여기에서는 살아있는 HepG2 세포에서 Akt 활성화 및 인산화의 시공간 역학을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. Förster 공명 에너지 전달(FRET) 이미징은 암세포의 인슐린 신호 전달 경로 및 대사 조절에 대한 귀중한 통찰력을 제공하는 강력한 도구입니다.
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방법 논문
HepG2 세포에서 대사적으로 조절되는 Akt 활성화 역학의 Live-Cell Förster Resonance Energy Transfer Imaging
이 논문에서
요약
초록
대사적으로 조절되는 Akt 활성화는 인슐린 신호 전달 캐스케이드의 중요한 노드이며 당뇨병과 암의 관계에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. HepG2 세포에서 Akt 활성을 정확하게 정량화하기 위해 유전적으로 암호화된 Akt 특이적 바이오센서와 함께 Förster Resonance Energy Transfer(FRET)를 활용하여 강력하고 재현 가능한 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 FRET 기반 바이오센서를 발현하기 위한 HepG2 세포의 세포 배양, 이미징 접시 준비 및 transfection에 대한 자세한 단계를 설명하고 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 하드웨어 및 소프트웨어 구성에 대한 구체적인 지침을 제공합니다. 그 결과, HepG2 세포에서 인슐린 신호전달의 독특한 패턴을 보여주었으며, 이는 정의된 스위치 온 임계값을 가지고 있지만 스위치 오프 임계값은 없는 구성적 Akt 활성화를 특징으로 하는 비가역적 스위치를 나타냅니다. 대조적으로, myotubes는 가역 스위치를 표시합니다. HepG2 세포의 지속적인 Akt 활성화는 간 세포의 인슐린 저항성 및 대사 조절 장애의 기저에 있는 메커니즘을 시사하며, 대사 장애 및 암의 진행을 이해하는 데 더 넓은 의미를 갖습니다. 이 프로토콜은 다양한 질병 맥락에서 Akt 관련 신호 전달 경로 및 세포 행동을 탐색하기 위한 귀중한 프레임워크를 제공합니다.
서론
진성 당뇨병은 인슐린 저항성과 포도당 항상성 손상1을 특징으로 하는 전 세계적으로 주요 건강 문제를 제기합니다. 인슐린은 포도당 대사, 세포 성장 및 생존에 중추적인 역할을 하기 때문에 인슐린 신호 경로에 대한 포괄적인 이해는 이 질병의 병태 생리학을 밝히는 데 매우 중요합니다2. 수많은 연구에서 인슐린 신호전달이 다양한 암에 상당한 영향을 미치며, 인슐린 저항성이 종양 진행 및 환자의 나쁜 예후와 관련이 있음을 입증했습니다 3,4,5,6. 일반적으로 사용되는 간세포암 세포주인 HepG2 세포는 인슐린 저항성 및 대사 조절 장애와 암 발병 간의 상호 작용을 연구하는 데 유용한 모델 역할을 합니다7. 전통적으로 연구자들은 인슐린 반응을 등급이 매겨진 것으로 간주해 왔습니다. 그러나 최근 연구에 따르면 개별 세포는 쌍안정 반응을 보일 수 있으며, 특정 인슐린 농도 역치에서 발생하는 ....
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프로토콜
단일 HepG2 세포에서 Akt 인산화를 모니터링하기 위한 FRET 라이브 셀 이미징과 관련된 실험 단계의 개요가 그림 1에 나와 있습니다.
1. 플라스미드 획득, 증식 및 정제
참고: 이 섹션에서는 단일 세포 FRET 분석에 필요한 플라스미드를 획득, 증폭 및 정제하기 위한 필수 단계를 간략하게 설명합니다.
- pEevee-iAkt-NES-YPet 플라스미드를 활용합니다(그림 2A).
참고: 플라스미드는 일본 NIBB(National Institute for Basic Biology)의 Kazuhiro Aoki 교수가 아낌없이 제공했으며, Akt 모니터링에 사용되는 FRET 바이오센서와 해당 대조군에 대한 플라스미드 맵은 그림 2에 나와 있습니다. pEevee-iAkt-NES-ECFP (공여체; 그림 2B) 및 pEevee-iAkt-NES-Ypet (수용체; 그림 2C) 플라....
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결과
HepG2 세포의 Akt 활성화를 조사하기 위해 세포를 사전 코팅된 이미징 접시에 파종하고 Akt 인산화를 실시간으로 모니터링할 수 있도록 설계된 FRET 기반 바이오센서 pEevee-iAkt-NES(그림 2A)로 형질 주입했습니다. 형질주입 후, 세포는 대사 상태를 동기화하고 기저 인슐린 신호 전달을 최소화하기 위해 무혈청 배지에서 4시간 동안 혈청 결핍을 겪었습니다.
그 후 세포를 다양한 인슐린 농도(0 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 400 pM, 100 pM 및 0 pM)에 노출시켜 인슐린 신호 전달 경로를 체계적으로 활성화했습니다. 그림 10A에서 볼 수 있듯이, Akt 인산화의 용량 의존적 증가가 관찰되었습니다. 특히, 300 pM 인슐린에서 인산화의 급격한 증가가 발생하여 최대 Akt 활성화의 임계값을 표시했습니다. 이 농도를 넘어서면 인산화 .......
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토론
HepG2 세포에서 Akt 인산화를 모니터링하기 위한 라이브 셀 FRET 이미징 프로토콜에는 신뢰할 수 있고 재현성 있는 결과를 보장하기 위한 몇 가지 주요 단계가 포함됩니다. 첫 번째 중요한 단계는 세포 배양이며, 여기에는 일상적인 세포 유지 관리, 이미징 접시 코팅 및 세포 파종이 포함됩니다. 타임 랩스 이미징 실험 중 세포 부착을 위해서는 적절한 코팅이 필수적인데, 이는 안정적인 세포 부착을 보장하고, 분리를 방지하며, 일관되지 않은 데이터로 이어질 수 있는 드리프트를 최소화하기 때문입니다 9,32. 세포 두께 또는 세포 내 구조의 변화로 인해 세포의 일부가 초점을 잃게 되어 측정 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다. 온도, pH 및 이온 농도는 FRET 신호에 영향을 미치고 변동성을 추가합니다 33,34,35.
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공개 사항
저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 선전시 자연과학재단(JCYJ20240813113606009), 선전-홍콩 기술 및 혁신 협력구(HZQB-KCZYB-2020056), 중국 국립자연과학재단(32070681), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2019YFA0906002), 선전 공작 계획(KQTD2016053117035204)의 일부 지원을 받았다.
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재료
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| 0.25% 트립신-EDTA | 깁코 | 고양이 #25200-056 | 세포 세척에 얼음처럼 차가운 PBS 사용 |
| 15mm 유리 바닥 세포 배양 접시 | 둥지 | 고양이#801001 | |
| 2 mL Nalgene 극저온 바이알 | 써모 사이언티픽 | 고양이#5012-0020 | |
| 5 mL 스트라이프 혈청학적 피펫 | 코 닝 | 고양이#4487 | |
| 95% 에탄올 | 케르멜 | 고양이#C028005 | |
| A1 HD25/A1R HD25 컨포칼 현미경 | 니콘 | https://www.nikon.com/ | 배율 : 40 배, 개구수 (NA) : 1.30, 픽셀 체류 시간 : 2.4 ms, 픽셀 크기 : 1024 |
| 암피실린 | 시그마-알드리치 | 고양이 #A9393 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | VWR 생명 과학 | 고양이#N208-10g | |
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참고문헌
- GBD 2021 Diabetes Collaborators. Global, regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet. 402 (10397), 203-234 (2023).
- Li, M., et al.
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재인쇄 및 허가
