정소성 쥐 앞다리 이식

요약

여기에서는 쥐 앞다리 이식의 미세수술적 타당성을 입증하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 모델은 VCA 연구를 위한 중요한 중개 플랫폼 역할을 할 수 있습니다.

초록

혈관 복합 동종 이식(VCA)은 피부, 근육, 뼈 및 신경을 포함한 여러 조직 유형의 이식을 포함하며 심각한 외상성 부상이나 기형이 있는 환자에게 유망한 재건 옵션을 제공합니다. VCA는 변형의 잠재력에도 불구하고 이식 거부 반응, 만성 면역 억제 합병증, 신경근 회복의 복잡성과 같은 심각한 문제에 직면해 있습니다.

우리는 이러한 문제를 해결하기 위해 비용 효율적이고 해부학적으로 관련성이 높은 플랫폼으로 쥐 앞다리 모델을 활용합니다. 쥐의 앞다리는 인간의 사지 해부학적 구조를 밀접하게 반영하여 본 연구의 번역 효과를 향상시킵니다. 이전 연구에서는 이 모델이 기능 회복을 신뢰할 수 있고 재현 가능하게 측정하는 것으로 검증되었으며, 이를 통해 앞다리 이식편의 거부 궤적을 평가하기 위한 핵심 도구로 확립했습니다.

또한 이 모델은 혁신적인 치료 접근법을 탐구할 수 있는 귀중한 기회를 제공하고 새로운 보존 기술을 위한 훌륭한 중개 플랫폼 역할을 합니다. 이 모델에 대한 추가 연구를 통해 이식 거부 반응과 신경근 회복의 기전에 대한 이해를 심화하는 것을 목표로 합니다. 궁극적으로 이 작업은 VCA의 임상 결과를 개선하기 위한 길을 닦고 이식 의학의 현재 한계와 미래의 과제를 모두 해결하기 위해 노력합니다.

서론

VCA(Vascularized Composite Allotransplantation)는 심각한 조직 결함을 재건하기 위한 삶을 변화시키는 절차입니다. VCA는 피부, 근육, 뼈, 결합 조직, 혈관 및 신경으로 구성된 복합 조직을 이식하는 것을 말합니다. VCA 기법의 추가적인 개선과 탐구는 외상성 부상이나 외형 손상을 입은 환자에게 큰 도움이 될 것이다¹. 그러나 이식편이 더 광범위하게 적용되려면 이식 거부 반응, 장기 면역 억제로 인한 합병증, 신경근 회복 및 이식 전후 물류와 같은 지속적인 장애물로 인해 어려움을 겪고 있습니다.

쥐 앞다리 모델은 비용 효율성과 인간의 해부학적 및 신경근 특성과 매우 유사하기 때문에 VCA 연구에서 선호되는 선택으로 부상했습니다 ^2,3. 우리의 이전 연구는 이 모델이 행동 기능 회복을 평가하는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 수단을 제공한다는 것을 보여주었습니다⁴. 이 연구에서는 이 모델에 필요한 필수 미세 수술 기술에 대한 자세한 단계별 가이드를 제시합니다.

VCA 연구가 계속 발전함에 따라 쥐 앞다리 모델은 거부 반응 과정, 신경 재생 및 신경근 기능 회복에 대한 기계론적 연구를 가능하게 할 것입니다. 연구원들은 새로운 보존 기술을 탐구하고, 기계 관류 방법의 효과를 평가하고, 장기적인 면역 억제에 대한 현재의 의존도를 줄이는 데 도움이 될 수 있는 새로운 면역 조절 요법을 테스트할 수 있습니다.

프로토콜

수술 절차는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)과 미국 실험실 동물 관리 인증 협회(American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care)가 제정한 지침에 따라 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용 위원회(RA18M74)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 기증자 절차(그림 1)

1. 5% 농도의 이소플루란 흡입을 통한 마취 유도를 실시하고 시술 내내 1%를 유지합니다. 발가락 꼬집기를 통해 정확한 마취 수준을 확인한 후 절차를 시작합니다.
2. 팔꿈치에서 약 1cm 위 둘레를 절개합니다. 피부를 나누고 손상 없이 아래에 있는 표재성 피하 조직을 노출시킵니다(그림 1A).
3. 피하 조직/근막을 절개하고 모든 표재성 혈관을 소작하고 transection합니다. 그 후, 대흉근(pectoralis major)의 일부인 삼각근(deltoid)과 상완삼두근(triceps brachii)이 노출됩니다.
4. 대흉근 아래를 둔탁하게 절개하면 상완 혈관과 정중 신경 및 척골 신경이 드러납니다(그림 1B).
5. 삼각근의 표재성 정맥을 소작하고 근방으로 횡단한 다음 근섬유 방향에 수직으로 삼각근을 횡단합니다. 그 후, 대흉근과 소흉근을 절개하고 절제하여 겨드랑이 동맥, 정맥 및 신경을 드러냅니다. (그림 1C).
6. 정중 신경, 척골 및 요골 신경을 근위 끝(분할 직후)에서 절제하여 가능한 한 많은 길이를 보존합니다.
7. 상완 동맥과 정맥을 절개하고 풀어줍니다.
8. 상완 이두근, 상완 삼두근 및 광배근을 횡절합니다. 박리 완료 시 상완골이 제대로 노출되었는지 확인하십시오.
9. 롱거 집게를 사용하여 원위부의 뼈를 상완골의 삼각근 결절로 절제합니다.
10. 상완 동맥과 정맥의 내강을 부드럽게 확인합니다(그림 1C). 6mL의 헤파린 식염수로 이식편을 세척합니다.
11. 상완 동맥과 정맥 모두에 각각 폴리이미드 커프를 장착합니다(그림 1D).
12. 젖은 면거즈로 접목을 싸서 4°C에서 보관합니다.
13. 흡입 마취제(이소플루란) 과다 투여를 통해 기증자 쥐를 안락사시킵니다. 발가락 꼬집음에 완전히 반응하지 않으면 개흉술을 시행하고 심장을 절제합니다.

2. 수취인 절차(그림 2)

1. 5% 농도의 이소플루란 흡입을 통한 마취 유도를 실시하고 시술 내내 1%를 유지합니다. 발가락 꼬집기를 통해 마취 상태를 확인합니다.
2. 팔꿈치에서 약 1-2cm 위 둘레를 절개합니다.
3. 피하 혈관을 해부하고 더 큰 혈관을 소작하여 대흉근의 일부인 삼각근과 상완삼두근을 노출시킵니다.
4. 대흉근 아래를 뭉툭하게 해부하여 상완 혈관과 정중 신경 및 척골 신경을 드러냅니다.
5. 삼각근과 대흉근의 일부를 원위부 끝에서 절제하여 상완 혈관, 정중 및 척골 신경을 노출시킵니다(그림 2A).
6. 원위 끝에서 정중 신경과 척골 신경을 절개하고 절제합니다. 모든 혈관 가지를 접합합니다(그림 2B).
7. 상완골 이두박근, 상완삼두근, 광배근 등근을 절제하여 상완골을 노출시킵니다. transection된 근육에서 출혈이 있는지 조심스럽게 소작하십시오.
8. 삼각근 결절에서 상완골을 절제합니다. 골수를 밀봉하기 위해 뼛왁스를 사용하십시오.
9. 골수내 막대를 사용하여 기증자와 수혜자의 골수강을 다시 연결한 다음 뼈 왁스를 사용하여 연결을 밀봉합니다. 6-0 흡수성 봉합사로 상완삼두근을 봉합하여 혈관 문합을 위한 플랫폼을 만듭니다.
10. 요골 신경의 중단된 10-0 봉합사로 표피신경경화술을 수행합니다.
11. 비봉합 커프 기술을 사용하여 혈관 문합을 수행합니다(그림 2C).
12. 정중 신경과 척골 신경을 다시 연결하기 위해 중단된 10-0 봉합사로 상피 신경경피술을 수행합니다(그림 2D).
13. 중단된 봉합사를 사용하여 삼각근과 대흉근을 다시 연결합니다.
14. 4-0 비흡수성 봉합사로 상처를 봉합합니다.
15. 수술 종료 시 체중의 2%까지 따뜻하고 무균된 식염수를 피하로 투여합니다.
16. 회복을 위해 따뜻한 램프 아래에서 최소 4시간 동안 동물을 관찰하십시오. 일단 정신이 또렷해지고, 몸을 일으켜 세우고, 조정된 움직임을 보여주고, 독립적으로 물과 먹이를 얻을 수 있게 되면 동물 수용 시설로 돌려보내야 한다.

3. 장기 이식 후 관리

1. 아래에 정의된 대로 동물에게 통증과 고통의 징후가 있는지 매일 모니터링하십시오.
   1. 케이지에 대변이 없는 것으로 나타나는 거식증이 있는지 확인하십시오.
   2. 동물이 물을 마시지 않아 피부의 텐트로 인한 탈수로 이어지는지 확인하십시오.
   3. 동물이 몸을 구부리고 있는지, 움직이려 하지 않는지, 팔다리를 선호하는지, 절개 부위를 지키고 있는지 확인하십시오.
   4. 동물이 그루밍에 실패하여 주름 지거나 더러운 털에 반사되는지 확인하십시오.
   5. 동물이 과도하게 핥거나 긁는지 확인하십시오. 절개 부위의 발적과 붓기, 자해를 확인하십시오.
   6. 특히 동물을 들어올리려고 할 때 공격적인 행동을 확인하십시오.
   7. 동물이 헐떡거리는지, 호흡이 어려운지, 적갈색의 비강/안구 분비물이 있는지 확인하십시오.
   8. 패혈증을 확인하십시오.
2. 수술 후 14일이 지나면 봉합사를 제거하십시오.
3. 수술 후 2일차(POD2, 초기 투여 후 48시간)에 부프레노르핀SR의 두 번째 용량(랫드 용량: 1.0mg/kg SC)을 투여합니다.
4. 이식 후 4주차에 주간 기능 평가를 시작하십시오.
   1. 간단히 말해서, 전신 마취 상태에서 동물의 앞다리를 90° 외전으로 고정합니다. 상완골에 대흉근(pectoralis major)이 삽입되는 곳 근처의 겨드랑이에 1mm 간격으로 두 개의 바늘 전극을 놓습니다.
   2. 굴곡근의 최대 파탄적 수축을 유도하기 위해 10V에서 근위 정중신경을 경피적으로 자극합니다.
   3. 완전한 디지털 굴곡이 그립을 형성하면 손바닥의 힘 측정기에 연결된 금속 루프를 놓고 구부러진 손가락 안에 고정합니다. 그런 다음 그립을 잃을 때까지 힘 미터를 당겨 최대 힘(뉴턴)을 기록합니다.

결과

이식편 생존은 거시적 관찰을 통해 모니터링하고 결정할 수 있습니다. 단기(POD7) 및 장기 추적(POD120)의 대표적인 그림이 그림 3에 나와 있습니다. 이식편은 뚜렷한 괴사 징후 없이 회복될 수 있습니다. 생존 데이터는 그림 4에 나와 있습니다. 피부와 근육 샘플은 모두 지정된 종말점에서 채취됩니다. 대표적인 조직학적 이미지는 그림 5 와 그림 6에 나와 있습니다. 두 그림 모두 피부와 근육의 정상적인 조직학적 특징을 보여줍니다. 기능적 회복(주로 매체 신경, 그림 7 및 그림 8)을 평가하기 위해 악력 테스트를 적용했습니다. 회복은 이식 후 약 15주 후에 안정기에 접어듭니다. 이 기술은 이전 간행물

토론

쥐의 정소성 앞다리 이식은 혈관화된 복합 조직을 포함할 뿐만 아니라 기능 회복을 평가할 수 있기 때문에 실험적 재건 이식에서 일반적으로 사용되는 모델입니다. 혈관 문합을 위한 기존의 봉합 기술은 매우 복잡하며 수년간의 미세 수술 훈련이 필요한 고급 미세 수술 기술이 필요합니다. 시간과 비용을 크게 줄이기 위해 이 수정된 쥐 앞다리 모델에 혈관 비봉합 커프 문합 기법이 적용되었습니다. 이는 마우스 심장 이식 모델⁶ 및 마우스 뒷다리 모델⁷에서 입증된 것처럼 미세 수술 훈련 과정을 크게 가속화하고 훈련 곡선을 단축합니다. 비봉합 커프 기술은 모든 앞다리 이식 관련 프로젝트에서 90% 이상의 성공을 거두었습니다. 기술적인 관점에서 혈관 벽의 내막은 외과적 조작이 없어 정적 냉장 보관 관련 실험에서 교란 요인을 줄이는 데 도움이 됩니다.

이 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10-0 비멸균 마이크로 봉합사	AROSurgical	TK-107038
4-0 샤포인트 나일론 블랙	봉합사	A1667N
4-0 샤포인트 폴리신 테이퍼	봉합사	G214N
5mL 주사기	MDC	2045
6-0 실크	피셔 사이언티픽	NC9742105
ABB-22 V 더블 마이크로 용기	S& T	00480
B-1 V 단일 마이크로 용기 클램프	S& T	00462
BD Quincke 척추 바늘	봉합사	405073
Castroviejo 마이크로 바늘 홀더 FST		12061-02
Chatilon DFE II 힘 측정기	Ametek	DFE II 시리즈
코튼 팁	JH 용품 매장	100252
고급 가위 - 텅스텐 카바이드	FST	14569-09
집게	S& T	FRS-15 RM-8
거즈 스펀지	피셔 사이언티픽	22-362178
Halsted-Mosquito 지혈제	FST	13009-12
헤파린	JHH 약국	NDC 63323-540-05
IV 카테터 방사선 불투과성 24G	봉합사	SMTH5053
보석상 양극성 응고 겸자, 스테인레스 스틸	ASSI	103000BPS03
둥근 손잡이 Vannas 스프링 가위	FST	15400-12
특수 집게	S& T	FRAS-15 RM-8
혈관 확장기 - 균형 계측기	FST	18602-15