방법 논문

제한되지 않은 압축 테스트를 위해 맞춤형 3D 프린팅 금형을 사용한 Sporosarcina pasteurii 바이오시멘트 벽돌의 생산 및 분석

DOI:

10.3791/68065

⸱

2025년 3월 7일

 ,  ,  ,  , 
1Biology Department, United States Air Force Academy, 2United States Air Force Academy Life Sciences Research Center

이 논문에서

요약

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Sporosarcina pasteurii 는 요소를 탄산염과 암모늄으로 분해하는 요분해 박테리아입니다. 탄산염은 칼슘과 결합하여 탄산칼슘을 형성하여 주변 입자를 함께 고정하여 바이오 시멘트를 생성하는 결정 격자를 만듭니다. 이것은 3D 프린팅 금형을 사용하여 압축 테스트에 적합한 바이오 시멘트 벽돌을 만들기 위한 편리한 프로토콜입니다.

초록

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시멘트는 주택 기초부터 역사적인 기념물 및 도로에 이르기까지 전 세계의 많은 구조물에 사용되는 핵심 건축 자재입니다. 전 세계적으로 중요하고 풍부한 재료입니다. 그러나 전통적인 시멘트 생산은 인간이 만든 대기 중 CO2의 주요 원인으로 온실 가스 배출과 기후 변화를 초래합니다. MICP(Microbially induced calcite precipitation (Microbially induced calcite loading)는 Sporosarcina pasteurii 또는 기타 박테리아가 기존 시멘트만큼 강한 시멘트 재료를 생산하는 생물학적 과정이지만 바이오 시멘트는 탄소 중립적입니다. 이 MICP 바이오 시멘트 생산 방법은 유망한 기술이며 현재 많은 회사, 국가 및 연구 그룹에서 활발한 연구를 진행하고 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 토양 또는 모래의 관류 MICP 처리를 위해 맞춤형으로 설계되고 재사용 가능한 3D 프린팅 금형을 사용하여 제한되지 않은 압축 테스트에 대한 표준 사양을 충족하는 원통형 벽돌을 생산합니다. 개별적이고 독립된 리저버 토핑 금형을 통해 여러 변수와 반복을 편리하게 병렬 테스트할 수 있습니다. 이 프로토콜은 S. pasteurii MICP 반응과 바이오시멘트 원통형 벽돌을 생성하기 위한 3D 프린팅 금형의 생성, 조립 및 사용을 간략하게 설명합니다.

서론

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콘크리트는 전 세계 건설 프로젝트의 주요 건축 자재입니다 1,2. 한 연구에 따르면 시멘트는 물에 이어 세계에서 두 번째로 많이 소비되는 물질입니다3. 매년 약 41억 톤의 시멘트가 생산됩니다 4,5. 시멘트의 전통적인 생산, 가공 및 적용은 매년 전 세계 CO2 배출량의 거의 8%를 차지합니다6. 전통적인 시멘트 생산의 높은 수요와 해로운 영향으로 인해 합착을 위한 새로운 탄소 중립 방법은 글로벌 지속 가능성 목표 7,8,9,10의 최우선 과제입니다.

생물 합착은 미생물을 사용하여 고체 표면 또는 구조를 만드는 데 사용할 수 있는 시멘트, 접착제 또는 물질을 생산하는 과정입니다 1,11. 가장 잘 정의 된 생물 합착 공정은 요분해 박테리아를 사용하여 탄산 칼슘을 침전시키고 입자를 경화 된 시멘트 재료로 함께 연결하는 것을 포함합니다12,13.

기존 시멘트에 대한 친환경적인 대안을 고려할 때 대안은 시멘트에 대한 강도 기대치도 충족해야 합니다. 비제한 압축 시험은 암석, 건축 자재 또는 토양 샘플(14)의 전단 강도를 결정하는 데 사용되는 분석 측정입니다. 효과적인 전단 시험을 위해서는 1:2 직경 대 높이 비율과 원통형형상 15를 포함하는 산업 표준에 따라 시료를 준비해야 합니다. 이러한 표준을 충족하고 MICP 프로토콜 실행의 효율성을 높이기 위해 맞춤형으로 설계된 3D 프린팅 금형이 만들어졌습니다. 이러한 맞춤형으로 설계된 금형은 순차적 MICP 처리의 플로우 스루 적용 및 배수를 허용합니다. 박테리아 배양 및 합착 용액은 상단 저장소에 쉽게 적용할 수 있으며, 이 저장소는 금형을 통과하여 금형 바닥의 메쉬 안감 개구부를 통과합니다. 금형은 비커 또는 기타 폐기물 수집 용기 위에 놓이도록 설계되었습니다. 금형은 시멘트가 발라진 벽돌을 쉽게 풀 수 있도록 수직으로 반으로 나뉩니다. 금형의 프레임에 부착된 8개의 자석으로 함께 고정되고 에폭시로 밀봉되어 자석이 MICP 용액에 노출되는 것을 방지합니다. 두 개의 반쪽에는 또한 고무 개스킷을 배치하기 위한 삽입 홈이 있어 금형을 밀봉하고 누출을 방지하는 데 도움이 됩니다. 원통형 주형의 내부에는 3인치 높이의 벽돌을 생산하기 위한 모래/토양의 채우기 수준을 나타내는 홈이 있습니다. 그 홈 위의 공간은 처리 용액을 적용하기 위한 저장소로 사용하도록 되어 있습니다. 금형 내부의 바닥 개구부 위에 놓인 철망 조각은 시공 시 모래나 흙이 금형 바닥을 통해 떨어지는 것을 방지합니다. 또한, 모래 또는 토양 상단에 철망 조각을 배치하여 적용된 용액을 고르게 분배하는 데 도움을 주고 형성된 벽돌의 상단이 날카로운 융기 없이 균일하도록 하여 제한되지 않은 압축 테스트 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.

금형은 CAD(Computer-Aided Design) 소프트웨어를 사용하여 설계되었으며, CAD 파일(보충 파일 3 및 보충 파일 4)에서 STL 파일(보충 파일 1 및 보충 파일 2)을 생성했습니다. 이 STL 파일은 3D 프린터 프로그램에 업로드되어 이후에 인쇄되었습니다. 금형을 프린팅한 후 워터 제트 시스템을 사용하여 3D 프린터에서 생성된 서포트 재료를 제거하여 최종 3D 프린팅 구조를 남겼습니다. 금형의 모래/토양을 압축하고 평평한 상단 표면을 만드는 데 도움이 되는 탬핑 장치를 인쇄하기 위한 파일도 포함되어 있습니다.

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프로토콜

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사용된 시약, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 용액 및 매체 준비

  1. 뇌-심장 주입(BHI) - 요소 배지(1L)
    1. 저울을 사용하여 BHI 분말 37g의 무게를 측정하고 1L 플라스크 또는 비커에 추가합니다.
    2. 저울을 사용하여 요소 20g의 무게를 측정하고 BHI 분말이 들어있는 동일한 1L 플라스크 또는 비커에 추가합니다.
      주의 : 요소가 포함된 재료에 오토클레이브하거나 표백제를 첨가하지 마십시오. 요소는 암모니아로 분해되어 휘발 가스로 해로울 수 있으며 표백제와 반응하여 독성 겨자 가스를 형성할 수 있습니다. 모든 폐기물은 기관의 안전 프로토콜에 따라 유해 폐기물로 처리하십시오.
    3. BHI 분말과 요소가 들어있는 1L 플라스크 또는 비커에 1L의 H2O를 채웁니다.
    4. 0.45μM 필터가 있는 배지를 혼합하고 여과하여 오토클레이브 플라스크 또는 비커에 주입합니다.
  2. 합착 용액 (1 L)
    1. 저울을 사용하여 요소 20g의 무게를 측정하고 1L 플라스크 또는 비커에 추가합니다.
    2. 저울을 사용하여 NH10Cl (염화 암모늄) 10g의 무게를 측정하고 요소가 들어있는 동일한 1L 플라스크 또는 비커에 첨가합니다.
      주의 : 염화암모늄이 포함된 재료에 오토클레이브하거나 표백제를 첨가하지 마십시오. 염화암모늄은 암모니아 가스와 평형을 형성하며, 이는 휘발 가스로 해로울 수 있으며 표백제와 반응하여 독성 겨자 가스를 형성할 수 있습니다. 모든 폐기물은 기관의 안전 프로토콜에 따라 유해 폐기물로 처리하십시오.
    3. 저울을 사용하여 CaCl4.2H 2O(염화칼슘) 49g의 무게를 측정하고 요소와 염화암모늄이 들어 있는 동일한 1L 플라스크 또는 비커에 추가합니다.
    4. 요소, 염화암모늄 및 염화칼슘이 들어 있는 1L 플라스크 또는 비커에 1L의 H2O를 채웁니다.
      알림: 이 용액은 멸균되지 않습니다. 신선하게 준비하고 48시간 이내에 사용하십시오.
  3. 벽돌 인쇄 및 준비(MICP 처리 며칠 전에 수행)
    1. 벽돌 금형(보충 파일 1) 및 탬핑 장치(보충 파일 2)에 대한 STL 파일을 3D 프린터에 적합한 프로그램에 로드합니다.
      참고: 사용되는 특정 프로그램은 다른 3D 프린터를 사용하여 다를 수 있습니다. 사용 중인 프린터에 적합한 프로그램을 사용하십시오.
    2. 금형 및 탬핑 장치를 인쇄합니다(그림 1).
    3. 프린터 요구 사항에 따라 금형을 처리합니다.
    4. 금형의 각 해당 자석 슬롯에 하나의 자석을 놓고 금형의 두 반쪽이 서로를 끌어당기고 밀어내지 않는 방식으로 전하가 배치되도록 합니다.
    5. 자석이 적절하게 배치되면 각 자석을 에폭시로 밀봉합니다.
    6. 직경 1.5인치의 철망 원 두 개를 선택하여 따로 보관합니다.

2. 벽돌 준비 (Day 0)

참고: 벽돌 한 개 준비에 대한 세부 정보는 여기에 제공됩니다.

  1. 필터는 150mL의 BHI-urea 배지를 살균합니다. 250mL 플라스크를 오토클레이브합니다.
  2. 250mL의 합착 용액을 준비하십시오. 오토클레이브 처리된 250mL 플라스크에 넣지 마십시오.
  3. BHI 요소 한천이 있는 페트리 접시에서 S. pasteurii 분리 줄무늬 배양을 준비하고 30°C에서 24-48시간 동안 배양합니다(냉동 글리세롤 스톡의 S. pasteurii ).
  4. S. pasteurii의 스타터 배양 (1일차)
    1. 배양 튜브에 1.6mL의 BHI-Urea 배지를 첨가하여 1.6mL 스타터 배양을 만듭니다.
    2. Day 0 줄무늬 플레이트에서 1개의 콜로니로 배양균을 접종합니다.
    3. 30°C의 셰이커(150rpm)에서 하룻밤 동안 종균 배양을 배양합니다.
  5. 문화 성장(2일차)
    1. 종균 배양을 검사하여 성장을 확인합니다(탁도 증가로 나타남).
    2. 250mL 오토클레이브 플라스크에 40mL의 BHI-urea 배지를 추가합니다. 1.6mL 스타터 배양액을 플라스크에 붓습니다. 배양하고 30 ° C에서 7 시간 동안 흔듭니다.
    3. 플라스크에 BHI-urea 배지 40mL를 추가로 추가합니다. 플라스크를 20 ° C의 셰이커에 하룻밤 (~ 16 시간) 놓습니다.
  6. S. pasteurii를 사용한 벽돌 처리(3일차)
    1. 하룻밤 배양 플라스크에 BHI-urea 배지 40mL를 추가로 첨가하고 20 ° C에서 S. pasteurii 를 계속 배양합니다.
  7. 벽돌 틀을 준비합니다(3일차)( 그림 2 참조).
    1. 금형의 적절한 공간에 고무 개스킷을 놓습니다. 금형의 두 반쪽을 연결하여 개스킷이 밀봉되고 모든 자석이 연결되었는지 확인합니다.
    2. 원통형 벽돌 주형의 바닥에 미세한 철망 원을 추가하여 주형의 구멍을 통해 모래가 떨어지는 것을 방지합니다.
    3. 금형 내부의 선까지 모래나 기타 재료로 금형을 채우고 단단히 탬핑합니다.
    4. 모래 위에 또 다른 원의 철망을 놓아 전체 상단 표면을 덮고 다시 탬핑합니다.
    5. 흐름을 잡기 위해 폐기물 용기 위에 곰팡이를 놓습니다.
  8. 치료 절차(3일차)
    1. 모래 위에 S. pasteurii 배양액 40mL를 붓고 스며들게 합니다. 45분 동안 기다립니다.
    2. 모래 위에 80mL의 합착 용액을 붓습니다. 30분 동안 기다립니다.
    3. 모래 위에 S. pasteurii 배양액 40mL를 붓습니다. 30분 동안 기다립니다.
    4. 모래 위에 80mL의 합착 용액을 붓습니다. 30분 동안 기다립니다.
    5. 모래 위에 S. pasteurii 배양액 40mL를 붓습니다. 30분 동안 기다립니다.
    6. 모래 위에 80mL의 합착 용액을 붓습니다. 최소 48시간 동안 또는 모래가 마를 때까지 벽돌을 그대로 두십시오.
  9. 최종 제품(5일차)을 확인합니다.
    1. 금형을 반으로 나누고 자석의 압력을 해제하여 금형을 조심스럽게 엽니다. 틀에서 벽돌을 부드럽게 제거합니다.
      알림: 모래가 젖은 것 같으면 틀에서 벽돌을 제거하기 전에 틀을 하루나 이틀 더 건조해야 합니다(벽돌이 건조할수록 제거가 더 쉬움).
    2. 종이 타월 위에 벽돌을 올려 놓고 압축 테스트를 수행하기 전에 3주 동안 계속 건조시킵니다.
  10. 금형 청소(5일차)
    1. 벽돌이 금형에서 제거되면 금형의 각 절반에서 개스킷과 철망을 분리합니다.
    2. 물로 헹구기 전에 70% 에탄올 용액에 철망을 24시간 동안 담그십시오. 메쉬를 청소하기 위해 약간의 스크러빙이 필요할 수 있습니다.
    3. 70% 에탄올로 곰팡이를 헹구고 부드러운 강모 브러시, 스폰지 또는 기타 청소 장치로 최소 3회 문지릅니다. 그런 다음 비누와 물로 청소한 다음 공기 건조하십시오.
    4. 개스킷을 70% 에탄올로 헹군 다음 비누와 물로 청소한 다음 자연 건조합니다.

3. 압축 시험(25일차)

  1. 제한되지 않은 압축 테스트16을 사용하여 모든 벽돌의 강도를 분석합니다.
    1. 벽돌의 원형 끝이 평평하고 평평한지 확인하십시오. 끝이 고르지 않으면 파일이나 다른 장치를 사용하여 표면을 고르게 하십시오.
      알림: 철망이 올바르게 적용된 경우 벽돌의 끝은 대부분 평평해야 합니다. 정확한 강도 측정을 보장하기 위해 벽돌의 끝이 가능한 한 균일해야 합니다.
  2. 지퍼가 있거나 밀봉된 비닐 봉지에 벽돌을 넣고 벽돌을 비닐 봉지에 넣어 벽돌의 평평한 면이 이음새로 덮이지 않도록 하여 매끄럽고 평평한 덮개를 만듭니다.
  3. 벽돌을 아래쪽 적재판에 놓습니다. 벽돌 위에 평평하고 균일한 적재 플레이트를 놓습니다.
  4. 제한되지 않은 압축 시험기를 통해 벽돌에 약 1파운드의 압력을 가합니다.
  5. 디지털 판독값의 용기를 싣습니다.
  6. 벽돌의 완전한 구조적 파괴가 달성될 때까지 기계 사양에 따라 지속적으로 증가하는 하중을 가합니다.
  7. 각 브릭에 대한 최대 중량 지지 하중을 기록합니다. 원하는 통계 분석을 수행하여 결과를 평가합니다.

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결과

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3D 프린팅 금형의 구조는 그림 1 과 그림 2에서 볼 수 있습니다. 긍정적 인 결과는 금형에서 제거했을 때 모양을 유지하는 벽돌로 보아야하며 3 주간의 건조 후 터치로 인한 재료 손실을 최소화하면서 쉽게 처리 할 수있는 견고한 구조로 나타납니다. 벽돌이 단단하지 않고 접촉이나 움직임으로 인해 부서지거나 심각한 재료 손실이 있는 경우 배지 또는 배양 준비에 오류가 있을 수 있습니다. 긍정적 및 부정적 브릭 결과의 예는 그림 3에서 볼 수 있습니다.

그림 4에서 볼 수 있듯이 금형은 굵은 모래와 고운 모래의 두 가지 다른 기판을 동시에 테스트하는 데 사용되었습니다. 굵은 모래를 사용한 총 4개의 벽돌과 고운 모래를 사용한 4개의 벽돌을 여기에 설명된 S. past...

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토론

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중요한 단계
이 생물 합착 프로토콜은 S. pasteurii MICP를 사용하여 비제한 압축 테스트에 적합한 생체 접합 원통형 벽돌을 생산합니다. 비제한 압축 테스트의 가장 중요한 요소 중 하나는 샘플의 모양과 구조입니다. 실린더 제품의 상단과 하단이 평평하고 벽돌의 높이가 가능한 한 3인치에 가깝는지 확인하십시오. 3인치 높이 표시를 약간 넘는 것이 아래로 내려가는 것보다 낫습니다. 모래/토양의 침전으로 인해 처리가 적용될 때 약간의 높이가 손실됩니다. 따라서 초기 처리 전에 금형을 약간 과도하게 채우는 것이 좋습니다. 처리 전에 모래/토양 상단에 배치된 철망 원은 적용된 용액을 분산시키고 더 평평한 표면을 만드는 데 도움이 됩니다16. 금형, 메쉬 및 개스킷을 철저히 청소하는 것은 향후 벽돌의 교차 오염 위험을 최소화하는 데 중요합니다. 또한 메쉬를 청소하거나 새 메쉬를 ...

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다. 이 원고는 공개 승인되었습니다. PA 번호: USAFA-DF-2024-777. 이 논문에 표현된 견해는 저자의 견해이며 반드시 미국 정부, 국방부 또는 공군부의 공식 입장이나 정책을 나타내는 것은 아닙니다.

감사의 글

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이 자료는 계약 번호 FA7000-24-2-0005(MG)에 따라 미국 공군 사관학교와 공군 연구소가 후원하는 연구를 기반으로 합니다. 미국 정부는 저작권 표기에도 불구하고 정부 목적을 위해 증쇄본을 복제하고 배포할 수 있는 권한이 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3D 프린터StratasysObjet 30 V3Objet30 Pro V3.0 데스크탑 3D 프린터
3D 프린터 재료StratasysOBJ-04066Rigur RGD450 모델 재료
3D 프린터 재료StratasysOBJ-04020Sup 705 지원 재료
염화 암모늄Fisher ScientificA661-500다른 염화 암모늄이 작동해야 합니다. 상관 없음
Brain Heart Infusion BrothMillipore53286다른 Brain Heart Infusion Broth는 작동해야 하며, 제조업체는 상관하지 않아야 합니다
칼슘 염화 DihydrateVWR BDH9224다른 염화칼슘 이수화물이 작동해야 하며 제조업체는
Coarse Sand. s470016-902특수 모래-자갈 혼합 및 스트레스 클레이
데스크탑 워터 제트StratasysOBJ-014003D 프린트 후처리를 위한 워터젯 시스템
에폭시 고릴라 접착제4200102고릴라 에폭시 접착제: 에폭시, 0.8 fl oz, 주사기, 투명하고 두꺼운 액체
미세 모래SandtastikPLA25  반짝이는 흰색
개스킷 재질McMaster-Carr8525T65에틸렌-프로필렌 디엔 단량체(EPDM) 1/16" 두께
GrabCADStratasysGrabCAD3D 프린터 소프트웨어
자석K& J MagneticsD64-N52네오디뮴 자석 등급 N52
SolidWorks 2021Dassault Systè mesSolidWorks 2021CAD 소프트웨어
Sporosarcina pasteuriiStrain: ATCC 11859 / DSM 33
진공 여과 컵 0.45µ mVWR10040-450
와이어 메쉬 1.5 " 직경 디스크McMaster-Carr2812T43스틸 와이어 메쉬 재질
. Ward를 고려하지 않아야 합니다의 모래 놀이

참고문헌

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  12. Liu, Y., et al. Microbial-induced calcium carbonate precipitation: Influencing factors, nucleation pathways, and application in wastewater remediation. Sci Total Environ. 860, 160439(2023).
  13. Fu, T., Saracho, A. C., Haigh, S. K. Microbially induced carbonate precipitation (MICP) for soil strengthening: A comprehensive review. Biogeotechnics. 1 (1), 100002(2023).
  14. Güneyli, H., Rüşen, T. Effect of length-to-diameter ratio on the unconfined compressive strength of cohesive soil specimens. Bull Eng Geol Environ. 75, 793-806 (2016).
  15. Gebresamuel, H. T., Melese, D. T., Boru, Y. T., Legese, A. M. Effect of specimens' height to diameter ratio on unconfined compressive strength of cohesive soil. Stud Geotech Mech. 45 (2), 112-132 (2023).
  16. Vigil, T. N., et al. Surface-displayed silicatein-α enzyme in bioengineered E. coli enables biocementation and silica mineralization. Front Syst Biol. 4, 1377188(2024).
  17. Choi, S. -G., et al. Review on geotechnical engineering properties of sands treated by microbially induced calcium carbonate precipitation (MICP) and biopolymers. Constr Build Mater. 246, 118415(2020).
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