Method Article

선택된 조직 영역을 사용하는 질량 분석 기반 단백질체학을 위한 간소화된 접근법

DOI:

10.3791/68076

⸱

April 18th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Science, School of Medicine, CHA University, 2Department of Proteomic Research, CHA Future Medicine Research Institute, 3Department of Pathology, Seoul National University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직 절편에서 분리된 관심 영역을 사용하여 질량 분석 기반 단백질체학 방법을 확립합니다. 이 프로토콜은 보관된 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직 절편의 특정 조직 영역에서 단백질체를 분석하는 데 사용됩니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

질량분석법(MS) 기반 단백질체학은 세포, 조직 및 체액을 포함한 광범위한 생물학적 샘플에 걸쳐 포괄적인 단백질체 분석을 가능하게 합니다. 장기 보관에 일반적으로 사용되는 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) 조직 절편은 단백질체학 연구를 위한 귀중한 자원으로 부상했습니다. 보관의 이점 외에도 연구원들은 병리학자와의 협력을 통해 정상 조직 영역에서 관심 영역(ROI)을 분리할 수 있습니다. 이러한 잠재력에도 불구하고 ROI 분리, 단백질체 시료 전처리 및 MS 분석을 포함하는 단백질체학 실험에 대한 간소화된 접근 방식은 여전히 부족합니다. 이 프로토콜에서는 ROI의 거대 해부, 현탁액 트랩핑 기반 시료 전처리 및 고처리량 MS 분석을 결합한 통합 워크플로우가 제공됩니다. 이 접근법을 통해 병리학자가 진단한 양성 장액성 낭성 신생물(SCN)과 전암성 유두내 유두 점액 신생물(IPMN)로 구성된 환자의 FFPE 조직의 ROI를 거대 절부, 수집 및 분석하여 높은 단백질 커버리지를 얻었습니다. 또한, 두 개의 뚜렷한 췌장 낭성 신생물 사이의 분자 차이가 성공적으로 확인되어 FFPE 조직을 사용한 단백질체학 연구를 발전시키기 위한 이 접근 방식의 적용 가능성을 입증했습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

수십 년 동안 외과적으로 절제된 인체 조직은 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) 블록으로 보관되어 왔습니다. 이러한 조직 블록은 초기에 파라핀에 내장된 3차원(3D) 구조를 보존합니다. 그런 다음 조직을 마이크로톰(microtomes)을 사용하여 절편화하고, 슬라이드에 장착하고, 일반적으로 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(he) 또는 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC)으로 염색하여 숙련된 병리학자의 조직병리학적 진단을 용이하게 합니다 1,2. FFPE 조직은 효소 및 단백질 분해 활성을 중단시키는 포르말린에 의해 유도되는 단백질 가교결합으로 인해 장기 보관에 뚜렷한 이점을 제공합니다3. FFPE 조직은 잘 보관된 대규모 샘플 세트의 구성을 지원하기 때문에 유전체학을 포함한 다양한 분야에서 바이오마커 발견을 위한 초석으로 간주되어 왔습니다 4,5,6,7.

그러나 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 기반 단백질체학에 적용하는 것은 역사적으로 문제를 제기해 왔습니다. 주요 한계는 포르말린에 의한 단백질 가교결합(formalin-duced protein crosslinking)으로, 이는 트립틱 소화를 방해하는데, 이는 글로벌 단백질체 분석(global proteome analysis)에서 중요한 단계이다8. 또한, 조직 슬라이드에서 회수할 수 있는 단백질의 양이 적기 때문에 기존의 샘플 전처리 방법이 적합하지 않은 경우가 많습니다. 이러한 어려움에도 불구하고 발전은 장기간의 고온 치료를 통해 단백질 가교를 역전시킬 수 있음을 입증했습니다 9,10,11. 동시에 저량 단백질 샘플에 최적화된 샘플 전처리 방법은 단백질체학 연구에서 FFPE 조직의 사용을 확대했습니다 12,13,14,15.

단백질체학에서 FFPE 조직 슬라이드를 사용하는 한 가지 중요한 이점은 영역별 분석을 가능하게 하는 기능에 있습니다. FFPE 슬라이드에는 일반적으로 병변과 인접 정상 조직(ANT)이 모두 포함되어 있습니다. 전체 조직을 무분별하게 분석하면 혼합된 분자 신호로 인해 결과를 혼동할 위험이 있습니다. 이와는 대조적으로, 관심 영역(ROI)을 분리하고 분석하면(병변과 ANT를 비교하여) 병리학적 영역에 특이적인 분자 특징을 보다 정확하게 특성화할 수 있습니다. 결과적으로, FFPE 기반 접근법은 단백질체학 연구에서 점점 더 인기를 얻고 있습니다 16,17,18,19,20. 응용 분야가 성장하고 있음에도 불구하고 전체 단백질체학 실험을 단계별로 설명하는 간소화된 워크플로우는 여전히 부족합니다. 특히 비디오 기반 프로토콜은 공개되지 않았습니다.

이 연구에서는 병변 특이적 영역 내 분자 변화의 정확한 프로파일링을 위해 맞춤화된 강력한 LC-MS 기반 단백질체학 워크플로우를 확립했습니다. 두 명의 병리학자가 진단한 FFPE 조직을 사용하여 양성 장액성 낭포성 신생물(SCN) 및 전암성 관내 유두 점액 신생물(IPMN)의 ROI를 거대 해부, 수집 및 분석했습니다. 이 프로토콜은 ROI의 거대 해부, 단백질 주입 최소화에 최적화된 현탁 트래핑 기반 시료 전처리 및 협소 범위 DIA(Data-Independent Acquisition)-MS 분석을 통합합니다. 이 방법을 통해 약 1cm²의 조직 영역에서 9,000개 이상의 단백질을 식별하여 SCN 및 IPMN과 관련된 뚜렷한 단백질체 서명을 해독할 수 있었습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 서울대학교병원 기관심사위원회(IRB No. 1904-114-1028)의 검토 및 승인을 받았다. 모든 참가자는 연구 참여에 대한 서면 동의서를 제공했습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료에 대한 자세한 정보는 재료 표에 나와 있습니다.

1. 단백질체학 시료 준비를 위한 FFPE 조직 항원 회수

알림: 메스와 사용된 튜브와 같은 모든 재료가 교차 오염을 방지하기 위해 멸균 상태인지 확인하십시오. 이 연구의 프로토콜은 실험실 설정에 따라 약간의 변형으로 모든 FFPE 조직에 맞게 조정할 수 있습니다.

  1. 전체 장착 FFPE 조직 블록에서 10μm FFPE 조직 절편을 잘라 유리 슬라이드에 놓습니다.
    참고: 이 연구에서는 인간 췌장 낭종 FFPE 조직(두 가지 유형의 낭성 조직-SCN 및 IPMN)이 단백질체학 샘플 준비에 사용되었습니다.
  2. FFPE 조직의 파라핀 왁스를 자일렌으로 두 번 세척하여 주의해서 제거합니다: 하나는 5분 동안, 다른 하나는 2분 동안 세척합니다.
  3. 등급이 매겨진 에탄올 혼합물로 연속 세척을 통해 조직을 재수화합니다: 100%, 85%, 70% 및 50% 에탄올을 각각 3분씩 넣은 다음 탈이온수로 헹굽니다.
    알림: 크실렌과 에탄올이 화학 흄 후드에서 취급되는지 확인하십시오.

2. FFPE 조직 단백질 추출

  1. 병리학자가 ROI를 표시하는 HE 또는 IHC 염색 조직 슬라이드를 준비합니다.
  2. 염색되지 않은 조직 슬라이드와 염색된 조직 슬라이드를 뒷면이 서로 마주 보도록 놓고 함께 정렬합니다. 유리 슬라이드를 통해 ROI가 관찰되는지 확인합니다.
  3. 메스를 사용하여 관심 없는 조직 부위를 제거합니다.
    참고: 인접한 정상 조직을 분석해야 하는 경우 다른 튜브에 수집하십시오.
  4. 메스를 사용하여 조직 ROI를 슬라이드 중앙으로 긁어내고 깨끗한 1.5mL 저단백질 결합 튜브로 옮깁니다.
  5. 각 튜브에 180μL의 도데실황산나트륨(SDS) 용해 완충액(5% SDS, 2mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀)[TCEP], 탈이온수 중 300mM pH 8.5 Tris-HCl)를 추가합니다.
    참고 : 용해 완충액의 부피가 초음파 처리 중에 조직을 용해시키고 추출 된 단백질을 현탁하기에 충분한지 확인하십시오. 완충액이 충분하지 않으면 조직 용해가 불완전해질 수 있으며, 완충액이 너무 많으면 단백질 용해물이 희석될 수 있습니다.
  6. 20%의 진폭으로 프로브 초음파 처리를 수행하고 5초 켜기 및 5초 끄기의 10회 주기를 적용합니다.
  7. 1,000 x g으로 100°C에서 3.5시간 동안 샘플을 배양합니다.
    참고: 효율적인 단백질 추출을 위해 배양 중 매시간 1분 동안 샘플의 물 초음파 처리를 수행합니다.
  8. 배양 후 샘플을 실온(RT)에서 10분 동안 냉각합니다. 상등액에서 10분 동안 16,000 x g 에서 샘플을 원심분리하여 상층액에서 조직 파편을 분리합니다.
  9. 상등액을 라벨이 표시된 깨끗한 튜브에 모아 나중에 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.

3. FFPE 조직 용해물의 단백질 정량화

참고: 단백질 정량화를 위한 대부분의 비신초닌산 분석 단계는 약간의 수정을 가한 제조업체의 지침을 기반으로 합니다. 제조업체의 지침에 따라 시약을 준비하는 것이 좋습니다.

  1. 원액(BSA 2mg/mL)을 연속적으로 희석하여 다양한 농도의 소 혈청 알부민(BSA) 표준물질을 준비합니다. 필요한 경우 희석 계수 20 또는 40으로 샘플을 희석합니다.
  2. 탈이온수를 블랭크로 준비하고 SDS 용해 버퍼를 샘플 대조군으로 준비합니다.
  3. 9 μL의 표준물질, 블랭크, 시료 대조군 및 시료를 마이크로플레이트 웰 중앙에 피펫팅합니다.
  4. 각 웰의 샘플에 4μL의 호환성 시약 용액을 추가합니다.
  5. 접시를 덮고 접시 셰이커에 중간 속도로 1분 동안 섞습니다. 그 후, 37 ° C에서 15 분 동안 플레이트를 배양하십시오.
  6. 각 웰에 260μL의 BCA 작업 시약을 추가한 다음 37°C에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
  7. RT에서 3분 동안 플레이트를 식힙니다.
  8. 플레이트 리더에서 562nm에서 웰의 흡광도를 측정합니다.
  9. 모든 샘플과 샘플 대조군의 흡광도 값에서 블랭크의 562nm 흡광도 값을 뺍니다.
  10. 또한, 모든 샘플의 흡광도 값에서 blank-subtracted sample control의 562nm 흡광도 값을 뺍니다.
  11. 표준 곡선을 플롯하고 사용하여 각 샘플의 단백질 농도를 측정합니다.
    참고: 각각 약 1cm2의 면적을 가진 FFPE 조직의 3개의 유리 슬라이드에서 약 200-250μg의 단백질을 추출해야 합니다.

4. 단백질의 아세톤 침전

참고: 총 100-300μg의 단백질이 아세톤 침전 및 현탁액 트래핑 기반 단백질 분해에 사용되는지 확인하십시오.

  1. 단백질 샘플(100-300 μg에 해당)을 아세톤 호환 튜브에 넣습니다.
  2. -20 °C 아세톤을 샘플 부피의 5배에 해당하는 부피로 튜브에 추가합니다.
  3. 혼합물을 -20 ° C에서 18 시간 동안 배양합니다.
  4. 튜브를 16,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
  5. 단백질 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 폐기하십시오.
  6. -20°C 아세톤 500μL를 추가하고 4.4-4.5단계를 반복합니다.
  7. 샘플을 자연 건조시킵니다.

5. 현탁액 트래핑 기반 단백질 소화

참고: 현탁액 트래핑 필터 기반 단백질 분해 절차는 제조업체의 지침에 따라 약간의 수정을 가하여 조정되었습니다.

  1. 현탁액 트래핑 용해 완충액(탈이온수 내 5% SDS, 5mM TCEP, 50mM pH 8.5TEAB)을 준비합니다.
  2. 40 μL의 완충액을 시료 튜브에 넣고 공기 건조된 단백질 펠릿을 용해시키기 위해 완전히 와류를 치십시오.
  3. 100°C에서 35분 동안 1,000 x g 로 진탕하면서 샘플을 배양합니다.
  4. 10μL의 알킬화 시약(100mM pH 8.5 TETRAETILLAMMONIUM bromide[TEAB]의 100mM 클로로아세트아미드[CAA])을 샘플에 추가합니다.
  5. RT에서 300 x g 로 1시간 동안 흔들면서 배양합니다.
  6. 산성화제(탈이온수에 10% 트리플루오로아세트산[TFA])를 주의해서 준비합니다. 강산인 TFA가 화학 흄 후드에서 처리되는지 확인하십시오.
  7. 시료에 5μL의 산성화제를 첨가하여 1% TFA의 최종 농도를 달성합니다(최종 시료 부피: 55μL).
  8. pH 종이를 사용하여 샘플의 pH를 확인하십시오. pH가 1 미만인지 확인합니다.
  9. 단백질을 트랩하기 위해 샘플에 350μL의 결합/세척 버퍼-1(0.1M pH 8.5TEAB, 90% MeOH)을 추가합니다.
    참고: 단백질 트래핑(5.9단계) 동안 볼텍싱 및 원심분리를 피하여 샘플 손실을 방지하십시오. 충분한 양의 단백질은 반투명하게 보이는 가시적인 콜로이드 단백질 미립자의 형성을 보장합니다.
  10. 현탁액 트래핑 컬럼을 2mL 튜브에 넣고 불용성 물질을 포함한 전체 샘플을 현탁액 트래핑 컬럼으로 옮깁니다.
  11. 4,000 x g 에서 컬럼을 50초 동안 원심분리하여 단백질을 트랩합니다.
    참고: 모든 샘플이 컬럼을 통과하는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 여과가 완료될 때까지 원심분리를 반복합니다.
  12. 세척 buffer-2 400 μL(50 % CHCl3/50 % MeOH)를 컬럼에 추가하고 4000 x g 에서 50초 동안 원심분리한 다음 flow-through를 폐기합니다.
  13. 5.12단계를 세 번 반복합니다.
  14. buffer-1 400μL를 추가하고 4000 x g 에서 50초 동안 원심분리한 다음 flow-through를 폐기합니다.
  15. 5.14단계를 세 번 반복합니다.
  16. buffer-1의 전체 통과를 보장하기 위해 4000 x g 에서 1.25분 동안 원심분리기.
  17. 효소 분해를 위해 현탁액 트래핑 컬럼을 새 샘플 튜브로 옮깁니다.
  18. 현탁액 트래핑 컬럼에 125μL의 분해 완충액(50mM pH 8.5TEAB에서 0.16μg/μL의 트립신/Lys-C)을 추가하고 증발을 방지하기 위해 캡을 씌웁니다.
    참고: 트립신/Lys-C 비율은 1:10(무게/무게)이어야 합니다. 효과적인 소화를 위해 최소 10μg의 트립신/Lys-C를 확보하십시오.
  19. 흔들지 않고 37°C에서 18시간 동안 배양합니다.
  20. 완충액-1(탈이온수 내 50mM pH 8.5TEAB), 완충액-2(탈이온수 내 0.2% FA) 및 완충액-3(탈이온수 중 50% 아세토니트릴[ACN])과 같은 용리 완충액을 준비합니다.
  21. 현탁액 트래핑 컬럼에 80μL의 용리 완충액-1을 추가하고 4000 x g 에서 1.25분 동안 원심분리합니다.
  22. 80μL의 용리 완충액-2 및 완충액-3에 대해 5.20단계를 반복합니다.
  23. 용리된 펩타이드를 풀링하여 깨끗하고 새로운 튜브로 옮깁니다.

6. 펩타이드 정량화

참고: 정량적 비색 펩타이드 분석의 대부분의 단계는 약간의 수정을 가하여 제조업체의 지침에 따라 조정됩니다. 제조업체의 지침에 따라 시약을 준비하는 것이 좋습니다.

  1. 표준물질의 원액(1 mg/mL)을 연속적으로 희석하여 일련의 표준물질을 준비합니다. 필요한 경우 희석 계수 4 또는 5를 사용하여 샘플을 희석합니다.
  2. 탈이온수를 블랭크로 준비하고 용리 완충액-1, 완충액-2 및 완충액-3의 혼합물을 시료 대조군과 동일한 비율로 준비합니다.
  3. 20μL의 표준물질, 블랭크, 시료 대조군 및 시료를 각 마이크로플레이트 웰의 중앙에 배치합니다.
  4. 각 웰에 작업 시약 180μL를 추가하고 플레이트 셰이커에서 1분 동안 플레이트를 완전히 혼합합니다.
  5. 플레이트를 덮고 37°C에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다.
  6. 접시를 RT에서 3분 동안 식히십시오.
  7. 플레이트 리더를 사용하여 480nm에서 웰의 흡광도를 측정합니다.
  8. 모든 샘플과 샘플 대조군의 흡광도 값에서 블랭크의 480nm 흡광도 값을 뺍니다.
  9. 또한, 모든 샘플의 흡광도 값에서 blank-subtracted sample control의 480nm 흡광도 값을 뺍니다.
  10. 표준 곡선을 플롯하고 사용하여 각 샘플의 펩타이드 농도를 계산합니다.

7. 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 분석

  1. 펩타이드 정량 분석 후 펩타이드 20μg을 동결건조합니다.
  2. 초음파 처리 수조에서 10분 동안 40μL의 수성 완충액(0.1% 포름산[FA] 물 중 3% ACN)에 펩타이드를 재용해합니다. 결과 펩타이드 농도는 0.5μg/μL입니다.
  3. 60분 동안 16,000 x g 에서 시료를 원심분리하고 MS 분석을 위해 시료를 바이알로 옮깁니다.
  4. nano LC-MS/MS 시스템의 자동 시료 주입기를 사용하여 각 시료를 2μL씩 주입합니다.
  5. 역상 컬럼(0.075mm ID x 150mm 컬럼, 3μm C18 물질로 패킹, 100nL/분에서 5%-35% 아세토니트릴의 127분 그래디언트를 사용)에서 펩타이드를 분리합니다. 나노스프레이 이온 소스를 통해 펩타이드를 이온화하고 Orbitrap 기반 질량분석기로 전달합니다.
  6. 좁은 범위의 데이터 독립적인 수집 방법을 사용하여 펩타이드를 분석합니다21.
  7. MS 매개변수 설정을 적용합니다: MS m/z 범위: 495-745, 해상도 목표: 15000, AGC 목표: 3 x 10E6, 최대 사출 시간: 자동, MS/MS 창: 사용자 정의(보충 파일 1), 해상도 목표: 45000, AGC 목표 3 x 10E6, 최대 사출 시간: 자동, HCD 충돌 에너지: 22%, 26%, 30%.
    참고: 분석하기 전에 표준 샘플을 분석하여 기기의 초기 품질 검사를 수행하는 것이 좋습니다. MS 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 파라미터를 구성합니다( 재료 표 참조).

8. 단백질체학 검색을 위한 데이터 분석

참고: MS 원시 데이터의 단백질체학 검색을 위해 오픈 소스 도구를 사용하여 LC-MS 데이터 형식을 변환하고 단백질체 검색을 수행했습니다( 재료 표 참조). 데이터 분석에 사용되는 매개변수는 보충 파일 2에 자세히 설명되어 있습니다. 오픈 소스 도구에 대한 기본 사용 지침은 Table of Materials에 포함된 링크를 참조하세요.

  1. 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 LC-MS에서 얻은 원시 MS/MS 스펙트럼 파일(*.raw)을 *.mzML 형식으로 변환합니다.
  2. 형식으로 변환된 원시 파일(*.mzML)을 오픈 소스 검색 엔진의 입력으로 사용하여 단백질 검색을 수행합니다.
  3. Supplementary File 2에 지정된 매개변수를 기반으로 단백질체학 검색을 시작합니다.

9. 통계 분석

참고: 차등적으로 발현된 단백질을 식별하기 위한 통계 분석을 위해 오픈 소스 도구를 사용하여 일변량 분석을 수행했습니다(예: 학생의 t-검정, 재료 표 참조). Table of Materials에 제공된 링크를 통해 오픈 소스 도구에 대한 기본 사용 지침을 참조하는 것이 좋습니다.

  1. 식별된 단백질(*.txt) 목록을 오픈 소스 도구로 가져옵니다.
  2. 샘플을 그룹으로 분류합니다. 이 연구를 위해 SCN과 IPMN의 두 그룹을 지정했습니다.
  3. 존재비 값의 로그2 변환을 수행하여 데이터 분포를 근사화하도록 조정합니다.
  4. 필터링 단계를 적용하여 결측값이 있는 단백질을 제거합니다. 이 연구에서는 포함을 위해 각 그룹에서 최소 두 개의 유효한 값이 필요했습니다.
  5. 정규 분포 기반 접근법을 사용하여 결측값을 대치하여 후속 일변량 분석을 위해 정량화된 단백질의 포괄적인 목록을 생성합니다.
  6. 스튜던트 t-검정을 수행하여 두 그룹 간에 다르게 발현된 단백질을 식별합니다. 이 연구에서는 Benjamini-Hochberg FDR(False Discovery Rate) 보정을 적용했습니다.
  7. 다음 기준을 만족하는 차등적으로 발현된 단백질을 추출합니다: Benjamini-Hochberg FDR < 0.05 및 |fold- change| ≥ 2.

10. 생물정보학 분석

참고: 과대 대표 분석에는 상용 생물정보학 도구가 사용되었습니다(예: Ingenuity 경로 분석, 재료 표 참조). 이 도구를 사용하기 전에 제조업체의 지침을 참조하는 것이 좋습니다.

  1. DEP(*.txt) 목록을 상용 도구로 가져옵니다.
  2. 과대 대표 분석을 수행하기 위해 핵심 분석을 시작합니다.
  3. Fisher의 정확 검정(조정된 p-값 0.05)을 사용하여 DEP에서 강화된 유의한 표준 경로를 내보냅니다(조정된 p-값 0.05<). 연구와 관련된 관심 경로를 식별합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

확립된 현탁액 트래핑 필터 기반 단백질체학 시료 전처리는 single-shot 데이터 독립적 획득을 사용한 label-free 정량화와 결합되어 췌장 낭성 FFPE 조직에 적용되었습니다(그림 1). FFPE 조직 처리 중 정확한 ROI 분리는 서로 다른 췌장 낭성 FFPE 조직에서 달성되었으며(그림 2A), 그 결과 각 유형의 췌장 낭성 신생물에 대한 생물학적 삼중 복제 간에 재현 가능한 총 이온 크로마토그램을 획득할 수 있었습니다(그림 2B). LC-MS 분석은 9,703개의 단백질을 식별하고 SCN 및 IPMN에 대해 각각 평균 7,886개 및 8,273개의 단백질을 정량화했습니다(그림 2C). 또한 6개 샘플 모두에서 총 80,245개의 전구체와 75,412개의 펩타이드가 확인되었으며, SCN 및 IPMN에 대해...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 병리학적 진단을 위해 유리 슬라이드에 장착된 FFPE 조직 절편에서 분리된 ROI를 활용하는 빠르고 효율적인 단백질체학 방법을 간략하게 설명합니다. 외과적 개입이 유리한 경우, 암 및 낭종과 같은 고형 신생물을 외과적으로 절제하고 병리학적 평가를 위해 보존합니다. 장기 보관을 위해 조직은 포르말린으로 고정되고 파라핀(FFPE)에 매립됩니다. 그런 다음 FFPE 조직 블록을 4-10μm 두께로 절단하고 유리 슬라이드에 장착하고 항원 회수를 수행하고 HE 또는 IHC로 염색합니다. 병리학자들은 진단 의사 결정을 돕기 위해 세포 형태와 분자 진단 마커(예: HER2, ER 및 PR)의 발현을 평가합니다.

현대의 단백질체학(proteomics)은 다양한 조직에서 인간 단백질체에 대한 포괄적인 정성적 및 정량적 프로파일링과 더 나아가 시스템 전반의 분자 분석을 가능하게 합니다. 초고분해능, 초고속 질량 분석기 및 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 글의 모든 그림은 BioRender(http://www.biorender.com)로 제작되었습니다. 이 연구는 한국연구재단(NRF)의 지원금(보조금 번호. RS-2023-00253403 및 RS-2024-00454407)을 참조하십시오.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ACN 중 0.1% FA(LC-MS 등급)Fisher ChemicalLS120-212
수중 0.1% FA(LC-MS 등급)Fisher ChemicalLS118-4
0.5M TCEPThermo Scientific77720
10% SDSInvitrogen2679093
1M TEAB(pH 8.5)Sigma-Aldrich102545001
1M Tris-cl(pH 8.5)BIOSOLUTIONBTO21
A-14C 원심분리기Satorious167709
Acetone (HPLC grade)Fisher ScientificA949-4
ACN (HPLC grade)J.T.Baker9017-88
CHCl3 (HPLC grade)Thermo Scientific022920.k2
CR paperADVANTEC70406001
DIA-NN 버전 1.9 오픈 소스 https://github.com/vdemichev/DiaNN단백질체학 검색 엔진 
EPOCH2 마이크로플레이트 리더Agilent 
에탄올MERCKK50505283 836
FA (LC-MS 등급)Fisher ChemicalA117-50
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)QIAGEN830018Bioinformatics tool
동결건조기(SRF110R+베이퍼 트랩)Thermo ScientificSRF-110-115
MeOH (HPLC 등급)MERCKUN1230
마이크로플레이트 BCA 단백질 분석 키트-환원제 호환Thermo Scientific23252
MSConvert 오픈 소스 http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtmlMS 데이터 변환 소프트웨어
Orbitrap Exploris 480Thermo ScientificMA10813CMS
PepMAP RSLC C18 분리 컬럼 Thermo ScientificES903
Perseus오픈 소스https://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.html통계 도구
PIERCE chloroacetamide No-Weigh FormatThermo ScientificA39270
PIERCE 정량적 색채 펩타이드 분석Thermo Scientific23275
플레이트 쉐이커 Green SSerikerVS-202D
프로브 초음파 발생기VibraCellTMVCX750
단백질 LoBind 튜브 1.5 mLEppendorf22431081
QSP 10 µ L 피펫 팁Thermo ScientificTLR102RS-Q
QSP 300 µ L 피펫 팁Thermo ScientificTLR106RS-Q
ScalpelBard-Parker372615
S-Trap: Rapid Universal MS sample PrepPROTIFICO2-mini-40
SureSTART Vial 0.2 mLThermo Scientific6pk1655
TFASigma-Aldrich102614284
ThermoMixer CEppendorf5382
Trypsin/Lys-C (LC-MS 등급)PromegaV5073
Vanquish NEOThermo Scientific8348249LC
Water (HPLC 등급)HoneywellAH365-4
Xcalibur ver 4.7Thermo Scientific30966MS 데이터 수집 소프트웨어
XyleneSigma-Aldrich102033629
2106208

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Maldegem, F., et al. Effects of processing delay, formalin fixation, and immunohistochemistry on RNA recovery from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Diagn Mol Pathol. 17 (1), 51-58 (2008).
  2. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. J Histochem Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
  3. Fraenkel-Conrat, H., Olcott, H. S. The reaction of formaldehyde with proteins; cross-linking between amino and primary amide or guanidyl groups. J Am Chem Soc. 70 (8), 2673-2684 (1948).
  4. Basyuni, S., et al. Large-scale analysis of whole genome sequencing data from formalin-fixed paraffin-embedded cancer specimens demonstrates preservation of clinical utility. Nat Commun. 15 (1), 7731(2024).
  5. Gracia Villacampa, E., et al. Genome-wide spatial expression profiling in formalin-fixed tissues. Cell Genomics. 1 (3), 100065(2021).
  6. Zhang, X., et al. Characterization of the genomic landscape in large-scale Chinese patients with pancreatic cancer. EBioMedicine. 77, 103897(2022).
  7. Ren, Z., Ordway, B., Lin, P. -H. Archival FFPE blocks: the gift that keeps giving. Innov. 5 (1), 100532(2024).
  8. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  9. Soni, R. K. Protocol for deep proteomic profiling of formalin-fixed paraffin-embedded specimens using a spectral library-free approach. STAR Protoc. 4 (3), 102381(2023).
  10. Gustafsson, O. J. R., Arentz, G., Hoffmann, P. Proteomic developments in the analysis of formalin-fixed tissue. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1854 (6), 559-580 (2015).
  11. O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
  12. Ye, X., et al. Integrated proteomics sample preparation and fractionation: method development and applications. TrAC Trends Anal Chem. 120, 115667(2019).
  13. Nwosu, A. J., et al. In-depth mass spectrometry-based proteomics of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues with a spatial resolution of 50-200 µm. J Proteome Res. 21 (9), 2237-2245 (2022).
  14. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. J Pathol. 251 (1), 100-112 (2020).
  15. Makhmut, A., et al. A framework for ultra-low-input spatial tissue proteomics. Cell Syst. 14 (11), 1002-1014.e5 (2023).
  16. Shin, D., et al. Identification of TUBB2A by quantitative proteomic analysis as a novel biomarker for the prediction of distant metastatic breast cancer. Clin Proteomics. 17 (1), 16(2020).
  17. Lee, H., et al. Dual oxidase 2 (DUOX2) as a proteomic biomarker for predicting treatment response to chemoradiation therapy for locally advanced rectal cancer: using high-throughput proteomic analysis and machine learning algorithm. Int J Mol Sci. 23 (21), 12923(2022).
  18. Tüshaus, J., et al. Towards routine proteome profiling of FFPE tissue: insights from a 1,220-case pan-cancer study. EMBO J. 44 (1), 304-329 (2024).
  19. Schweizer, L., et al. Quantitative multiorgan proteomics of fatal COVID-19 uncovers tissue-specific effects beyond inflammation. EMBO Mol Med. 15 (9), e17459(2023).
  20. Kobayashi, G., et al. Proteomic profiling of FFPE specimens: discovery of HNRNPA2/B1 and STT3B as biomarkers for determining formalin fixation durations. J Proteomics. 301, 105196(2024).
  21. Kawashima, Y., et al. Single-shot 10k proteome approach: over 10,000 protein identifications by data-independent acquisition-based single-shot proteomics with ion mobility spectrometry. J Proteome Res. 21 (6), 1418-1427 (2022).
  22. Li, W., et al. Identification and prognostic analysis of biomarkers to predict the progression of pancreatic cancer patients. Mol Med. 28 (1), 43(2022).
  23. Martinelli, P., et al. GATA6 regulates EMT and tumour dissemination, and is a marker of response to adjuvant chemotherapy in pancreatic cancer. Gut. 66 (9), 1665-1676 (2017).
  24. Racu, M. -L., et al. Smad4 positive pancreatic ductal adenocarcinomas are associated with better outcomes in patients receiving FOLFIRINOX-based neoadjuvant therapy. Cancers. 15 (15), 3765(2023).
  25. Roy, L. D., et al. MUC1 enhances invasiveness of pancreatic cancer cells by inducing epithelial to mesenchymal transition. Oncogene. 30 (12), 1449-1459 (2011).
  26. Shi, H., Tsang, Y., Yang, Y. Identification of CEACAM5 as a stemness-related inhibitory immune checkpoint in pancreatic cancer. BMC Cancer. 22 (1), 1291(2022).
  27. Waters, A. M., Der, C. J. KRAS: the critical driver and therapeutic target for pancreatic cancer. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (9), a031435(2018).
  28. Yao, H., et al. Glypican-3 and KRT19 are markers associating with metastasis and poor prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Biomark. 17 (4), 397-404 (2016).
  29. Zhan, L., Chen, L., Chen, Z. Knockdown of FUT3 disrupts the proliferation, migration, tumorigenesis and TGFβ induced EMT in pancreatic cancer cells. Oncol Lett. 16 (1), 924-930 (2018).
  30. Frohlich, K., Furrer, R., Schori, C., Handschin, C., Schmidt, A. Robust, precise, and deep proteome profiling using a small mass range and narrow window data-independent-acquisition scheme. J Proteome Res. 23 (3), 1028-1038 (2024).
  31. Li, K. W., Gonzalez-Lozano, M. A., Koopmans, F., Smit, A. B. Recent developments in data independent acquisition (DIA) mass spectrometry: application of quantitative analysis of the brain proteome. Front Mol Neurosci. 13, 564446(2020).
  32. Searle, B. C., et al. Chromatogram libraries improve peptide detection and quantification by data independent acquisition mass spectrometry. Nat Commun. 9 (1), 5128(2018).
  33. Prakash, J., Shaked, Y. The interplay between extracellular matrix remodeling and cancer therapeutics. Cancer Discov. 14 (8), 1375-1388 (2024).
  34. Perez, V. M., Kearney, J. F., Yeh, J. J. The PDAC extracellular matrix: a review of the ECM protein composition, tumor cell interaction, and therapeutic strategies. Front Oncol. 11, 751311(2021).
  35. Ferrara, B., et al. The extracellular matrix in pancreatic cancer: description of a complex network and promising therapeutic options. Cancers. 13 (17), 4442(2021).
  36. Weniger, M., Honselmann, K. C., Liss, A. S. The extracellular matrix and pancreatic cancer: a complex relationship. Cancers. 10 (9), 316(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass Spectrometry ProteomicsFFPE TissueRegion Of InterestSuspension TrappingProtein DigestionPancreatic NeoplasmsData Independent AcquisitionPeptide QuantificationLiquid ChromatographyBioinformatics Analysis

Related Articles