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방법 논문

쥐에 대한 관 세포 이식에서 유래한 섬 유사 세포

469 조회수

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DOI:

10.3791/68066

⸱

2025년 8월 1일

 , 
1Department of Physiology, Ankara Medipol University Faculty of Medicine

이 논문에서

요약

관 세포에서 유래한 섬 유사 세포는 당뇨병 쥐의 혈당 수치를 낮추고 인슐린 생산을 강화함으로써 당뇨병 치료 가능성을 보여줍니다. 그럼에도 불구하고 충분한 세포 기능, 면역학적 방어 및 안전성을 보장하는 데는 여전히 과제가 남아 있습니다. 이러한 물질의 치료 능력을 향상시키기 위해서는 추가 조사가 필요합니다.

초록

관 세포에서 유래한 섬 유사 세포의 사용은 제1형 당뇨병 치료를 위한 잠재적인 접근법으로 부상했습니다. 당뇨병 환자는 인슐린 생성을 담당하는 췌장 베타 세포의 자가면역 파괴로 인해 체내 인슐린 합성이 불충분합니다. 이 틀 내에서 섬 세포 이식의 목적은 환자의 인슐린 생산 능력을 회복시키는 것입니다. 그러나 기증자 췌장에서 섬 세포의 불충분한 획득 및 면역 반응과 같은 장애물은 이 치료 방법의 광범위한 적용을 방해합니다. 특정 상황에서 췌관 세포는 인슐린을 생성하는 세포로 변형되는 능력을 가지고 있습니다. 이 세포는 통제된 환경에서 배양되어 인슐린을 방출하는 능력을 가진 섬 유사 세포로 전환되어 이식에 적합할 수 있습니다. 이 혁신적인 전략은 제1형 당뇨병의 진행을 멈추고 인슐린 주사에 대한 의존도를 줄일 수 있는 잠재력을 제공합니다. 본 연구에서는 스트렙토조토신 유도 당뇨병 쥐에서 관 세포에서 유래한 섬 유사 세포를 간의 문맥을 통해 간으로 이식하였다. 이식 후, 우리는 5일째부터 쥐의 혈당 수치가 크게 감소하여 15일 동안 지속되는 것을 발견했습니다. 또한, 복강내 포도당 내성 검사(IPGTT)에서 섬 유사 세포 이식을 받은 당뇨병 쥐가 대조군보다 훨씬 더 많은 인슐린을 생산하는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 관 세포에서 유래한 섬 유사 세포가 당뇨병에 대한 유망한 치료 접근법이 될 수 있음을 시사합니다. 이 연구 분야의 주요 장애물에는 세포에 대한 충분한 기능적 능력을 달성하고, 면역 체계로부터 세포를 보호하고, 치료 적용을 위한 안전성을 보장하는 것이 포함됩니다. 향후 연구 노력은 효능과 안전성 향상에 중점을 두고 치료 환경에서 이러한 세포의 사용을 최적화하기 위한 중요한 통찰력을 얻을 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

서론

제1형 당뇨병은 인슐린을 생성하는 췌장의 베타 세포가 파괴되는 지속적인 자가면역 질환입니다. 현재 치료법에는 대부분 장기 인슐린 요법이 포함되는데, 이는 혈당 수치를 조절하는 데 성공적이지만 상태를 치료하거나 진행을 중단시키지는 못합니다1. 제1형 당뇨병에 대한 대체 요법에 대한 조사는 인슐린 치료에 대한 기존 강조보다 더 효과적인 대안의 필요성에 의해 동기가 부여됩니다. 이로 인해 인슐린을 생성하는 신체의 고유한 능력을 회복시키려는 섬 세포 이식과 같은 대체 치료법에 초점을 맞춘 지속적인 연구가 촉발되었습니다. 그럼에도 불구하고 기증자 섬 세포를 구하기 어렵고 면역학적 거부반응의 가능성이 있다는 사실로 인해 이 치료법이 널리 사용되기 어렵습니다. 그 결과, 과학계는 인슐린을 생성하는 세포의 대체 공급원을 찾는 데 점점 더 관심을 갖게 되었습니다 1,2,3.

이 방법은 이러한 세포의 재생 잠재력을 활용하여 인슐린 분비 세포의 지속 가능한 공급을 확립하려고 합니다4. 시험관 내 조사는 이러한 관 세포가 포도당 자극에 반응하여 인슐린 분비가 가능한 기능적 베타 유사 세포로 변형되는 능력을 입증했습니다5. 관련된 복잡한 면역 반응으로 인해 기존 섬 이식과 관련된 불리한 결과를 고려할 때 이러한 조사 라인은 특히 중요합니다. 수많은 연구에 따르면 관 유래 세포는 인슐린을 생성하는 본질적인 능력을 가질 뿐만 아니라 면역 관용을 촉진할 수 있는 특성을 보여줌으로써 전통적인 이식 기술과 관련된 몇 가지 문제를 완화할 수 있습니다 5,6,7,8. 이 세포는 체외에서 배양되어 인슐린을 방출할 수 있는 섬과 유사한 세포로 전환된 후 당뇨병 환자에게 이식될 수 있습니다. 스트렙토조토신 유발 당뇨병 쥐를 대상으로 한 실험을 포함하는 전임상 조사에서는 이러한 세포의 이식이 혈당 수치를 효과적으로 낮추고 인슐린 분비를 향상시킬 수 있음을 입증했습니다9.

우리의 접근법은 표준 세포 배양 배지를 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS)10,11,12, 이소옥사졸 9(ISX-9)13,14 및 GLP-115로 증강하여 분화 과정을 가속화하고 인슐린 생산 세포의 기능을 개선하는 데 중점을 두었습니다. 이러한 요인은 췌장 분화를 촉진하고 인슐린 분비를 향상시키는 데 필수적인 것으로 보고되었습니다. 이러한 구성 요소의 통합은 기능적인 섬 유사 세포를 보다 효율적으로 달성하여 포도당 자극에 반응하여 인슐린을 생성하고 방출하는 능력을 보장하는 것을 목표로 했습니다 9,10,11,12,13,14.

섬 이식에서 면역 거부반응은 성공적인 결과를 달성하는 데 중요한 장애물이 됩니다. 동종 이식된 섬은 면역 공격에 취약하므로 거부반응을 피하기 위해 면역억제 요법이 필요합니다16,17. 섬 이식 중 면역 거부반응에 췌관 세포의 관여는 발전하는 연구 분야를 나타냅니다. 관 세포는 면역 거부반응을 감소시킬 수 있는 특성을 가질 수 있으며, 이는 이식된 섬이 생존하고 제대로 작동할 가능성을 높일 수 있다고 생각됩니다. Ilievaet al. 관 세포와 공동 배양된 섬이 감소된 중심 괴사 및 세포사멸을 나타내어 면역 매개 손상에 대한 보호 효과를 나타냅니다. 이 효과는 Marín-Cañas et al. (2019)18. 면역 거부반응은 특히 제1형 당뇨병에서 섬 이식의 성공에 상당한 어려움을 초래하기 때문에 보호 효과는 필수적입니다. 섬 이식편의 관 세포는 향상된 이식편 기능 및 생존과 관련이 있으며, 이는 면역 반응을 완화하는 면역 조절 인자를 분비하는 능력에 기인할 가능성이 높습니다19.

유망한 발전에도 불구하고 임상 사용을 위한 이러한 세포 기반 치료법의 운영 효능과 안전성을 보장하려면 몇 가지 장애물을 해결해야 합니다. 유도된 세포가 천연 베타 세포에 필적하는 기능적 특성을 나타내는지 확인하고 면역 체계 공격으로부터 이러한 세포를 보호하여 장기간의 생존과 기능을 보장하는 효과적인 기술을 확립하는 것이 필수적입니다20,21. 이 연구 영역이 진행됨에 따라 제1형 당뇨병 치료에서 관 세포 유래 인슐린 생성 세포의 가능성을 활용하려면 이러한 장애물에 대한 포괄적인 지식과 해결이 필수적일 것입니다 22,23,24.

이 연구는 스트렙토조토신 유도 당뇨병 쥐 모델에서 혈당 조절 회복을 위해 최적의 조건에서 개발된 관 세포 유래 섬 유사 세포의 생체 내 효율성을 평가하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

이 연구는 ARRIVE 권장 사항을 준수하여 연구의 설계, 실행 및 보고가 동물 복지 및 실험 무결성(https://arriveguidelines.org)에 대한 높은 기준을 충족하는지 확인했습니다. 앙카라 메디폴 대학교는 윤리위원회(AMUHADYEK-12-09.05.2025)의 승인과 기관 승인을 확보했습니다. 모든 방법은 해당 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 모든 조치는 동물의 고통을 최소화하고 과학적 목표를 달성하는 데 필요한 최소한의 동물을 고용하기 위해 제정되었습니다.

1. 용액 준비

  1. 효소 용액: 분말 클로스트리디움 히스톨리티쿰 콜라게나제 유형 V 50mg으로 콜라게나제 용액을 준비합니다. 콜라게나제와 HBSS(Ca-Mg 함유)를 결합하여 50mL 용액을 준비하여 1mg/mL의 농도를 달성합니다. 샘플당 7mL의 용액을 사용하고 나머지는 -20°C의 냉동실에 넣습니다.
    참고: 콜라게나제의 권장 농도는 1mg/1mL입니다. 주사기에 넣기 전에 콜라게나제를 미리 준비된 HBSS 용액과 1mg/mL의 농도로 혼합해야 합니다.
  2. 세척액 1: 페놀 레드 프리 HBSS 500mL에서 62.5mL를 추출합니다. 나머지 HBSS에 50mL의 FBS를 매우 조심스럽게 첨가하십시오. 페니실린/스트렙토마이신 5mL(P/S), L-글루타민(L-Gln) 5mL, 1M HEPES 2.5mL를 첨가합니다. 부피를 500mL로 가져옵니다.
    참고: 페놀 레드를 첨가하면 최종 부피는 88% HBSS, 10% FBS, 1% P/S 및 1% l-Gln으로 구성됩니다. 거품이 생기는 것을 방지하고 정확성을 보장하려면 소 태아 혈청을 단계별로 조심스럽게 혼합하십시오.
  3. 세포용 배양 배지 및 세척액 2: Roswell Park Memorial Institute 배지(RPMI w/L-Gln) 500mL에서 62.5mL를 추출합니다. 나머지 RPMI에 50mL를 점진적으로 추가하는 동안 FBS가 거품이 나지 않도록 주의하십시오. 1M HEPES 2.5mL, P/S 5mL 및 L-Gln 5mL를 추가합니다. 총 부피가 500mL인지 확인합니다. 4°C에서 보관하십시오.
  4. 밀도 구배 용액: 1100mg/mL 밀도 용액을 HBSS 용액으로 희석하여 최종 밀도 용액을 준비하여 1062-1096mg/mL의 중간 밀도 범위를 얻습니다. 정확성을 보장하려면 밀도계로 준비된 각 용액의 밀도를 확인하십시오. 1077 농도 용액을 기준으로 사용하십시오. 원하는 농도(1062-1096mg/mL)를 얻으면 용액을 밀폐 용기에 옮기고 안정성을 유지하기 위해 4°C의 어두운 곳에 보관합니다.
  5. 0.4% 트리판 블루 용액을 준비합니다. 세포 발달은 pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS)에 의해 촉진됩니다.
  6. 세포 배양 성장 배지: Roswell Park Memorial Institute 배지(RPMI)와 Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DMEM-저포도당)를 각각 43.4mL씩 결합합니다. 10% 송아지 태아 혈청(FCS), 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS), 1% L-글루타민(L-Gln), 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S) 및 0.2mL의 1M HEPES를 첨가합니다. 최종 부피를 100mL로 구성합니다. 4°C에서 보관하십시오.
  7. 세포 배양 분화 배지: 43.4mL의 RPMI와 43.4mL의 DMEM-저포도당을 첨가합니다. 10% FCS, 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS), 1% L-Gln, 1% P/S 및 0.2mL의 1M HEPES를 혼합물에 첨가합니다. 또한, 4mL의 에탄올에 희석된 1μL의 이소옥사졸 9(ISX-9)를 분화 배지에 첨가합니다. 마지막으로, 50nM 농도의 글루카곤 유사 펩타이드 1(GLP-1) 용액 24μL를 세포 배양 배지에 첨가합니다.
    참고: ISX-9 및 GLP-1은 배양 변경 중에만 신선하게 추가됩니다. 그들은 미리 준비되어 있습니다. 모든 문화 자료에는 신선한 준비가 필요합니다.
  8. 디티존(DTZ) 용액: 디티존 100mg을 디메틸설폭사이드(DMSO) 20mL에 녹이고 잘 섞는다. 생성된 용액에 HBSS 30mL를 첨가하고 균질한 혼합물이 얻을 때까지 저어줍니다. 용액 0.2 또는 0.4 μm 필터를 필터링합니다. 여과된 용액에 50mL의 HBSS를 첨가합니다. 준비 날짜로 용액에 라벨을 붙입니다. 고형물이 완전히 분해되면 0.4μm 필터 장치를 통해 용액을 실행합니다. 여과된 용액을 2mL 튜브에 넣고 해동한 후 즉시 사용하십시오. 만든 용액은 -20°C에서 보관하십시오.
  9. 크렙스 용액: 250mL 용기에 염화나트륨 1.68g(115mM용), 중탄산나트륨 0.50g(24mM용), 염화칼륨 0.09g(5mM용), 염화마그네슘 0.05g(1mM용), 염화칼슘 0.09g(2.5mM용), 소 혈청 알부민 0.25g(0.1%)을 첨가합니다. 1M HEPES 6.25mL를 첨가합니다. 탈이온수를 추가하여 부피를 250mL로 조정하고 모든 것이 결합될 때까지 저어줍니다. 1 M NaOH 또는 1 M HCl을 사용하여 pH를 7.3 내지 7.5 범위로 조정합니다. 0.22 μm 필터를 통해 여과합니다. 용액을 실온에 보관하십시오. 37°C의 수조에서 사용할 준비가 되면 용액을 추가합니다.
  10. 고포도당 농도 용액: 149.1mg의 D-(+)-포도당을 측정하여 튜브에 첨가합니다. 튜브에 50mL의 크렙스 용액을 넣고 흔들어 완전히 혼합합니다. 0.22μm 필터를 통해 여과합니다.
  11. 저포도당 농도 용액: 16.7mM 고포도당 농도 용액 1mL와 크렙스 용액 9mL를 결합합니다.

2. 쥐로부터 췌장 분리

  1. 체중이 220g에서 280g 사이인 Wistar Albino 실험실 쥐 3마리(생후 3개월/수컷)의 코호트로 시작합니다. 케타민(35-50mg/kg)과 자일라진(5-10mg/kg)의 조합을 사용하여 동물을 마취합니다. 페달 철수 반응의 부족으로 마취 깊이를 확인하십시오. 눈이 건조해지지 않도록 수의학 연고를 바르십시오.
  2. 가위로 백선을 따라 3-4cm 정중선 복부 절개로 수술 과정을 시작합니다. (그림 1A). 횡격막을 들어 올리기 위해 손가락으로 흉곽에 부드러운 물리적 압력을 가하여 간을 섬세하게 조작합니다. 간을 외부에 배치하고 안정성을 위해 멸균 거즈 위에 놓습니다.
  3. 체중 28mg/g의 용량으로 표준화된 콜라게나제 용액을 준비하고 체중이 250 내지 300g 사이의 쥐를 위해 7mL(약 7g)를 주사기에 흡입합니다. 각 동물의 체중에 따라 용액 부피를 수정합니다.
  4. 췌관을 절개합니다. 가는 혈관 가위를 사용하여 간 근처의 덕트를 자릅니다. 췌장 및 주변 맥관 구조에 대한 해부학적 위치를 사용하여 덕트를 식별합니다. 정확성을 보장하기 위해 근처의 혈관 및 조직 특징과 같은 위치 신호를 사용하십시오. 폐색을 위해 이 지점에서 완벽한 절단을 한 번 만드십시오.
    참고: 절개 부위는 미미하고 너무 작아서 정확하게 측정할 수 없었지만 카테터 삽입이 가능할 만큼 충분히 넓었습니다. 절개를 통해 카테터를 부드럽고 효율적으로 배치할 수 있어 주변 조직에 대한 외상을 최소화할 수 있습니다.
  5. 생성된 관 개구부 내에 내면이 통합된 카테터를 삽입합니다(그림 1B). 올바르게 배치되면 수술용 클램프(예: 마이크로 겸자)를 사용하여 카테터를 고정하여 이탈을 방지합니다.
  6. 점진적이고 의도적인 플런저 억제를 통해 제어된 주입으로 콜라게나제 효소 용액을 투여합니다.
  7. 팽창 후 미세한 수술 도구를 사용하여 주변 구조에서 췌장 조직을 조심스럽게 분리하십시오. 조직 손상을 최소화하기 위해 정확하고 부드러운 조작으로 절제를 신속히 수행하십시오. 제거 직후 췌장을 얼음 위의 50mL 튜브에 넣어 효소 활동을 멈춥니다.
  8. 전체 과정은 하나의 췌장에 대해 약 60초가 소요됩니다25. 또한 모든 췌장이 충혈될 때까지 콜라게나제와 제거된 췌장을 얼음 위에 보관하십시오.

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그림 1: 췌장 처리. (A) 십이지장으로 열리는 췌관의 클램핑 및 (B) 콜라게나제 유형 5 팽창은 췌장의 이미지를 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3 췌장 조직에서 관 세포의 분리

  1. 외과적 적출 후, 췌장을 37°C 수조에서 12분 동안 배양합니다.
  2. 25mL의 세척액 1을 튜브에 첨가하여 콜라게나제 활성을 중화시킵니다. 췌장 조직의 분해를 촉진하기 위해 튜브를 수동으로 흔듭니다. 층류가 있는 멸균 필드에서 모든 후속 절차를 수행합니다.
  3. 모든 미디어를 얼음 위에 보관하십시오. 샘플을 4°C, 100 x g 에서 1분 동안 원심분리하고 브레이크를 최대 설정으로 설정합니다. 상청액을 버리십시오. 세포 펠릿에 25mL의 세척액 1을 첨가하고 혼합물을 재현탁합니다.
  4. 원심분리를 다시 수행하고 상층액을 버립니다. 펠릿에 25mL의 세척액 1을 첨가하고 재현탁합니다. 처리된 췌장 조직을 425μm 강철 메쉬를 통해 걸러내어 잔류 혈관 또는 소화되지 않은 조직 조각을 제거합니다.
  5. 여과 후 세척액 1로 부피를 25mL로 만듭니다. 4°C에서 1분 동안 100 x g 에서 1회 원심분리를 수행합니다. 상청액을 제거합니다.
  6. RPMI 배지 50mL를 추가한 후 멸균 플라스틱 피펫을 사용하여 펠릿을 새 튜브로 옮깁니다. 샘플을 4°C에서 1분 동안 100 x g 으로 다시 원심분리합니다. 상층액을 버리고 추가 분석을 위해 펠릿을 보관합니다.
    참고: 나머지 모든 단계는 세포 배양 실험에 적합한 멸균 조건에서 층류 캐비닛 내부에서 수행되었습니다.
  7. 마지막 펠릿 이후에 획득한 펠릿에 밀도 용액 1.077 10mL를 첨가한 다음 손가락으로 튜브의 가장자리를 두드려 펠릿을 부드럽게 파괴하고 균질화합니다.
    참고: 주변 췌장 조직에서 섬 세포를 분리하기 위한 밀도 범위는 약 1.00126인 배지의 밀도와 달리 약 1.077입니다. 결과적으로 우리는 이 목표를 위해 밀도 솔루션 1.077 솔루션을 사용했습니다.
  8. RPMI 10mL를 첨가하고 브레이크를 끈 상태에서 4°C에서 12분 동안 600 x g 에서 원심분리합니다. 이 절차는 튜브 내부에 밀도 기반 분열을 확립하여 RPMI 층 바로 아래에 위치한 RPMI 층 바로 아래 층에 섬 세포를 축적하게 했습니다.
  9. 섬 세포를 모두 제거하고 RPMI를 제거했습니다. 이 단계의 목표는 췌도 세포를 정제하여 췌장 조직에서 제거를 향상시켜 보다 순수한 관 세포 분리 과정을 만드는 것이었습니다.
  10. 피펫을 사용하여 여분의 췌장 조직을 새 50mL 튜브로 제거합니다. 10mL의 1.096 밀도 용액을 조직 펠릿에 첨가합니다.
  11. 그런 다음 주사기로 10mL의 1.062 밀도 용액 구배를 천천히 추가합니다. 구성 요소의 균일한 분포를 유지하는 데 주의하십시오. 가장 밀도가 높은 것부터 가장 밀도가 낮은 것까지 순으로 용액을 쌓아 그라데이션을 만듭니다.
  12. 위에 RPMI 10mL를 추가합니다. 브레이크 없이 4°C에서 12분 동안 600 x g 튜브를 원심분리합니다. 회전 후 다양한 밀도 층이 보입니다. 관 세포는 RPMI 층 아래의 중간층에 있습니다.
  13. 일회용 파스퇴르 피펫을 사용하여 관 세포를 조심스럽게 제거하고 별도의 50mL 튜브에 넣습니다. 세척액 2 25mL를 넣고 튜브를 손가락으로 두드려 현탁액을 부드럽게 혼합합니다.
  14. 튜브를 100 x g 에서 1분 동안 회전시키고 상청액을 버립니다. 펠릿으로 원심분리를 두 번 더 수행합니다. 마지막 세척 후, 펠릿(27)에 세척액2 mL를 첨가한다.

4. 관세포의 분리 및 배양

  1. 수확한 세포를 T25 플라스크에 접종하고 예열된 세포 배양액 5mL를 추가합니다. 인큐베이터를 5% CO2및 37°C로 유지합니다.
    참고: 생리학적 온도를 안정적으로 유지하는 것은 세포 배양이 작동하기 위해 중요하므로 모든 용액을 사용하기 전에 약 37°C로 가열했습니다.
  2. 24시간 후 배지를 조심스럽게 흡인합니다. 세척액 2로 세포를 두 번 헹굽니다. 신선한 세포 배양 배지를 추가하고 플라스크를 인큐베이터로 되돌립니다. 플라스크 표면에 부착된 세포를 관 세포라고 불렀습니다.
  3. 3일마다 성장 배지를 교체하십시오. 배지의 색상이 매우 빨리 변한다면 영양분이 손실되고 산성화되고 있음을 의미하며 배지를 더 자주 교체해야 함을 나타냅니다.
  4. 플라스크의 세포가 80% 합류에 도달하면 세포를 계대합니다. 1-2mL의 PBS 2x로 세척하고 여분의 배지를 제거합니다.
  5. 효소 해리 용액(페놀 레드 제외) 2mL를 첨가하여 효소 분해 과정을 시작하고 플라스크 표면에서 세포를 분리합니다.
  6. 2-3분 동안 배양하고 10배 현미경으로 세포 박리를 평가합니다. 세포가 부분적으로 부착된 상태로 유지되면 37°C에서 추가로 2분 동안 다시 배양합니다.
  7. 세포가 플라스크 표면에서 완전히 분리된 후, 효소 해리 용액의 4배에 해당하는 약 8mL의 세포 성장 배지를 첨가하여 효소 소화를 중지합니다. 플라스크 벽을 가볍게 두드립니다.
    참고: 세포 분리를 도울 수 있는 태핑은 전체 배양 시간을 단축하고 효소가 세포막을 손상시키는 것을 막아 효소 해리 용액과 장기간 접촉한 후에도 이러한 일이 발생하도록 합니다.
  8. 세포 배양 배지를 첨가한 후, 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮기고 25°C에서 10분 동안 150 x g 으로 원심분리하여 약한 감속 설정(속도 9 브레이크)으로 세포를 펠릿화합니다.
  9. 상청액을 버리십시오. 세포 펠릿을 6-8mL 세척액에 재현탁합니다 2. 위와 같이 원심분리를 반복합니다. 상청액을 버리십시오. 효소 해리 용액의 철저한 제거를 보장하기 위해 절차를 반복했습니다.
  10. 부드러운 피펫팅을 사용하여 펠릿을 5mL의 신선한 세포 배양 배지에 재현탁하여 균일한 세포 현탁액을 만듭니다. 이 단계에서 세포 계수를 수행합니다.
  11. 10μL의 세포 현탁액과 10μL 트리판 블루를 혼합하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
  12. 계수된 현탁액을 사용하여 T25 플라스크당 1 ×10 6 개의 세포를 시종합니다.
    참고: 이 무렵 대부분의 세포는 관 세포로 확인되었습니다. 수행된 세포 수에 따라 많은 수의 세포가 각 접시에 파종되었습니다. 실험에서 본 내용을 바탕으로 세포는 하나의 플라스크에서 최상의 합류 수준에 도달하면 두 개의 서로 다른 T25 플라스크에 퍼졌습니다. 이는 증식 효율을 높게 유지하기 위해 수행되었습니다. 우리는 이 방법을 사용하여 쥐 췌장 조직에서 관 세포를 성공적으로 분리할 수 있었습니다. 성공적으로 분리된 후 세포는 연구 계획에 따라 추가 실험을 위해 준비되었습니다.
  13. 4절대까지 배양을 계속합니다. 최적의 성장 조건을 유지하기 위해 필요한 경우 세포를 계대합니다.
    참고: 계대 4부터, 3일과 9일 사이에 세포 수가 눈에 띄게 증가했습니다. 세포는 더 많은 주기 후에 분열할 수 있는 능력이 떨어지는 경향이 있기 때문에 이 방법은 생존 가능한 세포가 충분한지 확인했습니다. 관 세포가 충분히 자라자 섬과 같은 세포로 변하기 시작했습니다. 우리가 발견한 바에 따르면, 3단계와 6단계 사이의 세포는 증식 속도가 가장 빠릅니다. 계대 4는 관 세포 수의 특히 눈에 띄는 증가를 보여줍니다. 그러나 6번 통과 이후에는 증식 능력이 감소했습니다. 프로토콜은 생존력과 유용성을 유지하면서 적절한 수의 세포를 얻기 위해 이러한 결과를 기반으로 조정되었습니다28.

5. 관 세포가 섬과 같은 클러스터로 분화

  1. 표준 계대 절차를 사용하여 계대 4개의 관 세포를 수확합니다. 1-2mL PBS로 두 번 세척하여 잔류 배지와 부착되지 않은 세포를 제거합니다.
  2. 플라스크에 효소 해리 용액 2mL(페놀 레드 제외)를 첨가합니다. 37°C에서 2-3분 동안 배양하고 10배 현미경으로 모니터링합니다.
  3. 세포가 부착된 상태로 유지되면 2분 더 배양합니다. 8mL 세포 성장 배지를 첨가하여 효소 반응을 중지합니다.
  4. 현탁액을 15mL 튜브로 옮기고 150×g에서 25°C에서 10분 동안 원심분리하고, 속도를 높이고 감속하기 위해 9를 설정합니다.
  5. 상청액을 버리십시오. 펠릿을 6-8mL 세척액에 재현탁합니다 2. 원심분리하여 상청액을 버립니다.
  6. 최종 펠릿을 5mL의 신선한 배지에 재현탁합니다. 앞에서 설명한 대로 셀의 수를 계산합니다.
  7. 6웰 플레이트에 웰당 1×10 5 개의 세포를 시드하고 웰당 3mL 배지를 추가합니다. 37°C, 5% CO2에서 배양합니다.
  8. 처음 7일 동안은 3일마다 배지를 교체하십시오. 중간 색상이 빠르게 변하는 경우 주파수를 조정하십시오.
  9. 7일 후에 점차적으로 분화 배지로 전환합니다. 총 15일 동안 배양을 계속합니다(7일 성장 + 8일 분화). 분화 중에는 2일마다 배지를 교체하십시오.
  10. 8일째에 분화 단계를 시작합니다. 4일 후, PBS로 세포를 두 번 세척하고 500μL 효소 해리 용액을 첨가합니다.
  11. 2-3분 동안 배양하고 2mL의 성장 배지를 첨가하여 반응을 중지합니다. 25°C에서 10분 동안 150 x g 로 원심분리합니다. 6웰 플레이트에 웰당 1 x 105 세포를 재현탁 및 재시종합니다.
  12. 15일째에 완전한 현미경 분석을 수행하여 섬과 같은 세포 응집체의 형성을 명확하게 특성화하고 확인합니다24.

6. 디티존에 의한 분화된 관 세포의 아연 농도 정량

  1. -20°C 보관에서 DTZ 용액을 해동하고 평형을 이룹니다. 15일 분화된 세포의 각 웰에 3-4방울의 DTZ 용액을 첨가합니다. 현미경으로 관찰하십시오. 적색 염색28(그림 2)에 의해 인슐린 생성 세포를 식별합니다.

figure-protocol-2
그림 2: 섬 유사 관 세포의 현미경 이미지. (A) 배양 11일(20x), (B) 배양 13일(20x), (C, D) 배양 15일(20x)의 이미지. 세포는 Dithizone으로 염색한 후 시각화되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

7. 포도당 자극 테스트

  1. 웰당 1mL의 분화 배지가 있는 24웰 플레이트에 웰당1 x 10 4개의 섬 유사 클러스터를 시종합니다.
  2. 15일째에 포도당으로 세포를 자극합니다. 기존 배지를 제거하고 1mL의 저포도당 용액(1.67mM)을 추가합니다. 37°C에서 1시간 배양합니다.
  3. 배지를 수집하고 2mL 튜브로 옮깁니다. 고포도당 용액 1mL(16.7mM)를 첨가합니다. 1시간 동안 배양합니다. 분석을 위해 배지를 수집합니다. 서로 다른 포도당 용액을 첨가하는 사이에 1시간 간격으로 세포 배양 배지를 수집합니다.
  4. 제조업체의 지침에 따라 인슐린 ELISA를 수행합니다. 호일 파우치에서 제거한 후 ELISA 절차를 시작하기 전에 마이크로플레이트가 실온으로 평형을 이루도록 합니다.
  5. 시료, 대조군 및 표준 웰에 시약 10μL를 추가합니다. 75μL의 작업 접합체 용액을 추가합니다. 플레이트를 선택하고 실온에서 2시간 동안 흔들면서 (700-900rpm) 배양합니다.
  6. 350μL의 세척 완충액으로 웰을 6회 세척합니다. 웰당 100μL의 3,3',5,5,5,5-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질을 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 진압(700-900rpm)하면서 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다.
  7. 웰당 100μL의 정지 용액을 첨가하고 플레이트를 부드럽게 교반하여 혼합하여 공정을 중단합니다. 기포를 제거하고 450nm에서 흡광도를 읽습니다. 정지 용액27을 첨가한 후 30분 동안 측정합니다.

8. 섬 및 섬 유사 관 세포 이식

  1. 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)을 사용하여 쥐를 마취합니다. 수술 부위를 소독하고 드레이프합니다. 2-3cm 정중선 절개를 합니다.
  2. 견인기를 사용하여 장을 옮기고 문맥을 노출시킵니다. 정맥 절개술을 수행하고 식염수로 미리 채워진 카테터를 삽입합니다(그림 3A).
  3. 100-500μL의 세포 현탁액을 문맥에 주입합니다. 카테터를 제거하고 봉합사나 접착제로 정맥 절개술을 닫습니다. 복부를 닫고 회복을 모니터링하여 필요에 따라 진통을 제공합니다(그림 3B).

figure-protocol-3
그림 3: 섬 및 섬 유사 세포의 이식. (A) 섬 및 섬 유사 세포를 이식하는 데 사용되는 멸균 정맥 내 cath. (B) 섬 및 섬 유사 세포를 멸균 주사기에 이식합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

9. 스트렙토조토신(STZ) 유도 당뇨병 쥐

  1. 빠른 쥐 12시간. 45mg/kg STZ를 차가운 구연산염 완충액(pH 4.5)에 용해시켜 복강 내 투여합니다.
    참고: STZ 주사 전 12시간 동안 금식하면 GLUT2 발현이 향상되어 췌장 베타 세포에서 포도당 수송이 촉진됩니다. 이 과정은 세포로의 STZ 흡수를 증가시켜 베타 세포 손상을 더 크게 초래합니다. 이 메커니즘은 더 심각한 고혈당증의 진행을 촉진하고 당뇨병 모델의 효과를 향상시킵니다.
  2. 주사 후 48-72시간 혈당(250mg/dL)으로 당뇨병을 확인합니다>. 일반적으로 혈당 수치가 250mg/dL 이상에 도달한 쥐를 당뇨병으로 분류하고 실험에 포함시킨다29.

10. 이식을 위한 섬 및 섬 유사 세포의 준비

  1. 효소 해리 용액으로 1분 동안 처리한 후 세포를 수확합니다. 표면에 달라붙은 세포를 긁어냅니다. 신선한 배지로 교체하고 세포를 수집합니다.
  2. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 100-150μL의 식염수에 재현탁합니다. 세포 계수를 수행하고 세포 수를 쥐당 1000 IEQ 또는 800 섬 또는 쥐당 1 x 105 섬 유사 세포로 조정합니다.

11. 문맥 이식

  1. 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 복강내 주사로 동물을 마취시킵니다.
  2. 멸균 용액(베타딘 또는 70% 에탄올)으로 동물의 복부 부위를 소독하십시오. 멸균 드레이프로 수술 부위를 감싸십시오.
  3. 복강에 접근하기 위해 약 2-3cm 길이의 정중선 절개를 합니다.
  4. 장을 옮겨 간을 드러냅니다. 멸균 견인기로 간의 왼쪽과 오른쪽 엽을 고정합니다. 문의 정맥을 찾기 위해 간의 복부 표면을 노출시킵니다.
  5. 폴리에틸렌 카테터(PE-10 또는 PE-50)를 식염수로 미리 헹구고 완전히 채웁니다. 미세 수술 겸자를 사용하여 문맥의 가지(일반적으로 왼쪽 또는 오른쪽 측면 가지)를 고정합니다.
  6. 경미한 정맥 절개술(약 1-2mm)을 수행합니다. 정맥 절개 부위에 카테터를 조심스럽게 삽입합니다. 변위를 방지하려면 봉합사 재료나 겸자를 사용하여 일반적으로 6-0 봉합사를 사용하여 카테터를 고정합니다.
  7. 멸균 식염수를 점차적으로 투여하여 카테터의 정확한 위치를 확인하십시오. 카테터는 준비된 섬 세포와 섬 유사 세포 현탁액을 문맥으로 점차적으로 전달했습니다. 총 부피는 100-500 μL입니다.
  8. 주입이 완료되면 카테터를 제거하고 멸균 조직 접착제 또는 흡수성 봉합사를 사용하여 정맥 절개 부위를 밀봉합니다.
  9. 출혈 관리를 수행합니다. 간 주변의 모든 조직의 위치를 바꾸고 흡수성 실을 사용하여 복부 근육을 봉합합니다. 봉합사나 클립으로 피부를 고정합니다.
  10. 따뜻한 환경에서 동물을 감시하십시오. 마취에서 깨어나는 동안 통증 관리에 적합한 진통제를 제공합니다(예: 부프레노르핀 0.1mg/kg). 48시간 동안 동물을 관찰합니다. 감염, 수술 부위의 부종 또는 출혈의 징후를 검사합니다30.

12. 혈당 모니터링

  1. 초기 혈당 수치를 평가합니다. 쥐를 조심스럽게 잡고 란셋을 사용하여 꼬리 끝에 작은 상처를 만듭니다. 멸균 면봉을 사용하여 첫 번째 혈액 한 방울을 부드럽게 제거합니다.
  2. 포도당 테스트 스트립에 두 번째 혈액 방울을 바르고 기준선 포도당 수치31을 기록합니다.

13. 복강내 포도당 내성 검사

참고: 쥐는 혈류의 포도당 청소 효율을 평가하기 위해 복강내 포도당 내성 검사(IPGTT)를 받습니다. 이 검사는 포도당 대사, 인슐린 감수성 및 가능한 당뇨병 상태에 대한 통찰력을 제공합니다. 복강내 내당능 검사는 이식 후 15일째 15일째에 시행하였다. IPGTT 전에 지정된 금식 기간을 구현하는 주요 근거는 기초 포도당 수치를 안정화하고 일관된 대사 상태를 보장하는 것입니다. 단식 기간은 간 글리코겐 저장량의 고갈을 촉진하여 내당능 반응을 보다 신뢰할 수 있게 평가할 수 있습니다. 6시간 동안 단식하면 식후 효과가 감소하는 반면, 하룻밤 단식(약 12-16시간)은 뚜렷한 영향을 미쳐 잠재적으로 인슐린 감수성과 포도당 대사에 영향을 미칠 수 있습니다.

  1. 쥐에게 6시간의 금식 기간을 적용하고 밤새 물만 접근할 수 있도록 하여 금식 시간이 12시간을 초과하지 않도록 합니다. 포도당 측정의 변동성을 줄이기 위해 모든 피험자에 대해 균일한 금식 기간을 보장합니다.
  2. 포도당을 투여하기 전에 쥐의 무게를 측정하십시오. 멸균 용액을 준비하려면 포도당 20g을 멸균 식염수 100mL에 녹입니다.
    참고: 표준 복용량은 일반적으로 포도당 2g/체중 kg(2g/kg)입니다. 주어진 총 부피는 동물의 체중에 따라 결정됩니다.
  3. 기본 혈당 수치를 평가합니다. 쥐를 잡고 란셋을 사용하여 꼬리 끝에 작은 절개를 합니다. 멸균 면봉을 사용하여 첫 번째 혈액 한 방울을 부드럽게 제거합니다.
  4. 포도당 테스트 스트립에 두 번째 혈액 방울을 바르고 기본 포도당 수치를 기록합니다.
  5. 쥐의 체중을 기준으로 2g/kg의 비율로 적절한 양의 포도당 용액을 투여합니다.
  6. 포도당 용액을 복강내(IP) 투여하기 전에 쥐를 부드럽게 만지십시오. 포도당을 피하 조직이나 장기가 아닌 복강에 주입하고 올바른 투여인지 확인하십시오.
  7. 포도당 주사 후 포도당 수치를 모니터링하기 위해 지정된 간격으로 혈액 샘플을 수집합니다. 일반적인 시간 간격은 주사 후 15, 30, 60, 90 및 120분입니다.
  8. 각 지점에서 꼬리 정맥을 절단하여 혈액을 수집합니다. 각 채혈 전에 알코올 면봉으로 꼬리를 닦아야 합니다.
  9. 지정된 각 시점에서 혈당 수치를 측정하고 혈당 측정기를 사용하여 문서화합니다.
  10. 검사하는 동안 쥐에게 불편함이나 부작용의 징후가 있는지 모니터링하십시오. 측정 사이에 동물의 스트레스를 최소화하려면 따뜻하고 조용한 환경을 유지하십시오.
  11. 마지막 혈당 측정 후 꼬리 상처를 청소하고 동물을 위로하십시오29.

14. 채혈 후 ELISA를 통한 인슐린 분석

참고: 이 프로토콜의 단계는 쥐의 복부 대동맥에서 혈액을 채취한 다음 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 방법을 사용하여 인슐린을 테스트하는 것입니다.

  1. 앞서 설명한 대로 채혈 전에 쥐를 마취하십시오. 마취된 쥐를 멸균 수술 플랫폼에 바로 누운 자세로 놓습니다.
  2. 복부를 면도하고 70% 에탄올 또는 요오드 용액을 사용하여 해당 부위를 소독하여 멸균을 보장합니다.
  3. 메스로 정중선 절개를 하여 피부와 근육층을 관통하고 복강을 노출시킵니다.
  4. 척추에 인접한 복부 대동맥에 접근하기 위해 장을 후퇴시킵니다. 헤파린 주사기를 사용하여 바늘을 복부 대동맥에 약간의 각도로 삽입합니다.
  5. 혈액(쥐의 크기에 따라 보통 1-3mL)을 주사기에 채취합니다. 혈관 붕괴나 혈액 용혈을 피하기 위해 점진적이고 일관된 흡입을 적용하십시오.
  6. 채취한 혈액을 원심분리기 튜브에 넣고 얼음 위에 보관합니다.
  7. 시술 후 동물을 안락사시키는 경우 기관의 윤리 지침에 따라 안락사를 시행하십시오.
  8. 혈장 또는 혈청의 분리를 보장하기 위해 수집된 혈액을 4°C에서 10-15분 동안 300 x g 으로 원심분리합니다. 상청액을 새 튜브로 옮기고 후속 인슐린 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다.
    참고: ELISA 결과의 정확성에 영향을 미칠 수 있으므로 채혈 중 용혈을 피하는 것이 중요합니다(그림 4)29.

figure-protocol-4
그림 4: 이식 후 15일째 실험 종료 시 인슐린 분석을 위해 쥐의 꼬리 정맥에서 혈액 샘플을 혈액 튜브로 채취했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

15. ELISA에 의한 인슐린 측정

  1. 제조업체의 지침에 따라 인슐린 ELISA 키트를 준비하십시오. 분석을 시작하기 전에 모든 시약, 표준물질 및 샘플이 실온에 도달하도록 하십시오.
  2. 표준, 대조군 및 쥐 혈청 샘플에 대해 ELISA 플레이트에 필요한 웰 수를 결정합니다.
  3. ELISA 키트 프로토콜에 표시된 대로 희석하여 분석을 위해 쥐 혈청 샘플을 준비합니다(예: PBS에서 1:10 희석).
  4. 연속 희석으로 인슐린 표준물질을 준비하여 표준 곡선(예: 0 - 10 ng/mL 범위)을 생성합니다.
  5. 표준물질, 대조군 및 희석된 쥐 혈청 샘플(일반적으로 웰당 50-100μL)을 ELISA 플레이트의 표시된 웰에 분배합니다. 키트와 함께 제공된 검출 항체 용액을 각 웰에 분배하여 균일한 분포를 보장합니다.
  6. 실온에서 또는 제공된 지침에 따라 지정된 시간(일반적으로 1-2시간) 동안 플레이트를 배양합니다.
  7. 배양 후, 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 지정된 세척 완충액(일반적으로 0.05% Tween-20을 함유한 PBS)으로 웰을 세척해야 합니다. 키트 지침에 따라 세척 단계를 3배에서 5배까지 수행하고, 매번 세탁 후 남아 있는 액체가 완전히 제거되었는지 확인합니다.
  8. 각 웰에 기질 용액을 놓습니다. 기질은 효소에 결합된 항체와 상호 작용하여 색상 변화를 일으킵니다. 색상의 강도는 샘플에 존재하는 인슐린의 양과 관련이 있습니다. 키트에 표시된 시간(일반적으로 15분에서 30분 사이) 동안 플레이트를 어둠 속에서 배양합니다.
  9. 각 웰에 중단 용액을 추가하여 비색 반응을 종료합니다. 색상 변화는 일반적으로 노란색인 정지 용액을 첨가한 후 안정화됩니다.
  10. 450nm(또는 키트에 지정된 대로)로 설정된 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 광학 밀도(OD)를 즉시 측정합니다.
  11. 해당 광학 밀도(OD) 값에 대해 알려진 인슐린 표준의 농도를 플로팅하여 표준 곡선을 생성합니다.
  12. 표준 곡선과 해당 OD 값을 사용하여 쥐 혈청 샘플의 인슐린 농도를 계산합니다. 인슐린 수치는 ng/mL 또는 기타 적절한 단위로 보고해야 합니다29.

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결과

광학 현미경 분석

관 세포를 14일째 검사하는 동안 광학 현미경 분석 결과 세포가 뭉쳐 섬과 같은 구조를 형성하는 것으로 나타났습니다. 이러한 구조적 변화는 일정 기간이 지나면 관 세포가 조직 질서에 들어가 섬과 같은 모양을 얻음으로써 형태학적 특성을 변화시킨다는 것을 나타냅니다. 세포가 뭉쳐지는 경향은 아마도 세포간 통신과 미세 환경의 영향 때문일 것이며, 이는 섬 세포와 관 세포 사이의 가능한 전이 과정을 밝힐 수 있는 중요한 발견을 제공합니다(그림 2 및 그림 5).

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토론

다양한 출처의 섬 유사 세포의 기능적 능력에 대한 연구는 당뇨병 연구에 상당한 관심을 불러일으켰습니다. 초기 연구에 따르면 이러한 세포는 포도당 수치가 상승할 때 인슐린을 방출할 수 있으며, 이는 자연 췌도의 기능을 모방할 수 있음을 시사합니다. 연구자들은 디티존 염색을 활용하여 췌섬에 존재하는 특징적인 적색 염색에 의해 입증된 바와 같이 췌도 유사 세포의 표현형 유사성을 확인했습니다32. 당뇨병 쥐를 이식 모델로 사용한 결과 섬 유사 세포가 일반 섬 세포와 마찬가지로 혈당 수치를 조절할 수 있음이 밝혀졌습니다33.

관 세포를 섬 베타 세포로 형질전환하는 것은 특히 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1) 및 ISX-9와 같은 제제의 메커니즘을 통해 당뇨병 치료에서 유망한 연구 길을 나타냅니다. GLP-1은 인슐린 생산을 자극하고 베타 세포 생존력을 향상시키는 기능으로 인정받아 췌장 세포 재프로그...

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공개 사항

저자는 잠재적인 이해 상충을 보고하지 않았습니다.

감사의 글

저자는 연구에 기여한 실험실 팀에 감사를 표하고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% 염화나트륨Sahar Pharma췌장 제거 및 세포 이식용
10mL 혈청학적 피펫 - 멸균Corning4488분리용
24웰 플레이트Corning353047GSIS 용;
25mL 혈청학적 피펫 - 멸균Corning4489분리용
70% 에탄올 ISOLAB64-17-5
베타딘 바티콘올  1186쥐 소독용
Biocholl 1077SigmaL6715-BC췌장 정화용
Biocoll, 밀도 1.10g/mLSigmaL6155-BC췌장 정화용
혈당 측정기 및 포도당 테스트 스트립On Call Plus혈당 측정용
BSASigmaA9418크렙스
CaCl2 준비용시그마57647902크렙스
카테터 조성 준비용: 폴리에틸렌 카테터(정맥내 카테터)  비카실라24G  및 14G췌장 및 간용 
용 원심분리기ThermoST1R Plusnbsp;
콜라게나제 유형 V, ≥ 1 FALGPA 단위/mg 고체,
>125 CDU/mg 고체 		시그마C9263- 1G췌장 소화용
D-(+)-포도당 GSIS 및 IPGTTSigma50-99-7
SigmaD5130섬 결정용
DMSOSigmaD8779DTZ
Dulbecco' 해결용 s 수정된 독수리' s 중간(DMEM— 저포도당) Gibco11885084세포 배양용
Eppendorf 튜브ISOLAB세포 세척용
Falcon 튜브 (50 mL)ISOLABLB. IS.078.02.009분리용
소 태아 혈청(FBS)시그마N4637췌장 분리 및 배양용
바늘 및 봉합사 재료(크기 6-0 또는 7-0)PROLENE Blue 18" P-1 바늘 | 8697G췌장 제거 및 세포 이식
루카곤 유사 펩타이드 1(GLP-1) 알라딘rp174144세포 배양용
행크의 균형 소금 용액(Ca-Mg 함유 HBSS) 염소자리HBSS-1A효소 준비용
HBSS 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없음BIOCHROM  L2015췌장 분리용
HEPESLonza세포 배양용
인슐린 ElisaAlpco80-INSRT-E01인슐린용 elisa
인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS)GibcoITS -G세포 배양용
Isoxazole 9(ISX-9) 알라딘I304735-10mg세포 배양용
KCl시그마329820207크렙스 준비용
케타민 HCl 200 mg/mLNexGen쥐 마취용
층류 캐비닛노동 IldamBSC-1100IIA2-X분리 및 배양 기간 용
란셋Ayset28 G혈당
측정용L-글루타민 시그마59202c췌장 분리 및 배양용
MgCl2Sigma329759772krebs
마이크로플레이트 리더BioTek SynergyH1 다중 모드 리더슐린 elisa
마이크로플레이트 셰이커VWR  444-0270인슐린 엘리사
미세 수술 현미경EMZ-200TR3.9X 췌장 제거 및 세포 이식을 위해
미세 수술 가위 및 겸자Aesculap췌장 제거 및 세포 이식용
Millicell 행잉 세포 배양 인서트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 8.0µ m 밀리포어PIEP30R48 GSIS 의 경우;
NaCl시그마7647-14-5크렙스 준비용
NaHCO3시그마144-55-8크렙스 준비용
파스퇴르 피펫 3 MlBIOSIGMA분리용
페니실린/스트렙토마이신 췌장 분리 및 배양용시그마
산염 완충 식염수(PBS) 바이오크롬  L1815세포 계대용
견인기(간 및 결합 조직의 안정화용)Aesculap췌장 제거 및 세포 이식용
Roswell Park Memorial Institute Medium(RPMI w/L-Gln)CapricornRPMI-A췌장 분리 및 배양용
Steril Cotton TippedDynarex췌장 제거 및 세포 이식
멸균 주사기 (10mL)Ayset32MM 22GCollege Nase 반응
스톱워치KenkoKK613DIPGTT
스트렙토조토신 (STZ) 시그마18883-66-4당뇨병 쥐 발생
사기 드라이버 필터 장치(GP-0.22 및 마이크로; m-3 mm)MillexSLGP033RS세포 배양 배지 살균용
T25 플라스크Thermo130189배양용
TrypLE Express 시약Gibco세포 계대
수조용 노동 IldamALB128대학 반응
자일라진 2% w/v 주사용 용액마취용Rompun
쥐 의 소독용;분리 &Dithizone(DTZ)용 가는 글 준비용 인용 인 주 쥐

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