방법 논문

Detection and Isolation of Cancer in Prostate Biopsies Using Stimulated Raman Histology and Artificial Intelligence

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DOI:

10.3791/68083

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2025년 6월 10일

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1Genecentrix Inc., 2Vancouver Prostate Center, University of British Columbia, 3Invenio Imaging, 4Dept. of Urology, NYU Langone Health, 5Dept. of Radiology, NYU Langone Health, 6Dept. of Biomedical Engineering, NYU Langone Health, 7Dept. of Urologic Sciences, University of British Columbia

이 논문에서

요약

여기에서는 기존 조직병리학에 비해 장점이 있어 생검 샘플에 대해 자극 라만 조직학(SRH)을 사용하여 전립선암을 검출하기 위한 표준화된 프로토콜을 제시하며, 암 대 조직 비율을 개선하기 위해 샘플 준비, 이미징 및 인공 지능에 중점을 둡니다. 또한 전사체학, 오가노이드 또는 이종이식 모델, 수술 중 수술 마진 식별을 위한 바이오뱅킹을 지원합니다.

초록

전립선암은 전 세계적으로 남성에게 영향을 미치는 가장 흔한 악성 종양 중 하나로 남아 있으며, 효과적인 개입과 치료를 위해서는 조기 발견과 정밀 의학의 발전이 매우 중요합니다. 전립선암 검출에 인공 지능(AI)이 통합된 자극 라만 조직학(SRH)을 활용하기 위한 표준화된 프로토콜이 제시되어 기존의 조직병리학적 방법에 비해 상당한 발전을 제공합니다. SRH는 염색되지 않은 신선한 조직의 거의 실시간, 무표지 이미징을 통해 효율성을 향상시킴으로써 기존 생검 분석과 관련된 지연을 제거함으로써 이러한 발전을 제공합니다.

유도 라만 산란(SRS) 현미경을 사용하여 지질과 관련된 CH2 결합 및 단백질 및 DNA와 연결된 CH3 결합의 특정 진동 주파수를 감지함으로써 전립선 생검에서 암 조직과 양성 조직을 구별할 수 있습니다. AI 모델은 진단 정밀도를 더욱 향상시켜 전립선암을 식별하는 데 98.6%의 정확도를 달성합니다. 이 프로토콜은 시료 전처리, 이미징 및 데이터 분석을 위한 필수 단계를 간략하게 설명하여 개선된 바이오뱅킹 프로세스를 촉진하고 전사체학 및 이종이식 연구와 같은 다운스트림 애플리케이션을 가능하게 합니다. 이 접근 방식은 진단 워크플로우를 가속화하고 수술 중 응용 분야에 대한 가능성을 보여주며, 잠재적으로 외과의가 수술 중 긍정적인 마진을 식별하는 데 도움이 됩니다. 또한 암 대 조직 비율을 재스캔하고 조정할 수 있는 기능을 통해 생검 샘플에 대한 보다 맞춤화된 분석이 가능하여 처리되지 않은 조직에서 종양 검출을 향상시킬 수 있습니다. 임상 실습에서 SRH의 광범위한 채택을 위해서는 추가 연구와 검증이 필요합니다.

서론

전립선암은 전 세계적으로 남성에게 영향을 미치는 주요 악성 종양 중 하나이며, 조기 발견은 성공적인 중재 및 치료를 위한 중추적인 역할을 합니다1. 역사적으로 전립선암의 진단은 전립선 생검 샘플의 조직병리학적 평가에 크게 의존해 왔으며, 가장 일반적으로 Hematoxylin 및 Eosin (H&E) 염색을 통해 이루어졌습니다2. 전통적인 전립선 생검 분석 방법은 효과적이기는 하지만, 일반적으로 절차적 및 물류적 요인으로 인해 도시 또는 국가에 따라 며칠에서 몇 주까지 기다려야 합니다. 이러한 지연은 포르말린 고정, 파라핀 임베딩, 절편 및 H&E 염색을 포함한 여러 노동 집약적인 단계에서 발생합니다. 따라서 많은 양의 생검 샘플로 인해 누적된 처리 시간이 지연되어 진단 및 치료 계획이 지연될 수 있습니다.

최근 이미징 기술의 발전, 특히 자극 라만 산란(SRS) 현미경 검사는 배경이 없고 쉽게 해석할 수 있는 강력한 이미징 방법을 제공함으로써 진단 관행을 변화시킬 수 있습니다 3,4. SRS는 샘플과 상호 작용하는 펌프 빔(ωp)과 스톡스 빔(ωs)의 두 레이저 빔을 사용합니다. 주파수 차이(Δω = ωp −ωs)가 특정 분자 진동 주파수(Ω)와 일치하면 자극된 라만 이득 또는 손실로 인해 신호가 증폭됩니다. 이 과정은 분자 진동의 대비를 향상시켜 조직의 고감도 이미징을 가능하게 합니다 3,4. SRS를 사용하면 지질과 관련된 CH2 스트레칭 진동(2,845 cm-1) 및 단백질 및 DNA4와 연결된 CH3 스트레칭 진동(2,930 cm-1)과 관련된 분자 진동을 감지할 수 있습니다. SRS 신호의 감지에는 일반적으로 고주파 변조 전송 방식이 포함되므로 배경 잡음에서 약한 진동 신호를 정밀하게 격리할 수 있습니다.

SRS 현미경 검사에는 물리적 조직 절편 없이도 정밀한 3차원 이미징을 가능하게 하는 광학 절편 기능이 있습니다. 이는 펌프와 Stokes 레이저 빔을 특정 분자 진동이 여기되는 샘플 내의 회절 제한 지점에서 정렬하고 집중시킴으로써 달성됩니다. 레이저의 강도에 대한 2차 의존성에서 파생된 SRS의 컨포칼 특성은 신호가 초점면에 국한되도록 하여 초점에서 벗어난 기여를 배제하고 고도로 국부적인 화학 정보를 제공하도록 합니다 5,6. 이 깊이 분해 이미징은 기계적 슬라이싱을 제거하고, 처리 시간을 단축하며, 샘플의 생물학적 및 분자적 맥락을 유지함으로써 조직의 무결성을 보존합니다.

SRS의 원칙을 기반으로 하는 자극 라만 조직학(SRH)은 이 분자 진동 데이터를 활용하여 염색되지 않은 신선한 조직의 pseudo-H&E 이미지를 실시간으로 생성함으로써 임상의에게 더 빠르고 효율적인 진단 도구를 제공합니다 7,8. 고품질 이미지를 생성할 수 있는 이러한 기능은 SRH를 연구 및 잠재적인 임상 응용 분야에 없어서는 안 될 도구로 만들었습니다9. 최근에는 SRH를 사용한 수술 중 마진 평가가 부분 샘 절제 및 근치적 전립선 절제술 중에 거의 실시간으로 병리학적 피드백을 제공하여 즉각적인 치료 조정이 가능했습니다10,11.

SRH 이미저는 고유 분자 진동을 활용하여 조직 구성에 대한 통찰력을 제공합니다. SRH는 CH2 및 CH3 진동 특성을 분석하여 암과 양성 전립선 조직을 효과적으로 구별하는 데 사용할 수 있습니다 7,12. SRH 이미저는 이러한 진동을 포착하고 핵 대비를 향상시키는 유사 H&E 이미지를 생성하여 기존 조직 병리학에 대한 빠른 대안 역할을 하고 조직 크기 7,8에 따라 2-8분 내에 고품질 이미지를 제공합니다.

처리되지 않은 전립선 생검의 신속한 병리학적 검사를 위한 SRH의 효과를 평가했습니다. 병리학자들은 전립선 절제술 표본에서 생체 외에서 얻은 전립선 생검 코어의 SRH 이미지를 해석하도록 훈련을 받았다8. SRH 스캐닝 방법은 몇 분 내에 고해상도 이미지를 획득할 수 있도록 최적화되어 기존 조직 병리학에 비해 필요한 시간을 크게 단축했습니다. 양성 조직과 악성 조직학이 혼합된 생검 샘플은 병리학자를 위한 교육 세트로 사용되었으며, 병리학자들은 SRH로 영상화하고 H&E 염색으로 처리하여 실측 자료로 사용하기 위해 별도의 생검 세트에 대한 맹검 평가를 수행했습니다. 그 결과, 전립선암을 식별하기 위한 병리학자의 평균 정확도는 95.7%였으며, 임상적으로 유의한 암을 발견하는 데 있어 우수한 일치성을 보였으며, 이는 SRH가 실시간에 가까운 진단을 효과적으로 지원할 수 있음을 나타냅니다8.

후속 연구에서는 인공 지능(AI)을 통합하여 진단의 정확성, 효율성 및 구현 용이성을 더욱 향상시켰습니다. 이 AI 모델은 딥 러닝 기술을 사용하여 SRH가 캡처한 진동 및 형태학적 특징을 분석하여 전립선 생검 샘플을 양성, 암 및 비진단 영역으로 자동 분류하여 병리학적 평가 프로세스를 크게 간소화합니다9. SRH-AI 통합은 전립선암 검출에서 96.5%를 달성하여 인상적인 정확도를 보였으며 민감도와 특이도는 각각 96.3% 및 96.6%였습니다9. AI와 SRH를 통합함으로써 숙련된 병리학자와 일치하는 진단 성능을 달성할 수 있었습니다.

병리학자와 함께 SRH에 대한 광범위한 평가와 SRH 이미저에 통합된 AI 모델 개발을 통해 이 기술의 기능이 크게 향상되었습니다. 이 프로토콜은 전립선 생검 샘플을 준비하고, SRH 이미저를 사용하여 이미징하고, AI 지원 도구로 데이터를 분석하기 위한 자세한 단계를 간략하게 설명합니다. 이러한 단계를 따르면 연구자와 임상의는 이 새로운 기술을 활용하여 전립선암 발견, 연구 및 치료를 향상시킬 수 있습니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 인간 표본의 사용을 포함하며 브리티시 컬럼비아 대학교(University of British Columbia)의 인체 관리 지침을 준수합니다. 이 연구는 윤리 승인 번호인 SRH: H23-00459, AI: H24-00585 및 Biobank: H21-03722에 따라 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 표본을 수집하기 전에 모든 인간 피험자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 모든 절차는 참가자의 보호와 기밀성을 보장하기 위해 기관 및 규제 윤리 기준에 따라 수행되었습니다.

1. SRH 이미저를 켭니다.

  1. SRH 이미저의 전원을 켭니다(그림 1A). 레이저가 정확한 이미징을 위한 최적의 작동 온도에 도달하도록 시스템을 30분 동안 예열합니다.

2. 유체 챔버를 준비합니다.

  1. 멸균된 물로 채워진 50mL 주사기를 SRH 이미저 인터페이스의 왼쪽에 있는 주사기 밸브에 부착합니다(그림 1B). 적절한 유체 순환을 유지하기 위해 주사기가 단단히 장착되었는지 확인하십시오.

3. 시스템에 로그인합니다.

  1. 시스템이 로드되면 터치스크린 모니터를 사용하여 사용자 이름과 암호를 입력합니다.
  2. 적절한 사용자 이름을 선택하고 암호를 입력합니다. 로그인을 탭합니다.
  3. 면책 조항을 수락하여 연구가 미국 또는 유럽 연합 이외의 지역에서 사용되는 경우 연구 목적임을 인정합니다.

4. 새 스터디 만들기

  1. 디스플레이 옵션에서 새 스터디 작성(새 스터디 작성, 기존 스터디 계속, 기존 스터디 보기)을 선택합니다.

5. 케이스 정보 입력

  1. 성, 이름, 의료 기록 번호, 생년월일, 등록 번호, 임상시험 ID, 의사 이름, 병실 번호, 기본 해부학적 위치 및 분석 모듈을 포함한 관련 사례 정보를 입력합니다.
  2. 예를 들어 샘플을 John Doe 로 저장합니다.
  3. Primary Anatomical Location(Primary Anatomical Location)에서 Prostate (Research Use Only)를 선택합니다.
  4. 분석 모드(Analysis Mode)에서 전립선암(연구 전용)을 선택하여 전립선암 감지에 통합 AI를 사용합니다.

6. 연구 생성을 완료하고 유체 챔버를 채웁니다.

  1. 사례 정보를 입력한 후 연구 생성을 누릅니다.
  2. 시스템에서 메시지가 표시되면 승인을 눌러 데이터가 연구 목적으로만 사용되는지 확인합니다.
  3. 지시에 따라 유체 챔버를 멸균된 물로 채웁니다.
  4. 메시지가 표시되면 Next 를 탭한 다음 표시된 옵션에서 Acquire 를 선택합니다.
  5. Load New Specimen을 탭하면 시스템에 Prepare Specimen & Load NIO Slide가 표시됩니다.

7. 견본 및 슬라이드의 준비

  1. 전립선 생검 슬라이드를 검색합니다. 이빨이 있는 티슈 집게를 사용하여 부착된 커버슬립을 조심스럽게 엽니다. 슬라이드와 커버슬립을 연 상태에서 조직 집게를 사용하여 RPMI 매체의 전립선 생검을 슬라이드의 홈에 단단히 놓습니다. 커버슬립을 부드럽게 닫고 샘플을 고정합니다.
  2. SRH 이미저 인터페이스에서 슬라이드 홀더를 열고 준비된 슬라이드를 슬라이드 홀더에 삽입하여 적절한 정렬을 확인합니다. SRH 이미저 덮개를 닫습니다. 시스템이 닫힌 뚜껑을 감지하면 다음을 눌러 계속 진행합니다.

8. 이미징 획득 매개변수 설정

  1. 다음 이미징 매개 변수를 설정합니다.
    1. Specimen Name(검체 이름)의 경우: 첫 번째 생검에 대해 Biopsy 1 A를 선택합니다.
    2. 스캔 영역: 0.4 mm x 6.1 mm, 3 regions (Research Use Only)를 선택하여 전체 생검을 스캔합니다.
    3. 스캔 위치의 경우: 화면 이미지를 사용하여 스캔 위치를 수동으로 조정합니다.
  2. 계속 진행하려면 이미지 가져오기 를 누릅니다.
  3. 화면에 표시된 샘플 세부 정보를 검토하고 진행을 선택하여 확인합니다.

9. SRH 이미지 획득

  1. SRH 이미저가 최종 SRH 이미지를 생성하는 이미지를 자동 초점을 맞추고 획득할 수 있습니다.
  2. 이미저가 그림 2A와 같이 세 섹션(스캔 1, 스캔 2, 스캔 3)으로 생검을 스캔하도록 합니다.
  3. 이미저가 섹션을 결합하여 완전한 SRH 이미지(그림 2B)를 형성하고 평가를 위한 pseudo-H&E 이미지를 생성하도록 합니다.

10. SRH 이미지의 표시

  1. 신선하고 염색되지 않은 전립선 생검의 SRH 이미지를 봅니다. 이 이미지는 CH2 분자 진동(지질과 관련됨) 및 CH3 분자 진동(단백질 및 DNA와 관련됨)을 강조하는 분홍색/보라색 색 구성표를 사용하여 H&E 염색을 모방합니다.

11. 연구 용도로만 SRH 이미지에 대한 AI 해석

  1. 화면에서 (>>) 아이콘을 클릭하여 AI 오버레이를 적용합니다. AI 오버레이는 암 영역을 빨간색으로, 비암 영역을 녹색으로, 비진단 영역을 보라색으로 식별합니다(그림 3A).
  2. 암 조직, 비암 조직 및 비진단 조직의 비율을 정량화하는 막대 그래프를 검토합니다(그림 3B).
  3. (<<) 아이콘을 클릭하여 AI 오버레이가 없는 원본 SRH 이미지로 돌아갑니다.

12. SRH 이미지의 확대/축소 및 탐색

  1. 터치스크린의 zoom-in(확대 ) 및 zoom-out(축소) 기능을 사용하여 생검의 다양한 영역을 자세히 탐색할 수 있습니다.
  2. 탐색 아이콘을 사용하여 이미지를 이동함으로써 생검 샘플을 종합적으로 검사할 수 있습니다.

13. 선택된 조직의 분리

  1. 초기 스캔 후 슬라이드에서 생검을 조심스럽게 제거합니다. 치아가 있는 조직 집게를 사용하여 부착된 커버슬립을 들어 올리고 생검을 부드럽게 해제합니다.
  2. 트리밍 과정에서 조직의 무결성을 유지하기 위해 식염수에 적신 축축한 Telfa에 생검을 놓습니다.
  3. 수술용 칼날을 사용하여 오버레이를 시각적으로 평가하여 최적의 제거 영역을 결정함으로써 SRH 이미지의 AI 생성 오버레이에서 식별된 비암 영역을 트리밍합니다. 암 대 조직 비율을 높이기 위해 일반적으로 생검 끝에 위치한 영역을 제거하는 데 중점을 둡니다. 다시 스캔할 수 있도록 충분한 조직이 남아 있는지 확인합니다.

14. 생검 재스캔

  1. 9-11단계에 설명된 것과 동일한 절차에 따라 생검을 다시 스캔합니다.
  2. 스캔 영역과 위치를 조정하여 암 대 조직 비율이 증가했는지 확인합니다(그림 3C-E 참조). 업데이트된 SRH 이미지와 AI 오버레이를 검토하여 암 및 비암 영역의 비율을 확인합니다.
  3. 원하는 비율이 얻어질 때까지 트리밍과 다시 스캔을 반복합니다.

15. 바이오뱅킹 및 냉동 보존

  1. 이빨이 있는 조직 집게를 사용하여 슬라이드에서 생검을 제거합니다. 생검을 cryotube에 넣습니다.
  2. 시료를 빠르게 보존할 수 있도록 cryotube를 액체 질소로 동결합니다.
  3. 장기 보존을 위해 액체 질소에 담긴 극저온 튜브를 -80°C 냉동고 또는 액체 질소 저장 시설로 옮깁니다.

16. 이미지 데이터 내보내기

  1. Paper Airplane 아이콘을 눌러 저장 및 추가 분석을 위해 이미지 데이터를 내보냅니다.
  2. 내보내기 위치를 선택하려면 내보내기 위치 선택 옵션을 누르고 USB(비식별), USB(전체) 및 iPhone(전체) 중에서 선택합니다. USB(전체) 를 선택하고 데이터 내보내기를 위한 외장 하드 디스크를 선택합니다.
  3. 내보낼 이미지 시리즈를 선택하려면 전체 연구를 선택하여 특정 시리즈가 아닌 환자에 대한 모든 SRH 이미지 시리즈를 내보냅니다.
  4. 시스템에 내보내기 진행 중 이 표시될 때까지 기다렸다가 내보내기가 완료되면 확인을 누릅니다.

17. SRH 현미경 끄기

  1. 종료를 누르고 화면에 표시된 종료 지침을 따릅니다.
  2. 이미지 데이터를 보관하라는 메시지가 표시되면 Proceed Without (이미 내보낸 경우)를 선택합니다.
  3. 적절한 실험실 프로토콜에 따라 샘플을 폐기하십시오.
  4. Next를 누르고 지시에 따라 부착된 주사기를 사용하여 유체 챔버를 비웁니다.
  5. 메시지가 표시되면 다음을 탭하고 표시된 옵션에서 예를 선택합니다.
  6. 주사기를 제거하고 폐기하십시오.
  7. 종료를 눌러 SRH 현미경의 전원을 완전히 끕니다.

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결과

AI와 통합된 SRH의 적용은 몇 분 안에 생검 샘플 내에서 전립선암을 신속하게 감지하고 특성화하는 것을 보여주었습니다. 그림 2A 는 SRH 이미저의 다단계 스캐닝 절차를 간략하게 설명하며, 여기서 세 가지 개별 스캔(스캔 1, 스캔 2 및 스캔 3)이 생검 샘플에서 수행되었습니다. 각 스캔은 포괄적인 SRH 이미지를 생성하는 데 필수적인 지질, 단백질 및 DNA 함량에 해당하는 고유한 분자 진동 신호를 캡처했습니다. 그림 2B에 표시된 최종 합성 이미지는 H&E 염색을 모방하여 병리학자에게 암 부위와 양성 부위를 구별할 수 있는 시각적 도구를 제공합니다. 이 접근 방식은 실시간에 가까운 라벨 없는 진단을 가능하게 하여 생검 획득에서 병리학적 평가까지의 시간을 크게 단축합니다.

이미징 프로세스에 이어 그림 3A와...

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토론

전립선암 감지를 위한 SRH 프로토콜은 의료 영상 및 조직 병리학의 중요한 발전을 나타냅니다. SRH는 염색되지 않은 신선한 조직의 거의 실시간, 라벨 없는 이미징을 가능하게 하여 기존의 조직병리학적 방법과 관련된 지연 없이 처리되지 않은 조직의 신속한 암 검출을 가능하게 합니다 3,4,5,6,7,8,9. 이 프로토콜의 중요한 단계에는 SRH 이미저 준비, 생검 샘플 처리, 이미지 분석을 위한 AI 통합이 포함됩니다. 특히, 이 프로토콜은 최적의 레이저 성능...

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공개 사항

C. Freudiger는 Invenio Imaging의 직원, 주주 및 이사이며 독립적으로 라이선스가 부여된 유도 라만 분광 현미경에 대한 특허를 보유하고 있습니다. A. Ion-Margineanu는 Invenio Imaging의 주주입니다.

감사의 글

밴쿠버 전립선 센터(Vancouver Prostate Centre)와 NYU Langone Health의 연구팀의 기여와 Invenio Imaging이 제공하는 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 브리티시 컬럼비아 보건 혁신 허브(Ministry of Health Innovation Hub)의 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
벤치탑 액체 질소 용기써모 사이언티픽11-670-4B
사이토튜브그라이너 바이오-원126279
Dumont #5 파인 집게,정밀 과학 도구11254-20
NIO 전립선 생검 슬라이드인베니오 이미징, Inc.AT0013
RPMI 솔루션써모 피셔 사이언티픽11875093
식염수백스터
SRH 이미저(NIO 레이저 이미징 시스템)인베니오 이미징, Inc.
수술용 블레이드피셔 사이언티픽501094395

참고문헌

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  3. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nat Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
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