방법 논문

MPTP 유발 파킨슨병의 마우스 모델에서 비강내 투여된 옥타데카뉴로펩티드 유사체의 신경 보호 효과

DOI:

10.3791/68122

⸱

2025년 8월 29일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Sciences of Tunis, LR18ES03, Laboratory of Neurophysiology Cellular Physiopathology and Biomolecule Valorization, University Tunis El Manar, 2Inserm U1239 NorDiC, Laboratory of Neuroendocrine, Endocrine and Germinal Differentiation and Communication, PRIMACEN, Univ Rouen Normandie, 3Confocal Microscopy Unit, Faculty of Medicine of Tunis, University Tunis El Manar

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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비강내 투여는 생리 활성 분자를 뇌에 직접 전달할 수 있게 하여 뇌실내 방법에 대한 비침습적 대안을 제공합니다. 이 연구는 ODN 유사체인 cyclo(1-8)OP의 비강내 투여가 파킨슨병 마우스 모델에서 선조체의 MPTP 유발 산화 손상 및 세포사멸에 대해 강력한 신경 보호 효과를 발휘하여 치료 가능성을 강조한다는 것을 보여줍니다.

초록

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파킨슨병(PD)은 기존 치료법이 주로 완화적이고 치료 효능이 부족한 신경퇴행성 질환입니다. 옥타데카뉴로펩티드(ODN)는 성상세포에 의해 독점적으로 생성되는 펩타이드로, PD의 시험관 내 및 생체 내 모델에서 산화 세포 손상 및 세포사멸로부터 뉴런을 보호합니다. 그러나 ODN은 혈액뇌장벽(BBB)을 통과할 수 없으며 뇌에 도달하려면 뇌실내 주사가 필요하므로 치료 적용에 상당한 어려움이 있습니다. 이 연구는 PD의 생체 내 모델에서 BBB를 우회하기 위해 비강내(IN) 경로를 통해 전달된 ODN 유사체인 cyclo(1-8)OP의 신경 보호 효능을 조사합니다. 수컷 C57BL/6J 마우스를 실험에 사용하고 가짜, MPTP-(20mg/kg 체중, 복강내), cyclo(1-8)OP-(10ng/10μL, IN) 및 MPTP + cyclo(1-8)OP 처리 동물. 0일(D0)에, 동물은 100μL MPTP 용액을 2시간 간격으로 3회 복강내 주사(MPTP- 및 MPTP + 사이클로(1-8)OP 처리된 마우스) 또는 식염수(가짜 및 사이클로(1-8)OP 처리된 마우스)을 투여받았습니다. 최종 주사 1시간 후, cyclo(1-8)OP(cyclo(1-8)OP- 및 MPTP + cyclo(1-8)OP 처리 마우스) 또는 IN 식염수(가짜 및 MPTP 처리 마우스)의 IN 점적 10μL를 투여하였다. D7에서는 운동 기능을 평가하기 위해 실린더 테스트를 수행했습니다. 그 후, 동물을 희생시키고, 선조체를 제거하고 RT-qPCR로 분석하여 카스파제-3 유전자 발현을 평가하였다. 조직 샘플은 또한 항산화 효소 활성, 활성 산소종(ROS), 말론디알데히드(MDA) 및 카르보닐화 단백질 풍부도를 측정하는 데 사용되었습니다. 최종 MPTP 투여 후 1시간 후에 투여된 10ng cyclo(1-8)OP의 단일 IN 용량은 치료 후 7일 동안 선조체의 신경독성을 예방했습니다. Cyclo(1-8)OP 매개 신경 보호는 선조체에서 MPTP에 의해 유도된 카스파제-3 발현의 강력한 억제와 관련이 있었습니다. 또한 cyclo(1-8)OP는 항산화 효소의 활성을 회복시켜 선조체에 ROS, 지질 과산화 산물 및 단백질 카르보닐화의 축적을 방지했습니다.

서론

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파킨슨병(PD)은 선조체를 자극하는 흑질에서 도파민성 뉴런의 점진적인 손실을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환입니다. 이러한 손실은 근육 경직, 운동 불능증 및 운동 완서와 같은 심각한 운동 장애를 포함한 심각한 신경학적 증상을 초래합니다1. 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환의 유병률은 주로 인구 고령화로 인해 계속 증가하고 있으며 상당한 공중 보건 문제를 야기하고 있습니다2. PD에 대한 현재 치료법은 주로 도파민성 유사체와 뇌내 고주파 자극에 의존합니다 3,4. 그러나 이러한 치료법은 신경 보호 효과가 부족하고 질병 진행을 멈추지 못하므로 신경 손실을 예방하고 재생을 촉진하며 질병 진행을 완화하기 위한 혁신적인 전략이 시급히 필요합니다5.

옥타데카신경펩티드(ODN)는 포유류 중추신경계의 성상신경교세포에 의해 주로 발현되는 86-아미노산 전구체 디아제팜 결합 억제제(DBI)6의 단백질 분해 처리에서 파생된 펩타이드입니다. ODN의 1차 구조의 진화적 보존은 ODN의 중요한 생물학적 역할을 시사합니다. ODN은 음식 섭취, 수면, 공격성 및 불안 관련 행동과 같은 주요 기능을 조절하는 것으로 나타났습니다7. 규제 역할 외에도 광범위한 연구를 통해 신경 변성과 관련된 다양한 신경 장애에서 ODN의 신경 보호 특성이 입증되었습니다. 예를 들어, ODN은 PD8 모델에서 도파민성 뉴런을 보호하고 설치류의 뇌졸중 후 기능 회복을 향상시키면서 경색 크기를 줄입니다9. ODN의 주요 특징 중 하나는 항세포사멸, 항염증, 항산화 및 면역 조절 활성을 통해 뇌 손상 중에 활성화되는 많은 해로운 과정에 대응하는 능력입니다 10,11,12. 또한, ODN은 신경 발생 및 신경 가소성을 촉진함으로써 뇌졸중의 급성기 이상으로 작용할 수 있습니다9. 치료제로서 펩타이드 또는 그 유사체의 잠재적인 임상 적용을 위해서는 혈류의 급속한 분해를 방지하고 1차 통과 효과를 최소화하기 위해 최적의 투여 경로를 선택하는 것이 중요합니다. 다양한 전달 전략 중에서 비강내(IN) 투여는 혈액-뇌 장벽(BBB)을 우회하면서 특정 생리 활성 분자를 뇌에 직접 전달할 수 있는 유망한 비침습적 대안으로 부상했습니다13,14,15. 이 경로는 침습적 정위 주사의 필요성을 없애고 말초 장기에 비해 뇌 생체 분포를 향상시킵니다. 예를 들어, 뇌하수체 아데닐레이트 시클라제 활성화 폴리펩티드(PACAP)는 정맥 주사에 비해 IN 점적에 의해 전달될 때 뇌 흡수 및 신경 보호에 더 큰 효능을 입증하여 뇌졸중 모델에서 경색 부피를 크게 줄이고 기능 회복을 개선했습니다9.

IN 투여는 BBB를 우회하여 치료제를 뇌에 직접 전달하는 최소 침습적이고 효율적인 기술이지만 그 효능은 투여된 용량 및 총 부피를 포함한 몇 가지 실용적인 매개변수에 따라 달라집니다. 설치류의 경우 권장 부피는 일반적으로 흡인이나 위장관으로의 범람을 방지하기 위해 콧구멍당 10에서 25μL 사이입니다16,17. 비강 흡수의 효율성은 또한 동물의 크기, 비강 표면적, 점액섬모 청소율 및 친유성 및 분자량과 같은 화합물 특성에 의해 영향을 받습니다18,19. 이러한 제약 조건은 전임상 모델에서 재현성과 번역 관련성을 보장하기 위해 프로토콜 설계 중에 고려해야 합니다.

생체 내 연구에서는 저용량의 ODN의 뇌실내(ICV) 주사가 특히 MPTP 처리된 마우스에서 도파민성 뉴런의 변성을 예방함으로써 상당한 신경 보호 효과를 부여하는 것으로 나타났습니다8. 현재 연구는 신경 보호 펩타이드 유사체를 뇌에 전달하기 위한 ICV 주사의 비침습적 대안으로서 ODN 유사체인 cyclo(1-8)OP의 IN 투여의 타당성과 효능을 평가하는 것을 목표로 하며, 특히 이 경로가 PD의 잘 확립된 모델인 MPTP 치료 마우스에서 도파민성 신경 손실을 예방하고 운동 결과를 개선할 수 있는지 여부를 결정하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

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모든 실험은 미국 수의학 협회 지침을 따랐으며 파스퇴르 연구소의 의료 윤리 위원회(승인 번호: FST/LNFP/Pro 160220)의 승인을 받았습니다. 10주령 C57BL/6J 수컷 마우스는 튀니스 파스퇴르 연구소에서 얻었습니다. 마우스는 12시간의 빛/암흑 주기로 온도 조절된 방(21°C ± 1°C)에서 케이지당 3마리에 수용되었고 1주일의 순응 기간 동안 음식과 물에 대한 자유로운 접근을 제공했습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 치료 절차

  1. 동물을 가짜(n = 9), MPTP-(n = 9), cyclo(1-8)OP-(n = 9) 및 MPTP + cyclo(1-8)OP 처리(n = 9)의 네 그룹으로 나눕니다.
  2. 치료 첫날(D0)에 0.9% NaCl 100μL에 MPTP(20mg/kg b.w.)를 3회 복강내(IP) 주사합니다. 최종 MPTP 주사 1시간 후, 10μL의 cyclo(1-8)OP(10ng) 또는 식염수를 비강내(IN)로 투여합니다.
  3. cyclo(1-8)OP를 사용하거나 사용하지 않고 MPTP 대신 식염수를 대조군 동물에게 주사합니다(그림 1).
  4. 일곱째 날(D7)에 마우스를 실린더 테스트에 노출시킵니다. 그런 다음 펜토바르비탈의 IP 주사를 사용하여 마우스를 깊게 마취하고 (기관에서 승인된 프로토콜에 따라) 실시간 PCR 및 생화학적 분석을 위해 뇌를 수집하기 위해 희생합니다20 (그림 2).

2. 주입 절차

  1. 복강내 주사
    1. 시술 중에 마우스를 조심스럽게 배치하고 머리를 고정하십시오.
    2. 마우스의 머리를 아래로 향하게 하여 장기가 중력에 의해 자연스럽게 움직일 수 있도록 하여 바늘과의 접촉을 최소화합니다.
    3. 바늘을 하복부에 45도 각도로 삽입합니다.
    4. 각 주사 사이에 2시간 간격으로 같은 쪽에 3회 100μL 주사를 투여하고 모두 같은 날에 수행합니다.
    5. 가짜 및 cyclo(1-8)OP 그룹의 경우 0.9% 식염수를 주입하거나 MPTP 및 MPTP + cyclo(1-8)OP 그룹의 경우 MPTP 용액(20mg/kg b.w.)을 주입합니다.
  2. 비강내 투여
    참고: 선택된 용량(10ng)은 ODN8의 ICV 투여의 신경 보호 효능을 입증하는 이전 연구를 기반으로 했습니다. 총 부피 10μL와 액적 크기(콧구멍당 5μL)는 확립된 IN 투여 프로토콜18,21에 따라 선택되었습니다. 이 부피는 마우스 비강의 평균 용량(0.032cm3)보다 훨씬 낮기 때문에 콧구멍 폐쇄 또는 질식의 위험을 최소화하고 안전하고 효율적인 비강 흡수를 보장합니다22.
    1. 마우스의 목덜미를 단단히 잡고 코가 위쪽을 향하도록 하여 머리의 움직임을 최소화하면서 정확한 투여를 용이하게 합니다.
    2. 복쪽이 천장을 향하고 목이 바닥과 평행이 되도록 동물을 뒤집습니다. 마우스 머리가 단단히 고정되어 수직 또는 수평 움직임을 방지하십시오.
    3. 피펫 팁을 마우스의 콧구멍에 맞추고 플런저를 천천히 눌러 작은 물방울을 형성합니다.
    4. 5μL(부피의 절반) 물방울을 마우스의 각 콧구멍 근처에 놓습니다.
    5. 마우스가 용액을 자연스럽게 흡입하도록 합니다.
    6. MPTP + cyclo(1-8)OP 및 cyclo(1-8)OP 그룹에 대해 10μL의 cyclo(1-8)OP(10ng)를 투여하여 일관된 투여를 보장하기 위해 이 단계를 반복합니다.
    7. 절차 내내 마우스의 입을 주의 깊게 관찰하십시오. 입안에 액체가 있으면 비강 흡수가 불완전함을 나타낼 수 있습니다. 이는 부적절한 물방울 크기, 빠른 투여 또는 불충분한 흡입으로 인해 발생할 수 있으며, 이로 인해 용액이 비인두에 고여 입을 통해 빠져나갈 수 있습니다.
    8. 필요한 경우 액적 크기를 줄이고 추가 부피를 투여하기 전에 적절한 흡입 시간을 보장하여 이러한 위험을 최소화하십시오.
    9. 과도한 양을 방지하기 위해 즉시 추가 용량을 투여하지 마십시오.
    10. 잘못 배치된 복용량을 문서화하고 배출된 액체를 주의 깊게 기록하십시오.
    11. 추가 투여를 진행하기 전에 각 마우스가 두 방울(콧구멍당 하나씩)을 완전히 흡입했는지 확인하십시오.
    12. 메틸렌 블루 용액의 IN 주입을 수행하여 후각 구근의 정확한 표적화를 확인합니다.
    13. 파란색 착색의 침착 및 확산을 육안으로 검사하여 정확도를 평가합니다.

3. 실린더 테스트

  1. 높이 20cm, 직경 15cm의 투명 원통을 테이블 중앙에 놓습니다.
  2. 환경 조명 효과를 최소화하기 위해 실린더 주위(4-8cm 거리)에 세 개의 검은색 판지 패널을 배치합니다. 비디오 녹화를 위해 실린더의 한쪽을 열어 둡니다.
  3. 카메라를 실린더에서 40-60cm 떨어진 곳에 설정하여 전체 보기를 캡처합니다.
  4. 마우스를 실린더에 넣고 즉시 5분 동안 기록을 시작합니다.
  5. 각 마우스가 테스트를 완료한 후 실린더를 물로 청소하고 70% 에탄올을 뿌려 냄새를 제거한 다음 다음 마우스를 테스트하기 전에 물기를 닦습니다.
  6. 자세한 관찰을 위해 녹화를 절반 속도로 재생합니다.
  7. 탐색적 행동을 평가하기 위해 마우스가 실린더 벽에 발을 들어 올리는 각 인스턴스를 계산합니다23.

4. 생화학 실험을 위한 뇌조직 추출물의 제조

  1. 펜토바르비탈(40mg/kg, IP)으로 동물을 마취한 다음 참수합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름).
  2. 선조체를 해부하고 용해 완충액(1% Triton X-100, 50mM Tris-HCl, 10mM EDTA)을 사용하여 조직 그램당 2mL의 TBS로 균질화합니다.
  3. 14,000 × g 에서 4°C에서 15분 동안 균질화를 원심분리합니다.
  4. Biuret 비색 측정 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정하고 나중에 분석할 수 있도록 분취량을 -20°C에서 보관합니다.

5. 세포내 ROS 형성 측정

  1. 뇌 조직 추출물을 10μM의 DCFH2-DA와 함께 37°C에서 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.
  2. 상청액을 제거하고 PBS(0.1M, pH 7.4, 37°C)로 두 번 세척합니다.
  3. 485nm의 여기 파장과 538nm의 방출 파장에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광을 측정합니다.

6. 산화 스트레스 마커 측정

  1. 말론디알데히드
    1. 20 μL의 샘플(~50 μg 단백질)을 125 μL의 20% TCA 및 50 μL의 0.67% TBA와 혼합합니다.
    2. 95°C에서 30분 동안 배양한 다음 4°C에서 빠르게 냉각합니다.
    3. 800μL의 부탄올, 와류를 첨가하고 3000× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
    4. 532nm에서 흡광도를 측정하고 소광 계수(1.65 × 105 M-1 cm-1)를 사용하여 MDA 수준을 계산합니다.
  2. 단백질 카르보닐 측정
    1. 200 μL의 DNPH와 50 μL의 단백질 샘플을 혼합하고 1시간 동안 배양합니다.
    2. 20% TCA 250μL를 넣고 얼음 위에서 10분 동안 식힙니다.
    3. 3000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 펠릿을 10% TCA로 세척한 다음 에탄올:에틸 아세테이트(v/v)로 세척합니다.
    4. 펠릿을 250μL의 6M 구아니딘 염산염에 재현탁하고 370nm에서 흡광도를 측정합니다.
    5. 소광 계수(22,000M-1cm-1)24를 사용하여 PCO 수준을 계산합니다.

7. 항산화효소 활성 측정

  1. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 분석
    1. 샘플(~50μg)을 소 카탈라아제(0.4U/L), DL-에피네프린(5mg/mL) 및 Na2CO3/NaHCO3 완충액(62.5mM, pH 10.2)과 함께 배양합니다.
    2. 분광 광도계를 사용하여 60초 간격으로 300초 동안 480nm에서 에피네프린 산화를 측정합니다25.
  2. 카탈라아제 분석
    1. PBS에서 샘플을 90mM H2O2 와 혼합합니다.
    2. 240nm에서 30초 간격으로 3분 동안 H2O2 흡광도의 감소를 모니터링합니다.
    3. 소광 계수(40M-1cm-1)를 사용하여 CAT 활동을 계산합니다.

8. 실시간 PCR 분석

  1. 산성 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 방법을 사용하여 마우스 선조체에서 총 RNA를 추출합니다.
  2. DNase I로 RNA를 처리하여 게놈 DNA를 제거하고 260nm에서 RNA 농도를 측정합니다.
  3. 1단계 Q-RT PCR 키트와 함께 총 RNA 1μg을 사용하여 정량적 RT-PCR을 수행합니다.
  4. SYBR Green PCR Master Mix 및 프라이머로 cDNA를 증폭합니다(표 1).
  5. GAPDH를 내부 대조군으로 사용하는 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 상대적 cDNA 수준을 계산합니다26.

9. 통계 분석

  1. GraphPad 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
  2. 단일 비교에는 스튜던트 t-검정을 사용합니다. 다중 비교의 경우 일원 또는 양방향 ANOVA를 사용한 다음 Bonferroni의 사후 검정을 적절하게 사용합니다. 모든 경우에 0.05 이하의 P-값을 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.

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결과

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MPTP 투여 후, 마우스는 Straub 꼬리의 상승 및 경직, 제공, 부동, 척추 만곡과 같은 자세 이상 등 특징적인 파킨슨병 증상을 보여 MPTP 모델의 성공적인 확립을 확인했습니다(그림 3). 주사 후 10분 동안 마우스를 희생한 메틸렌 블루를 사용한 IN 전달 검증은 표적 후각 구근 및 뇌 영역 내에서 효과적인 염료 분포를 보여 이 방법의 정밀도를 뒷받침했습니다(그림 4).

행동 평가에 따르면 MPTP 처리된 마우스는 대조군에 비해 앞발 들어 올리기가 현저하게 감소했으며, 이는 MPTP 유발 파킨슨병의 특징적인 운동 장애를 반영합니다. 대조적으로, cyclo(1-8)OP(10ng/10μL)의 IN 투여는 앞발 리프팅이 거의 제어 수준에 도달하면서 운동 기능을 회복했으며, 이는 cyclo(1-8)OP...

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토론

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이전 연구에서는 ODN의 ICV 투여가 MPTP 유발 흑질선조체 도파민성 뉴런의 변성, 산화 손상 및 신경염증에 대응한다는 것을 입증했습니다8. 현재 조사에서는 C57BL/6J 마우스를 사용한 생체 내 PD 모델에서 MPTP 유발 운동 장애, 산화 손상 및 신경독성을 예방하기 위한 ODN 유사체인 cyclo(1-8)OP의 IN 전달 효능을 평가했습니다.

그 결과는 MPTP 치료를 받은 마우스가 상승되고 경직된 스트라우브 꼬리, 제공, 부동성 및 구부러진 척추와 같은 자세 이상을 포함한 특징적인 파킨슨병 증상을 나타내는 것으로 나타났습니다.27, MPTP 마우스 모델에서 파킨슨병 운동 증상의 성공적인 유도를 확인했습니다. IN 전달 경로의 효능을 검증하기 위해 메틸렌 블루 투여를 사용하여 표적 후각 구...

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공개 사항

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저자는 이 기사에 보고된 작업에 영향을 미칠 수 있는 알려진 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작업은 신경생리학, 세포 생리병리학 및 생체분자 가치화 연구실, LR18ES03, NorDiC Inserm U1239, 프랑스-튀니지 CMCU-캠퍼스 프랑스/PHC Utique 24G0807/50283RD 교환 프로그램(Olfa Masmoudi-Kouki 및 Jérôme Leprince), 프로그램 Horizon-Marie Skłodowska-Curie Actions(MSCA) PsyCoMed 보조금 계약 ID: 101086247 및 Marie Skłodowska Curie 보조금 계약에 따른 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램 아니오 101034329.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2', 7'-디클로로플루오레신 DCFH2-DA시그마 알드리치064M4008V
Bio-Rad 분광 광도계 Bio-Rad Laboratories, 미국 펜실베이니아주 필라델피아
부탄올
사진기
소 간에서 추출한 카탈라아제SIGMA 생명 과학SLBZ7596
cyclo(1-8)OPINSERM U1239 NorDiC, 루앙
실린더 테스트(눈금 비커)
DNPH 
EDTA 플러스써모 사이언틱 11836714
에탄올 70%
에탄올-에틸아세테이트 용액
GraphPad 소프트웨어 미국 캘리포니아주 라호야
구아니딘 염산염제네온5CCAE310
H2O2 파마그렙AEQ10101-D
인슐린 주사기 2ml
L-에피네프린 MP 바이오메디컬151065
메틸렌 블루 Thermo Scientific Chemicals10455081
마이크로피펫 
마이크로플레이트 리더 Synergy LX-Agilent시너지 LX-애질런트
MPTP메드켐익스프레스하이-15608
MPTP
Na2CO3/NaHCO3 버퍼 
나크롬 0.9
원스텝 Q-RT PCR 키트 뉴잉글랜드 바이오랩스
펜토바르비탈 시그마 알드리치
Synergy LX Nanodrop 2000 분광 광도계 바이오텍 애질런트
티오바르비투르산(TBA, 0.67%) 로바 케미 PVT. 주식 회사626500025
팁
트리클로로아세트산(TCA, 20%)Sisco 연구소 SRL6740608
트라이 시약 시그마 알드리치MFCD00213058
트리스-HCl써모 사이언틱 J22638입니다. 케이2
트리톤 X-100써모 사이언틱 A16046.AE

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Dionísio, P. A., Amaral, J. D., Rodrigues, C. M. P. Oxidative stress and regulated cell death in Parkinson's disease. Ageing Res Rev. 67, 101263(2021).
  3. Charvin, D., Medori, R., Hauser, R. A., Rascol, O. Therapeutic strategies for Parkinson disease: Beyond dopaminergic drugs. Nat Rev Drug Discov. 17 (11), 804-822 (2018).
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  5. Airavaara, M., Voutilainen, M. H., Wang, Y., Hoffer, B. J. Neurorestoration. Parkinsonism Relat Disord. 18 Suppl 1 (01), S143-S146 (2012).
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  9. Cherait, A., Maucotel, J., Lefranc, B., Leprince, J., Vaudry, D. Intranasal administration of PACAP is an efficient delivery route to reduce infarct volume and promote functional recovery after transient and permanent middle cerebral artery occlusion. Front Endocrinol. 11, 585082(2021).
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