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Research Article
Lea Lough1, Mingyu Sheng2, Takeshi Namekawa2, Adrian Ion-Margineanu3, Christian W. Freudiger3, Samir S. Taneja4,5,6, Miles P. Mannas2,7
1Genecentrix Inc., 2Vancouver Prostate Center,University of British Columbia, 3Invenio Imaging, 4Dept. of Urology,NYU Langone Health, 5Dept. of Radiology,NYU Langone Health, 6Dept. of Biomedical Engineering,NYU Langone Health, 7Dept. of Urologic Sciences,University of British Columbia
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Erratum Notice
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Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
여기에서는 기존 조직병리학에 비해 장점이 있어 생검 샘플에 대해 자극 라만 조직학(SRH)을 사용하여 전립선암을 검출하기 위한 표준화된 프로토콜을 제시하며, 암 대 조직 비율을 개선하기 위해 샘플 준비, 이미징 및 인공 지능에 중점을 둡니다. 또한 전사체학, 오가노이드 또는 이종이식 모델, 수술 중 수술 마진 식별을 위한 바이오뱅킹을 지원합니다.
전립선암은 전 세계적으로 남성에게 영향을 미치는 가장 흔한 악성 종양 중 하나로 남아 있으며, 효과적인 개입과 치료를 위해서는 조기 발견과 정밀 의학의 발전이 매우 중요합니다. 전립선암 검출에 인공 지능(AI)이 통합된 자극 라만 조직학(SRH)을 활용하기 위한 표준화된 프로토콜이 제시되어 기존의 조직병리학적 방법에 비해 상당한 발전을 제공합니다. SRH는 염색되지 않은 신선한 조직의 거의 실시간, 무표지 이미징을 통해 효율성을 향상시킴으로써 기존 생검 분석과 관련된 지연을 제거함으로써 이러한 발전을 제공합니다.
유도 라만 산란(SRS) 현미경을 사용하여 지질과 관련된 CH2 결합 및 단백질 및 DNA와 연결된 CH3 결합의 특정 진동 주파수를 감지함으로써 전립선 생검에서 암 조직과 양성 조직을 구별할 수 있습니다. AI 모델은 진단 정밀도를 더욱 향상시켜 전립선암을 식별하는 데 98.6%의 정확도를 달성합니다. 이 프로토콜은 시료 전처리, 이미징 및 데이터 분석을 위한 필수 단계를 간략하게 설명하여 개선된 바이오뱅킹 프로세스를 촉진하고 전사체학 및 이종이식 연구와 같은 다운스트림 애플리케이션을 가능하게 합니다. 이 접근 방식은 진단 워크플로우를 가속화하고 수술 중 응용 분야에 대한 가능성을 보여주며, 잠재적으로 외과의가 수술 중 긍정적인 마진을 식별하는 데 도움이 됩니다. 또한 암 대 조직 비율을 재스캔하고 조정할 수 있는 기능을 통해 생검 샘플에 대한 보다 맞춤화된 분석이 가능하여 처리되지 않은 조직에서 종양 검출을 향상시킬 수 있습니다. 임상 실습에서 SRH의 광범위한 채택을 위해서는 추가 연구와 검증이 필요합니다.
전립선암은 전 세계적으로 남성에게 영향을 미치는 주요 악성 종양 중 하나이며, 조기 발견은 성공적인 중재 및 치료를 위한 중추적인 역할을 합니다1. 역사적으로 전립선암의 진단은 전립선 생검 샘플의 조직병리학적 평가에 크게 의존해 왔으며, 가장 일반적으로 Hematoxylin 및 Eosin (H&E) 염색을 통해 이루어졌습니다2. 전통적인 전립선 생검 분석 방법은 효과적이기는 하지만, 일반적으로 절차적 및 물류적 요인으로 인해 도시 또는 국가에 따라 며칠에서 몇 주까지 기다려야 합니다. 이러한 지연은 포르말린 고정, 파라핀 임베딩, 절편 및 H&E 염색을 포함한 여러 노동 집약적인 단계에서 발생합니다. 따라서 많은 양의 생검 샘플로 인해 누적된 처리 시간이 지연되어 진단 및 치료 계획이 지연될 수 있습니다.
최근 이미징 기술의 발전, 특히 자극 라만 산란(SRS) 현미경 검사는 배경이 없고 쉽게 해석할 수 있는 강력한 이미징 방법을 제공함으로써 진단 관행을 변화시킬 수 있습니다 3,4. SRS는 샘플과 상호 작용하는 펌프 빔(ωp)과 스톡스 빔(ωs)의 두 레이저 빔을 사용합니다. 주파수 차이(Δω = ωp −ωs)가 특정 분자 진동 주파수(Ω)와 일치하면 자극된 라만 이득 또는 손실로 인해 신호가 증폭됩니다. 이 과정은 분자 진동의 대비를 향상시켜 조직의 고감도 이미징을 가능하게 합니다 3,4. SRS를 사용하면 지질과 관련된 CH2 스트레칭 진동(2,845 cm-1) 및 단백질 및 DNA4와 연결된 CH3 스트레칭 진동(2,930 cm-1)과 관련된 분자 진동을 감지할 수 있습니다. SRS 신호의 감지에는 일반적으로 고주파 변조 전송 방식이 포함되므로 배경 잡음에서 약한 진동 신호를 정밀하게 격리할 수 있습니다.
SRS 현미경 검사에는 물리적 조직 절편 없이도 정밀한 3차원 이미징을 가능하게 하는 광학 절편 기능이 있습니다. 이는 펌프와 Stokes 레이저 빔을 특정 분자 진동이 여기되는 샘플 내의 회절 제한 지점에서 정렬하고 집중시킴으로써 달성됩니다. 레이저의 강도에 대한 2차 의존성에서 파생된 SRS의 컨포칼 특성은 신호가 초점면에 국한되도록 하여 초점에서 벗어난 기여를 배제하고 고도로 국부적인 화학 정보를 제공하도록 합니다 5,6. 이 깊이 분해 이미징은 기계적 슬라이싱을 제거하고, 처리 시간을 단축하며, 샘플의 생물학적 및 분자적 맥락을 유지함으로써 조직의 무결성을 보존합니다.
SRS의 원칙을 기반으로 하는 자극 라만 조직학(SRH)은 이 분자 진동 데이터를 활용하여 염색되지 않은 신선한 조직의 pseudo-H&E 이미지를 실시간으로 생성함으로써 임상의에게 더 빠르고 효율적인 진단 도구를 제공합니다 7,8. 고품질 이미지를 생성할 수 있는 이러한 기능은 SRH를 연구 및 잠재적인 임상 응용 분야에 없어서는 안 될 도구로 만들었습니다9. 최근에는 SRH를 사용한 수술 중 마진 평가가 부분 샘 절제 및 근치적 전립선 절제술 중에 거의 실시간으로 병리학적 피드백을 제공하여 즉각적인 치료 조정이 가능했습니다10,11.
SRH 이미저는 고유 분자 진동을 활용하여 조직 구성에 대한 통찰력을 제공합니다. SRH는 CH2 및 CH3 진동 특성을 분석하여 암과 양성 전립선 조직을 효과적으로 구별하는 데 사용할 수 있습니다 7,12. SRH 이미저는 이러한 진동을 포착하고 핵 대비를 향상시키는 유사 H&E 이미지를 생성하여 기존 조직 병리학에 대한 빠른 대안 역할을 하고 조직 크기 7,8에 따라 2-8분 내에 고품질 이미지를 제공합니다.
처리되지 않은 전립선 생검의 신속한 병리학적 검사를 위한 SRH의 효과를 평가했습니다. 병리학자들은 전립선 절제술 표본에서 생체 외에서 얻은 전립선 생검 코어의 SRH 이미지를 해석하도록 훈련을 받았다8. SRH 스캐닝 방법은 몇 분 내에 고해상도 이미지를 획득할 수 있도록 최적화되어 기존 조직 병리학에 비해 필요한 시간을 크게 단축했습니다. 양성 조직과 악성 조직학이 혼합된 생검 샘플은 병리학자를 위한 교육 세트로 사용되었으며, 병리학자들은 SRH로 영상화하고 H&E 염색으로 처리하여 실측 자료로 사용하기 위해 별도의 생검 세트에 대한 맹검 평가를 수행했습니다. 그 결과, 전립선암을 식별하기 위한 병리학자의 평균 정확도는 95.7%였으며, 임상적으로 유의한 암을 발견하는 데 있어 우수한 일치성을 보였으며, 이는 SRH가 실시간에 가까운 진단을 효과적으로 지원할 수 있음을 나타냅니다8.
후속 연구에서는 인공 지능(AI)을 통합하여 진단의 정확성, 효율성 및 구현 용이성을 더욱 향상시켰습니다. 이 AI 모델은 딥 러닝 기술을 사용하여 SRH가 캡처한 진동 및 형태학적 특징을 분석하여 전립선 생검 샘플을 양성, 암 및 비진단 영역으로 자동 분류하여 병리학적 평가 프로세스를 크게 간소화합니다9. SRH-AI 통합은 전립선암 검출에서 96.5%를 달성하여 인상적인 정확도를 보였으며 민감도와 특이도는 각각 96.3% 및 96.6%였습니다9. AI와 SRH를 통합함으로써 숙련된 병리학자와 일치하는 진단 성능을 달성할 수 있었습니다.
병리학자와 함께 SRH에 대한 광범위한 평가와 SRH 이미저에 통합된 AI 모델 개발을 통해 이 기술의 기능이 크게 향상되었습니다. 이 프로토콜은 전립선 생검 샘플을 준비하고, SRH 이미저를 사용하여 이미징하고, AI 지원 도구로 데이터를 분석하기 위한 자세한 단계를 간략하게 설명합니다. 이러한 단계를 따르면 연구자와 임상의는 이 새로운 기술을 활용하여 전립선암 발견, 연구 및 치료를 향상시킬 수 있습니다.
이 프로토콜은 인간 표본의 사용을 포함하며 브리티시 컬럼비아 대학교(University of British Columbia)의 인체 관리 지침을 준수합니다. 이 연구는 윤리 승인 번호인 SRH: H23-00459, AI: H24-00585 및 Biobank: H21-03722에 따라 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 표본을 수집하기 전에 모든 인간 피험자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 모든 절차는 참가자의 보호와 기밀성을 보장하기 위해 기관 및 규제 윤리 기준에 따라 수행되었습니다.
1. SRH 이미저를 켭니다.
2. 유체 챔버를 준비합니다.
3. 시스템에 로그인합니다.
4. 새 스터디 만들기
5. 케이스 정보 입력
6. 연구 생성을 완료하고 유체 챔버를 채웁니다.
7. 견본 및 슬라이드의 준비
8. 이미징 획득 매개변수 설정
9. SRH 이미지 획득
10. SRH 이미지의 표시
11. 연구 용도로만 SRH 이미지에 대한 AI 해석
12. SRH 이미지의 확대/축소 및 탐색
13. 선택된 조직의 분리
14. 생검 재스캔
15. 바이오뱅킹 및 냉동 보존
16. 이미지 데이터 내보내기
17. SRH 현미경 끄기
AI와 통합된 SRH의 적용은 몇 분 안에 생검 샘플 내에서 전립선암을 신속하게 감지하고 특성화하는 것을 보여주었습니다. 그림 2A 는 SRH 이미저의 다단계 스캐닝 절차를 간략하게 설명하며, 여기서 세 가지 개별 스캔(스캔 1, 스캔 2 및 스캔 3)이 생검 샘플에서 수행되었습니다. 각 스캔은 포괄적인 SRH 이미지를 생성하는 데 필수적인 지질, 단백질 및 DNA 함량에 해당하는 고유한 분자 진동 신호를 캡처했습니다. 그림 2B에 표시된 최종 합성 이미지는 H&E 염색을 모방하여 병리학자에게 암 부위와 양성 부위를 구별할 수 있는 시각적 도구를 제공합니다. 이 접근 방식은 실시간에 가까운 라벨 없는 진단을 가능하게 하여 생검 획득에서 병리학적 평가까지의 시간을 크게 단축합니다.
이미징 프로세스에 이어 그림 3A와 같은 AI 분석은 SRH 이미지에 예측을 자동으로 오버레이하여 SRH의 진단 기능을 향상시켰습니다. 오버레이는 종양(빨간색), 비종양(녹색) 및 비진단 영역(보라색)을 구분했으며, 이는 그림 3B의 막대 그래프에서 정량화되었습니다. 이 AI 지원 워크플로우는 진단 정확도를 개선하고 관련 없는 조직 영역을 선택적으로 트리밍할 수 있도록 했습니다. 그림 3C-E에서 볼 수 있듯이, 트리밍 후 생검을 다시 스캔하여 암 대 조직 비율을 높이고 추가 분석을 위해 가장 관련성이 높은 영역만 보존하도록 했습니다.
암 대 조직 비율을 검증하기 위해 46개의 생검 검체의 수집, 준비, 스캔 및 평가를 포함하는 포괄적인 분석이 수행되었습니다. 각 표본은 SRH를 사용하여 초기 스캔을 거친 후 AI 생성 오버레이를 기반으로 선택적 트리밍을 거쳐 비암성 조직 영역을 식별하고 제거하여 바이오뱅킹을 위한 암 조직을 풍부하게 했습니다. 그런 다음 개선된 암 대 조직 비율을 확인하기 위해 트리밍된 샘플을 다시 스캔했습니다(그림 4A). 모든 표본에 걸친 암 비율의 분포는 암 조직의 비율이 유의하게 증가한 것으로 나타났으며, 평균은 사전 절단 45%에서 절단 후 78%로 증가했다(p < 0.0001, 그림 4B). 이 접근 방식은 바이오뱅킹 응용 분야에 필요하지 않은 주변의 비암성 조직을 제거하면서 암 영역을 보존하도록 합니다. 95% 신뢰 구간(CI)이 18.68에서 27.40인 23%의 평균 차이는 트리밍 프로세스의 효과를 확인합니다. R2 값 0.72는 또한 트리밍 프로세스와 개선된 암 대 조직 비율 사이의 상관관계를 나타내며, 향상된 검출 및 바이오뱅킹을 위한 이 반복 스캔 및 트리밍 워크플로우의 신뢰성을 더욱 검증합니다.
반대로, 그림 5 는 부적절한 조직 스캔 깊이 또는 조직 잉크와 같은 차선의 스캔 조건에서 발생하는 한계를 보여줍니다. 이러한 경우 잉크 오염으로 인해 아티팩트가 발생하고 조직이 흐려져 정확도가 떨어졌습니다. 이는 진단의 신뢰성을 보장하기 위해 세심한 시료 취급과 프로토콜 준수의 중요성을 강조합니다. 특히 이미징 깊이는 SRH 이미지 품질에 중요한 역할을 합니다. 전립선 조직에 대한 SRH 이미저의 기본 자동 설정은 20μm 이미징 깊이에 최적화되어 있습니다. 그림 5A에서 볼 수 있듯이 10μm에서 획득한 이미지는 더 얕은 깊이에 대한 차선의 매개변수 보정으로 인해 덜 정의된 것처럼 보일 수 있습니다. 특정 관심 심도에 대한 이미징 매개변수를 조정하는 것은 진동 신호 감지와 전반적인 이미지 선명도를 개선하는 데 필요합니다. 이러한 고려 사항은 신뢰할 수 있는 SRH 이미징 결과를 달성하고 임상 및 연구 워크플로우 중에 아티팩트를 줄이는 데 매우 중요합니다.
또한 표준 조직병리학적 관행인 조직 잉크는 종양 경계의 정확한 위치 파악을 위해 수술 가장자리를 표시하는 데 사용됩니다. 그러나 SRH를 사용하여 잉크가 묻은 조직을 이미지화하면 잉크가 레이저 기반 신호 획득을 방해하여 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 이러한 아티팩트는 일반적으로 그림 5B에서 볼 수 있듯이 SRH 이미지에서 비특이적 어둡게 된 영역 또는 신호 드롭아웃 영역으로 나타납니다. 최소한의 적용과 적절한 건조 시간을 포함한 적절한 잉크 기술은 이러한 아티팩트를 줄이고 이미징 정확도를 유지하는 데 필수적입니다.

그림 1: SRH 이미저 및 운영 인터페이스의 이미지. (A) 로그인 화면과 함께 작동 인터페이스를 표시하는 SRH 이미저의 전면 모습. (B) SRH 스캐너의 평면도, 유체 챔버의 주사기 부착물과 이미징을 위해 생검 슬라이드가 배치되는 SRH 이미저 뚜껑을 강조 표시합니다. 약어 : SRH = 자극 된 라만 조직학. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: SRH를 사용한 전립선 생검 영상. (A) SRH 영상기에 의해 3개의 직사각형 섹션(스캔 1, 스캔 2, 스캔 3)에서 순차적 스캔을 거치는 전립선 생검 샘플의 개략도. 점선은 스캔된 생검 영역을 나타냅니다. (B) 스캔된 전립선 생검 샘플의 해당 SRH 이미지로, 섹션 1, 2 및 3이 결합되어 완전한 SRH 이미지를 생성합니다. 점선은 스캔된 각 섹션을 나타냅니다. SRH 이미징 프로세스는 생검 조직의 조직병리학적 평가를 위한 pseudo-H&E 이미지를 생성합니다. 기포는 스캔 3에서 볼 수 있으며, 이는 SRH 이미지에서 해당 아티팩트로 나타납니다. 스케일 바 = 500μm(B). 약어 : SRH = 자극 된 라만 조직학. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 종양 대 조직 비율을 최적화하기 위해 생검 절단 및 재스캔을 통해 SRH 및 AI를 사용한 전립선 생검에서 향상된 종양 검출. (A) 그림 2의 생검의 SRH 이미지(왼쪽)와 해당 SRH-AI 오버레이(오른쪽). AI 오버레이는 종양 영역을 빨간색으로, 비종양 영역을 녹색으로, 비진단 영역을 보라색으로 강조 표시합니다. (B) 초기 SRH 이미지에서 AI가 식별한 종양 및 비종양 영역의 비율을 정량화한 막대 그래프. 비진단의 0%는 종양/비종양 백분율 계산에서 제외됨을 나타냅니다. (C) 종양 대 조직 비율을 증가시키기 위해 생검을 절단하고 다시 스캔합니다. SRH 이미지는 세 개의 개별 섹션(그림 2)으로 스캔되기 때문에 AI 오버레이 이미지를 사용하여 제거를 위한 최적의 영역을 시각적으로 평가하고 식별할 수 있습니다. 생검 눈금자를 사용하여 트리밍이 이루어져야 하는 위치를 안내할 수도 있습니다. (D) 생검을 재스캔한 후 업데이트된 SRH 이미지(왼쪽)와 해당 SRH-AI 오버레이(오른쪽). (E) AI에 의해 식별된 바와 같이 재스캔된 생검에서 종양, 비종양 및 비진단 영역의 비율을 정량화하는 막대 그래프. 스케일 바 = 500μm(A,D). 약어: SRH = 자극된 라만 조직학; AI = 인공 지능. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 암 대 조직 비율에 대한 트리밍의 효과. (A) 46개 표본에 대한 절단 전(파란색) 대 절단 후(빨간색) 암 조직의 비율을 보여주는 쌍을 이룬 데이터 플롯. 각 선은 개별 표본에 대한 precut 및 postcut 값을 연결하여 트리밍 후 암 검출의 증가를 강조합니다. (B) pre-cut 및 post-cut의 암 비율의 상자 그림 표현으로, 중앙값 및 사분위수 범위를 보여줍니다. 통계 분석에 따르면 암 발병 전 암 비율(p < 0.0001)이 유의한 차이를 보였으며, 평균 차이는 23%(95% 신뢰 구간: 18.68-27.40)이고 R2 값은 0.72였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: SRH 이미저에서 바람직하지 않은 결과의 예. (A) 10μm 깊이에서 잉크 마진이 없는 생체 외 근치적 전립선 절제술 표본에서 얻은 전립선 생검의 SRH 이미지로, 조직 시각화가 좋지 않음을 보여줍니다. (B) 10μm 깊이에서 잉크로 된 여백이 있는 생체 외 근치적 전립선 절제술 표본에서 얻은 전립선 생검의 SRH 이미지로, 조직 분화가 불량하고 암 경계가 불분명함을 보여줍니다. 스케일 바 = 500μm(A,B). 약어 : SRH = 자극 된 라만 조직학. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
C. Freudiger는 Invenio Imaging의 직원, 주주 및 이사이며 독립적으로 라이선스가 부여된 유도 라만 분광 현미경에 대한 특허를 보유하고 있습니다. A. Ion-Margineanu는 Invenio Imaging의 주주입니다.
여기에서는 기존 조직병리학에 비해 장점이 있어 생검 샘플에 대해 자극 라만 조직학(SRH)을 사용하여 전립선암을 검출하기 위한 표준화된 프로토콜을 제시하며, 암 대 조직 비율을 개선하기 위해 샘플 준비, 이미징 및 인공 지능에 중점을 둡니다. 또한 전사체학, 오가노이드 또는 이종이식 모델, 수술 중 수술 마진 식별을 위한 바이오뱅킹을 지원합니다.
밴쿠버 전립선 센터(Vancouver Prostate Centre)와 NYU Langone Health의 연구팀의 기여와 Invenio Imaging이 제공하는 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 브리티시 컬럼비아 보건 혁신 허브(Ministry of Health Innovation Hub)의 자금 지원을 받았습니다.
| 벤치탑 액체 질소 용기 | 써모 사이언티픽 | 11-670-4B | |
| 사이토튜브 | 그라이너 바이오-원 | 126279 | |
| Dumont #5 파인 집게, | 정밀 과학 도구 | 11254-20 | |
| NIO 전립선 생검 슬라이드 | 인베니오 이미징, Inc. | AT0013 | |
| RPMI 솔루션 | 써모 피셔 사이언티픽 | 11875093 | |
| 식염수 | 백스터 | ||
| SRH 이미저(NIO 레이저 이미징 시스템) | 인베니오 이미징, Inc. | ||
| 수술용 블레이드 | 피셔 사이언티픽 | 501094395 |