니다.
  4. 시료를 즉시 혐기성 챔버로 옮기고 칭량을 위한 휴대용 저울과 함께 사용하십시오. 각 튜브의 무게를 미리 측정합니다. 쥐 배설물 샘플의 경우, 튜브당 별도의 배설물 펠릿을 분주할 수 있습니다. 인체 샘플을 사용하는 경우 멸균 주걱을 사용하여 각 샘플을 저어주고 극저온 바이알로 균등하게 나눕니다. 각 튜브의 무게를 다시 잰 후 최적의 보존을 위해 각 튜브에 1:10 배설물 배지(질량: 질량)의 예상 비율로 배지를 추가합니다.
    참고: 대변 샘플의 즉각적인 혐기성 보존은 수집 후 권장됩니다. 즉시 보존되지 않은 샘플은 새로 보존된 샘플 6,7,8에 비해 생존력, 조성 변화 등이 감소할 수 있습니다. Cary Blair 보존 배지는 박테리아 군집의 생존력을 유지하면서 추가 성장을 억제하며 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 대변에 대한 보존 매체의 추정 비율에 대해 대변 샘플의 젖은 무게는 매우 다양하지만 이것이 사용 가능한 최상의 추정치입니다.
  5. 라벨을 붙이고, 밀봉하고, 혐기성 챔버에서 바이알을 제거하고, 액체 질소로 플래시를 동결하고, -80 °C에서 최대 1년 이상 보관합니다.

2. 6웰 반응기 어레이 구축

  1. CAD 파일(보충 파일 1)을 사용하여 6웰 반응기의 3D 프린팅을 수행합니다. 이 파일은 생산을 위해 모든 3D 프린팅 회사에 제출할 수 있습니다. ABS와 같은 반투명 투명 플라스틱을 인쇄 재료로 사용하여 반응기를 통해 시각화할 수 있으며 반복적인 오토클레이브 주기에 대한 내성을 갖습니다.
    참고: 우리는 6웰 반응기 어레이를 광조형을 통해 AB와 같은 반투명 투명 플라스틱으로 만들도록 의뢰했습니다. 생산 시 어레이를 기울이는 것이 좋으며(즉, 부품을 30%-45% 각도로 3D 프린팅) 치수 부정확성을 줄이는 것이 좋습니다. 이 보정으로 인해 어레이를 가로질러 대각선으로 이어지는 눈에 띄는 레이어 라인이 생성되지만 반응기의 성능에는 영향을 미치지 않습니다.
  2. 25-28mm 태핑 도구를 사용하여 반응기 어레이의 각 개구부에 나사산을 삽입합니다.
  3. 12/25인치 PTFE 튜빙에서 1, 8mm 스트립을 자르고 튜빙의 각 세그먼트의 한쪽 끝을 25-28 나사산 피팅에 대한 수 루어의 나사산 개구부에 삽입합니다. 피팅을 지정된 폐기물 및 s에 단단히 나사로 고정합니다.amp어레이의 개구부(그림 2B).
    알림: 면도날을 사용하여 튜브의 끝을 원뿔 모양의 구성으로 가볍게 면도하여 튜브가 삽입에 더 잘 맞도록 할 수 있습니다.
  4. 반응기의 각 반응기 웰에 마이크로 교반 막대를 삽입한 다음 각 반응기 웰의 소스 구멍에 맞는 수 1/4-28 나사산을 나사로 조입니다(그림 2B).
  5. 암 루어 x 1/8인치 호스 미늘 어댑터 피팅을 각 반응기 우물의 폐기물 및 공급원을 위한 1/4-28 나사 피팅에 나사로 고정합니다(그림 2C).
  6. 암 luer x 3/32인치 호스 미늘 어댑터 피팅을 샘플 포트용 1/4-28 나사 피팅에 나사로 고정합니다. 3/32인치 호스 미늘 어댑터 위에 고무 격막을 놓고 상단을 접습니다(그림 2C).
  7. 폐기물 및 소스 라인에 대해 14cm, 15.25cm, 16.5cm, 17.75cm, 19cm 및 20.25cm 길이로 E-LFL, 2.06mm 튜브 두 세트를 자릅니다.
    참고: 중간 부분을 감싼 컬러 라벨 테이프를 사용하여 튜브의 각 길이를 식별할 수 있습니다.
  8. 소스 및 폐기물 연결을 위해 E-LFL 2.06mm 튜브를 암 루어 1/8인치 호스 바브 어댑터 피팅에 연결합니다(그림 2D). 뜨거운 물을 사용하여 튜브를 더 가단성으로 만드십시오. 이렇게 하면 튜브가 어댑터에 쉽게 맞을 수 있습니다.
  9. 잠금 링 x 1/8인치 호스 미늘 어댑터 피팅이 있는 수 루어를 튜브의 다른 쪽 끝에 부착합니다. 여기에 맞는 암 루어 x 1/16인치 호스 미늘 어댑터를 나사로 조입니다(그림 2D).
  10. 적절한 크기의 2-stop 튜빙을 해당 폐기물 및 소스 연결부에 연결합니다. 폐기물 라인은 1.14mm ID 2스톱 튜빙을 사용하는 반면, 소스 라인은 1.02mm ID 2스톱 튜빙을 사용합니다. 2-스톱 튜빙의 다른 쪽 끝에 다른 암 루어 x 1/16인치 호스 바브 어댑터 피팅을 부착합니다(그림 2D).
  11. E-LFL 20, 5cm 조각, 2.06mm 튜브를 자르고 잠금 링 x 1/8인치 호스 미늘 어댑터 피팅이 있는 수 루어를 각 튜브의 양쪽 끝에 삽입합니다. 잠금 링이 있는 수 루어 x 1/8인치 호스 미늘 어댑터 피팅이 있는 5cm 튜브의 한쪽 끝을 각 1스톱 튜빙 섹션의 끝에 있는 비어 있는 암 루어 x 16/2인치 호스 미늘 어댑터 피팅에 연결합니다. 나머지 19개의 튜빙 조각에 대해 이 과정을 반복합니다(그림 2D).
  12. 암 루어 티의 반대쪽 끝을 사용하여 반응기 웰 2.06 및 1의 소스 라인용 E-LFL, 2mm 튜브를 연결합니다. 양쪽 끝에 잠금 링이 있는 수 루어 x 5/1인치 어댑터 피팅이 있는 8cm 튜브 조각 중 하나를 티의 중간 배출구에 연결하여 두 번째 티 접합부로 연결합니다(그림 2E).
  13. 세 번째 반응기용 E-LFL, 2.06mm 소스 튜브를 두 번째 티의 반대쪽에 연결합니다. 잠금 링 x 1/8인치 어댑터가 있는 수 루어가 있는 또 다른 5cm 튜브는 한쪽 끝에 부착되어야 하고 다른 쪽 끝에는 잠금 링 x 1/8인치 어댑터가 부착된 암 루어가 있어야 합니다. 반응기 4, 5 및 6에 대해서도 동일한 패턴을 따릅니다(그림 2E).
  14. 25cm E-LFL, 2.06mm 튜빙 조각을 자르고 잠금 링이 있는 수 루어 x 1/8인치 호스 미늘 어댑터 피팅을 튜브의 한쪽 끝에 부착하여 마지막으로 남아 있는 암 루어 티 접합부에 부착하고 다른 쪽 끝에는 암 루어 x 1/8인치 호스 미늘 어댑터 피팅을 부착합니다. 이 끝을 알루미늄 호일로 덮습니다(그림 2E).
    참고: 작동 중에는 열린 끝을 멸균 상태로 유지하는 것이 중요하므로 고압증기멸균 중에는 호일로 뚜껑을 덮고 테이프로 제자리에 고정하는 것이 좋습니다.
  15. 2.12-2.14 단계(그림 2E)에 설명된 소스 라인과 동일한 절차를 반복하여 폐기물 라인을 준비합니다.
  16. 쓰레기 수거 병을 조립하려면 2L 병에 두 개의 구멍이 있는 병 뚜껑을 느슨하게 고정합니다. 캡의 양쪽 구멍에 수 1/4-28 나사 피팅을 삽입합니다. 캡에 미리 부착된 PTFE 튜브에 연결되지 않은 수나사 피팅에 1/8인치 호스 미늘 어댑터가 있는 암 루어를 부착합니다(그림 2F).
  17. 그런 다음 5cm 길이의 E-LFL 2.06mm 튜브를 잘라 병의 호스 바브 어댑터에 연결합니다. 잠금 링 x 1/8인치 호스 미늘 어댑터가 있는 수 루어를 5cm 튜브의 다른 쪽 끝에 부착하고 호일로 덮습니다(이 튜브는 통풍구 역할을 합니다. 고압멸균 후 오염을 방지하기 위해 0.22μm 주사기 필터가 추가됩니다. 그림 2F).
  18. 캡 전체를 알루미늄 호일로 덮습니다. 일반적으로 액체에 대해 설정되는 저속 배기 프로그램을 사용하여 121°C 및 최소 15psi에서 45분 동안 반응기와 폐기물 용기를 오토클레이브합니다. 반응기가 냉각되면 피팅과 알루미늄 호일 씰을 조이고 사용하기 전에 48시간 동안 혐기성 챔버에 놓습니다.

3. MEGA 배지 준비

  1. 보충표 1, 보충표 2, 보충표 3, 보충표 4, 보충표 5, 보충표 6, 보충표 7, 보충표 8에 따라 모든 원액을 준비합니다.
  2. 2L 유리병에 보충 표 9의 모든 건조 성분을 넣은 다음 초순수 1640mL, 나머지 보충 표 10 액체 성분을 추가합니다. 교반 막대를 넣고 교반 플레이트에 중불(90°C)로 완전히 녹입니다. 미디어는 옅은 파란색에서 보라색이며 완전히 투명하지는 않지만 명백한 용해되지 않은 덩어리가 없습니다.
    참고: 펩타이드가 있는 상태에서 포도당 및 기타 설탕을 오토클레이브하면 변형이 발생할 수 있으며 배지에서 사용 가능한 설탕을 낮출 수 있습니다. 원하는 경우, 모든 설탕 용액을 멸균 여과하고 단계 3.7에 설명된 바와 같이 보충 표 10의 성분과 함께 첨가할 수 있습니다.
  3. 완전히 혼합되면 10N 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하여 매체의 pH를 7.0으로 조정하고 정확히 얼마나 많은 부피가 추가되었는지 측정합니다. pH 측정 후 물 14.4mL에서 수산화나트륨의 부피를 뺀 부피를 첨가하여 부피를 정확히 2L로 가져옵니다.
  4. 양쪽 구멍에 1/4-28mm 나사산 피팅을 삽입하여 두 구멍이 있는 병 뚜껑을 준비합니다.
  5. PTFE 튜빙에 미리 부착되지 않은 캡 구멍에서 5cm C-flex 튜빙 조각을 잘라 암 루어 피팅의 1/8인치 호스 바브에 연결합니다. 5cm 튜브의 다른 쪽 끝에 잠금 링과 1/8인치 호스 미늘 어댑터가 있는 다른 수형 루어를 삽입하고 호일로 덮습니다(0.22μM 주사기 필터에도 연결됨).
  6. 뚜껑 전체를 알루미늄 호일로 덮고 2L MEGA 미디어 병 위에 나사로 고정합니다. 121°C 및 최소 15psi에서 45분 동안 액체용 저속 배기 프로그램을 사용하여 오토클레이브합니다.
  7. 오토클레이브에서 미디어를 제거하고 미지근해질 때까지 저어주면서 식히십시오. 보충 표 10 의 성분을 생물 안전성 캐비닛의 2L 배지 병에 추가하고 뚜껑을 밀봉한 다음 교반 플레이트로 이동하여 균질화합니다. 매체가 냉각되면 피팅과 알루미늄 호일 씰을 조이고 사용하기 전에 48시간 동안 혐기성 챔버에 놓습니다.
    참고: 소스 펌프를 16μL/분(0.94mL/h)으로 16시간 유지 시간 동안 실행하는 것이 좋습니다. 이 유속을 위해 6웰 반응기는 하루에 약 0.135L의 매체를 사용합니다. 또한 폐기물 튜브에 막힘이 형성되는 것을 방지하기 위해 폐기물 펌프를 40μL/분으로 가동하는 것이 좋습니다. 튜브와 흐름을 모니터링하고 막힘이 발생할 경우 폐기물 흐름을 적절하게 늘릴 수 있습니다. 원천과 폐기물 유속은 모두 수정할 수 있지만, 조사관은 더 빠르거나 느린 흐름에 따라 변경될 수 있으므로 군집 구성과 성장률을 주의 깊게 모니터링해야 합니다. 6웰 반응기를 일주일 동안 가동하려면 최소 2L의 매체를 만드는 것이 좋습니다(1L보다 약간 더 많이 소비함).

4. 혐기성 챔버의 어레이 설정

알림: 후드와 후드 장갑 내부를 3% 과산화수소로 청소한 다음 조립 전에 표면 오염이 없는지 확인하기 위해 삼중 탈이온수 헹굼을 하는 것이 중요합니다. 호일을 제거한 후 신속하게 연결하고 피팅 내부 및 혐기성 챔버 장갑과 직접 접촉하지 않으면 오염 가능성이 최소화됩니다

  1. 혐기성 챔버의 자기 교반 플레이트 위에 어레이를 정렬합니다. 교반 플레이트 컨트롤러를 최대 속도(1600rpm)로 설정하고 교반 막대가 회전하는 것을 관찰하여 어레이가 올바르게 정렬되었는지 확인합니다.
  2. 소스와 폐기물에 대한 2-stop 튜브를 장착하십시오.amp해당 연동 펌프의 s. 의도한 사용 전 24시간 이내에 이 작업을 수행하는 경우 cl을 잠급니다.amps 제자리에 있습니다. 그렇지 않으면 튜브의 마모를 줄이기 위해 사용할 준비가 될 때까지 느슨하게 두십시오.
  3. 소스 및 폐기물 라인의 암 루어 x 1/8인치 호스 미늘 어댑터 피팅의 호일 캡을 제거하고 캡에 나사로 고정된 1/4 -28 위협 피팅에 수 루어에 나사로 고정합니다(이 구멍이 내부 PTFE 튜브에 연결되어 있는지 확인).
  4. 호일 캡을 제거하고 0.22μm 주사기 필터를 소스 병의 5cm 통풍구와 폐병의 통풍구에 부착합니다.
  5. 적당한 속도(소스 펌프에서 1mL/분, 폐기물 펌프에서 2mL/분)로 흐름을 시작하여 반응기 충전을 시작합니다. 각 반응기 우물의 폐기물 라인 튜브가 소스 튜브의 튜브보다 낮은지 확인하여 각 우물의 과충전 또는 비우기를 방지합니다.
  6. 반응기가 채워지기 시작하면 모든 반응기가 동일한 부피에 도달하고 매체가 폐기물 라인으로 흘러 들어가는지 확인하십시오. 여기에 설명된 측정으로 각 반응기의 작업 부피는 15mL입니다.
    알림: 개별 반응기가 채워지지 않으면 느슨한 피팅을 조이고 소스 라인에 문제가 있는지 검사하고 필요한 경우 준비된 추가 반응기로 교체하십시오. 문제가 지속되면 가능한 경우 소스 병을 교체하십시오. 중간 수준이 반응기의 내부 폐기물 라인 위로 올라가면 반응기 폐기물 포트 내부의 PTFE 튜브가 여전히 제자리에 있는지 검사합니다.
  7. 각 반응기가 채워진 후 펌프 설정을 16μL/min 유속으로 조정한 다음 펌프를 끕니다.
  8. 접종 전에 배지를 반응기와 폐기물 병에 밤새 그대로 두십시오. 이를 통해 매체의 추가 혐기성 컨디셔닝이 가능하고(총 ~72시간 동안) 사용자가 시스템의 멸균 상태를 확인할 수 있습니다.
  9. 분변 시료 접종 전에 시스템의 멸균 상태를 확인하려면 초기 주입(단계 4.7) 직후와 단계 4.8 후에 다시 각 반응기와 소스 매체를 샘플링합니다. 6단계에서 설명한 반응기의 무균 샘플링 절차를 따릅니다.
    1. 모든 샘플의 광학 밀도 측정이 소스 매체의 측정과 동일한지 확인하십시오. 증가된 광학 밀도가 관찰되면 오염이 의심되며 모든 매체와 시스템을 분해, 세척 및 재조립해야 합니다.

5. 대변 샘플 접종

  1. 멸균 광경 피펫 팁, 멸균 식염수, 50mL 원뿔형 튜브, 25mL 멸균 혈청학 피펫, 5mL 주사기 및 16게이지 바늘을 혐기성 챔버에 배치하여 최소 24시간 동안 혐기성 환경에서 컨디셔닝합니다.
  2. 원하는 수의 반응기를 접종하는 데 필요한 배설물의 양을 계산합니다. 각 반응기 웰에는 25% m/v 분변 슬러리에 3.8mL의 상층액이 필요합니다. 6개의 반응기 우물의 경우 총 22.8mL의 25% m/v 분변 슬러리는 접종을 위한 충분한 상층액을 제공해야 하며, 이를 위해서는 5.7g의 고체 분변이 필요합니다.
  3. 극저온 바이알에 보존된 대변 샘플을 혐기성 챔버로 옮기고 15분 동안 해동시킵니다.
  4. 광구경 피펫 팁을 사용하여 극저온 바이알의 배설물을 50mL 원추형 튜브로 옮기고, 단단히 밀봉한 다음 200 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 미립자를 가라앉힙니다.
  5. 혐기성 챔버로 다시 옮기고 상층액을 제거합니다. 오토클레이브 처리된 실험실 주걱을 사용하여 분변 고형물을 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 옮겨 총 질량 5.7g을 얻습니다. 튜브에 17.1mL의 혐기성 멸균 식염수를 추가하고 단단히 밀봉합니다.
  6. 챔버에서 원추형 튜브를 제거하고 5분 동안 와류로 균질화한 다음 200 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 미립자를 가라앉힙니다.
  7. 샘플을 원심분리기에 넣는 동안 10% 표백제 실험실용 물티슈로 각 반응기 상단의 격막을 최소 2분 동안 살균합니다.
  8. 샘플을 혐기성 챔버로 회수하고 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 상층액을 새로운 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
  9. 16G 1.5인치 바늘이 있는 6개의 개별 5mL 주사기에 3.8mL의 분변 슬러리 상등액을 로드합니다.
  10. 물티슈를 제거하고 격막을 통해 바늘을 삽입한 다음 대변 슬러리를 반응기에 천천히 주입합니다.
  11. 반응기로 흐름을 시작하기 전에 약 16-18시간 동안 각 반응기에 대변 군집이 형성되도록 합니다. 자기 교반 플레이트를 분변 슬러리가 주입된 시점부터 최대 속도(1600rpm)로 설정합니다.

6. 반응기 우물에서 샘플의 무균 수집

  1. 멸균 1mL 주사기 6개와 멸균 22G 3인치 바늘 6개에 랩핑에 구멍을 뚫고 혐기성 챔버에 넣어 24시간 동안 탈기합니다.
  2. 샘플링 직전에 각 반응기 상단의 격막을 10% 표백제 실험실용 물티슈로 최소 2분 동안 살균합니다.
  3. 표백제 실험실 물티슈를 제거하고 즉시 주사기에 바늘을 부착하고 바늘을 첫 번째 반응기 웰의 격막 중앙에 삽입하십시오.
  4. 샘플 1mL를 위로 당겨 격막에서 바늘을 제거한 다음 주사기에서 샘플을 1.7mL 라벨이 붙은 튜브로 옮겨 다운스트림 사용을 합니다. 고무 격막은 바늘을 제거하면 다시 밀봉됩니다. 교차 오염을 방지하기 위해 각 반응기 웰에 새 바늘과 주사기를 사용하십시오.
  5. 상층액을 원하는 경우, 혐기성 챔버에서 튜브를 제거하고 20,000 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 박테리아 세포를 펠릿화합니다.
  6. 상등액을 별도로 라벨링된 1.7mL 튜브에 옮기고 -80°C에서 보관합니다.

7. 미니 생물 반응기 시스템 해체 및 청소

  1. 소스 루어 티에서 소스 병을 분리하고 유속을 높이려면(소스 펌프의 경우 1mL/분, waste 펌프의 경우 2mL/분) 튜브를 비우기 시작합니다. 튜브를 완전히 비우십시오. 교반 플레이트를 끕니다.
  2. 튜브가 비우면 폐기물 루어 티에서 쓰레기통을 분리하십시오. 그런 다음 반응기 어셈블리를 혐기성 챔버 에어록에 넣고 챔버에서 제거합니다.
  3. 모든 E-LFL 2.06mm 튜빙 및 PTFE 튜빙 세그먼트를 분리하고 폐기하십시오. 모든 부속품을 분리하고 10% 표백제 용액에 넣습니다.
  4. 각 어레이 웰에서 미니 교반 막대를 제거하고 표백제 용액에 넣습니다. 반응기 어레이를 반전시켜 소독을 위해 매체를 별도의 10% 표백제 용액으로 비웁니다. 그런 다음 빈 어레이를 새 표백제 용액에 담그십시오.
  5. 모든 피팅과 반응기 어레이를 10% 표백제 용액에 30분 동안 담가둡니다(장기간 담그면 변색이 발생할 수 있음).
  6. 피팅과 반응기 어레이를 탈이온수로 헹구고 제조업체 지침에 따라 효소 세제 용액에 밤새 담그십시오.
  7. 피팅과 반응기 어레이를 탈이온수로 삼중 헹군 다음 최소 3일 동안 완전히 자연 건조시킵니다. 건조되면 반응기 어레이와 피팅을 다시 조립에 사용할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

접종 2주 후 인간 배설물 슬러리가 서식한 마우스에서 배설물 샘플을 수집하여 -80°C에서 보관했습니다. 바이오리액터 시스템은 두 개의 복제 반응기 유정에 대해 연속적인 MEGA 매체 흐름으로 설정되었습니다(그림 3A). 분변 슬러리는 단계 6에 기재된 프로토콜에 따라 마우스 분변 펠릿으로부터 제조되었으며, 두 반응기는 반응기 마우스 분변 슬러리를 샘플 포트로 접종하였다. 정적 조건에서 37°C의 반응기 우물에서 분변 군락을 하룻밤 동안 배양한 후, 흐름은 반응기로 다시 시작되어 6일 동안 유지되었습니다. 두 반응기 웰은 반응기로의 흐름을 다시 시작한 후 1, 2, 3, 4 및 6일 후에 샘플링하고 추가 처리를 위해 -80°C에서 보관했습니다.

시간 경과에 따른 미생물 군집 구성의 차이를 평가하기 위해, 앞서...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에 설명된 미니 생물반응기 시스템은 병렬 실험을 위한 독립적인 배설물 군집을 배양할 수 있습니다. 숙주 인자를 분리하여 미생물 군집을 연구하는 이러한 능력은 미생물이 환경에 적응하는 고유한 능력을 이해하는 데 필수적인 접근 방식입니다. 이 프로토콜은 정의된 박테리아 컨소시아 또는 원하는 경우 단일 분리 배양액의 배양에 쉽게 적용할 수 있습니다. 여기에 설명된 MEGA 배지는 까다로운 혐기성 미생물의 배양을 위해 고안된 풍부한 혐기성 육수이지만, 배지의 선택은 군집 구성에 가장 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 연구자는 실험을 설계하기 전에 배지 선택을 신중하게 고려해야 합니다. BRM, BDM 및 강화 클로스트리디얼 미디어4를 포함한 많은 다른 미디어 유형이 이러한 시스템 및 기타 시스템에서 성공적으로 구현되었습니다.

중요성 및 잠재적 응용 분야

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 16S rRNA 유전자 염기서열 분석에 도움을 준 Josee Gauthier에게 감사를 표합니다. 이 연구는 부분적으로 UF Health Cancer Center Funds(C.J.)와 UF Department of Medicine Gatorade Fund(C.J.)의 지원을 받았습니다. R.Z.G.는 UF Health Cancer Center 기금의 지원을 받았습니다. R.C.N.은 플로리다 대학교(TL1TR001428, UL1TR001427)의 국립보건원(National Institutes of Health) TL1 교육 보조금, 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립암연구소(National Cancer Institute) 팀 기반 학제간 암 연구 교육 프로그램(Interdisciplinary Cancer Research Training Program) 상 T32CA257923 및 UF Health Cancer Center의 지원을 받았습니다. 이 간행물에 보고된 연구는 UF Health Cancer Center의 지원을 받았으며, Fla. Stat. § 381.915 및 National Institutes of Health의 National Cancer Institute(수상 번호 P30CA247796)에 제공된 주 예산의 일부 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 또는 플로리다 주의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석에 아무런 역할도 하지 않았습니다. 출판 결정; 또는 원고를 준비합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 mL BD 슬립 팁 주사기 멸균, 일회용Fisher Scientific309659
1/4-28 mm 나사산-가시 수 어댑터(3.2 mm), 5/팩Cole-Parmer008NB32-KD5L6-웰 어레이를 구축하려면 2팩이 필요합니다
10M NaOH(수산화나트륨)Sigma72068-100ML
2.0ml 스크류 캡 튜브, 논널, 스커트, 천연, E-빔 멸균 튜브(캡 부착 포함Fisher Scientific14-755-228
2mag MIXdrive 60 교반 드라이브2mag4006060위치 마그네틱 교반판(가열 용량 추가 옵션 - cat# 40260)
6웰 반응기 arrray, ABS와 유사한 반투명 투명 플라스틱Protolabs사용자 정의3D 프린팅용 .stl 파일에 대한 보충 파일 참조
앱솔루트 에탄올(200 프루프)Fisher ScientificBP2818
아세트산, 빙하시그마A6283
어댑터, 나일론, 1/4-28 스레드에 대한 수 루어, 25/팩Cole-ParmerEW-45505-821개의 6웰 어레이를 구축하려면 6개(1팩)가 필요합니다.
호일Fisher Scientific01-213-100
혐기성 챔버Coy Lab Products유형 B
Bel-Art  SP Scienceware 벼룩 마이크로 스핀바 마그네틱 교반 바 (1/pk)Fisher Scientific22-2616791개의 6웰 어레이를 구축하려면 6 가 필요합니다.
생물안전 캐비닛 클래스 2Nuaire
Butyric acidSigmaB103500 
CaCl2 & 2H2O(염화칼슘 이수화물)SigmaC7902
Clorox 헬스케어 살균 물티슈, 표백제 함유, 무향, 6" x 5", 물티슈 150개 팩사무실 창고129202
D-(-)-과당시그마F0127-100G
D-(+)-셀로비오스시그마C7252-100G
D-(+)-포도당시그마G8270-100G
D-(+)-맥아당 일수화물시그마M5885-100G
드릴 아메리카 플러그 핸드 탭 DWTP1/4-28홈 디포305699489
Dulbecco의 인산염 완충 식염수, Ca 및 Mg 없음 1X, 멸균Genesee25-508
암 루어 & 1/16&프라임; 호스 미늘 어댑터, 나일론, 25/팩Cole-ParmerEW-45502-006웰 어레이 1개를 구축하려면 24(1팩)
암 루어 × 1/8× 호스 미늘 어댑터, 나일론 25/팩Cole-ParmerEW-45502-04웰 어레이 1개를 구축하려면 6(1팩)
암 루어 × 3/32″ 호스 미늘 어댑터, 나일론, 25/팩Cole-ParmerEW-45502-026웰 어레이 1개를 구축하려면 6 (1 팩) 필요 암
루어 티, 나일론, 25 / 팩Cole-ParmerEW-45502-561 6 웰 어레이 1 개를 구축하려면 10 (1 팩)
FeSO4 & middot 필요; 7H2O (철 [II] 황산염 칠수화물)시그마F8633
헤마틴시그마H3281
히스티딘시그마H7750
이소발레르산시그마129542
K2HPO4 이염기성 (인산수소 이칼륨)시그마P2222-1KG
KH2PO4 일염기성 (인산이수소 칼륨)시그마P0662-500G
대형 오리피스 피펫 팁피셔 사이언티픽02-707-134
L-시스테인 염산염시그마C1276-10G
잠금 링이 있는 남성 루어 & 1/8× 호스 미늘 어댑터, 나일론, 25/팩Cole-ParmerEW-45505-041개의 6웰 어레이를 구축하려면 42개(2팩)가 필요합니다.
류 추출물Sigma70164-500G
Med Vet International  엑셀 바늘, 20G x 1", 피하 주사, 100/상자, 26417피셔 사이언티픽50-209-2532
메나디온(비타민 K3)시그마M5625
MgSO4  · 7H2O(황산마그네슘 칠수화물)시그마M1880-500G 
Milli-Q 물
NaCl(염화나트륨)시그마S9888-500G 
NaHCO3 (중탄산나트륨)시그마S5761-500G
Omnifi t Q 시리즈 2홀 병뚜껑Cole-Parmer00945Q-26웰 어레이 1개를 구축하려면
PMP IPC-N L 24CHNL 8RLR 115V MasterFlexISM939C-115V24채널 연동 펌프 1개가 필요하며, 소스용 1개, 폐기물용 1개 필요
정밀 씰 및 고무 격막, 흰색, 7mm OD 유리관(100/pk)밀리포어 시그마Z553905-100EA1개의 6웰 어레이를 구축하려면 6개의 격막이 필요합니다
피온산시그마P5561 
펌프 튜빙, 2-스톱, Tygon S3 E-Lab, 1.02 mm ID; 12/PKVWRMFLX96460-281개의 6-웰 어레이를 구축하려면 6 가 필요합니다. (1팩)
펌프 튜브, 2-스톱, Tygon S3 E-Lab, 1.14 mm ID; 12/PKVWRMFLX96460-30어레이 1개를 구축하려면 6개(1팩)가 필요합니다.
Puritan Cary-Blair 배지, 5mlFisher Scientific22-029-646
PYREX 2L 원형 배지 보관 병, GL45 스크류 캡 포함Fisher Scientific06-414-1E
면도날Genesee12-640
Resazurin, 나트륨염ThermoFisher의 ACROS OrganicsAC41890-0010
수용성 전분SigmaS9765-100G
스테인리스 스틸 마이크로 주걱, 블레이드와 같은 숟가락Fisher ScientificS50823
TBNG TYGON ELFL 2.06MMID 100'VWRMFLX06449-426웰 어레이를 구축하려면 205.5cm 미
량 미네랄 보충제ATCCMD-TMS필요
트립티카제 펩톤(BBL)Fisher ScientificB11921
튜빙, PTFE, 1/8&프라임; (3.2mm) OD & 시간; 1.5 mm ID, 10 mCole-Parmer008 T32-150-101개의 6웰 어레이를 구축하려면 300 mm
Tween 80SigmaP1754 가 필요합니다.
비타민 보충제ATCCMD-VS
효모 추출물(박토)Fisher ScientificDF0127-17-9
1개의 ) 알루미늄 6 육. 프로 6-웰 1개의

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biol. 14 (8), e1002533(2016).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metab. 26 (1), 110-130 (2017).
  3. Rooks, M. G., Garrett, W. S. Gut microbiota, metabolites and host immunity. Nat Rev Immunol. 16 (6), 341-352 (2016).
  4. Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Farrell, K., Britton, R. A. MiniBioReactor Arrays (MBRAs) as a tool for studying C. difficile physiology in the presence of a complex community. Methods Mol Biol. 1476, 235-258 (2016).
  5. Han, S., et al. A metabolomics pipeline for the mechanistic interrogation of the gut microbiome. Nature. 595 (7867), 415-420 (2021).
  6. Bilinski, J., et al. Fresh versus frozen stool for fecal microbiota transplantation-assessment by multimethod approach combining culturing, flow cytometry, and next-generation sequencing. Front Microbiol. 13, 872735(2022).
  7. Li, X. M., et al. Effects of stool sample preservation methods on gut microbiota biodiversity: New original data and systematic review with meta-analysis. Microbiol Spectr. 11 (3), e0429722(2023).
  8. Fouhy, F., et al. The effects of freezing on faecal microbiota as determined using MiSeq sequencing and culture-based investigations. PLoS One. 10 (3), e0119355(2015).
  9. Sun, X., et al. Microbiota-derived metabolic factors reduce Campylobacteriosis in mice. Gastroenterology. 154 (6), 1751-1763.e2 (2018).
  10. He, Z., et al. Campylobacter jejuni promotes colorectal tumorigenesis through the action of cytolethal distending toxin. Gut. 68 (2), 289-300 (2019).
  11. Newsome, R. C., et al. Interaction of bacterial genera associated with therapeutic response to immune checkpoint PD-1 blockade in a United States cohort. Genome Med. 14 (1), 35(2022).
  12. Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. The use of chemostats in microbial systems biology. J Vis Exp. (80), e50168(2013).
  13. Wille, J., Coenye, T. Biofilm dispersion: The key to biofilm eradication or opening Pandora's box. Biofilm. 2, 100027(2020).
  14. Biagini, F., et al. Designs and methodologies to recreate in vitro human gut microbiota models. Bio-des Manuf. 6 (3), 298-318 (2023).
  15. Qi, Y., Yu, L., Tian, F., Zhao, J., Zhai, Q. In vitro models to study human gut-microbiota interactions: Applications, advances, and limitations. Microbiol Res. 270, 127336(2023).
  16. Gościniak, A., Eder, P., Walkowiak, J., Cielecka-Piontek, J. Artificial gastrointestinal models for nutraceuticals research-achievements and challenges: A practical review. Nutrients. 14 (13), 2560(2022).
  17. Marrero, D., et al. Gut-on-a-chip: Mimicking and monitoring the human intestine. Biosens Bioelectron. 181, 113156(2021).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

관련 논문