Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops (시험관 내 활성 활성 어셈블리의 수축성 및 변형 모드 조정: 2차원 활성 네트워크에서 액정 방울까지)

Summary

여기에서는 정제된 단백질로부터 준2차원(2D) 얽힘, 가교 및 액정 액틴 어셈블리를 준비하는 방법을 제시합니다.

Abstract

Actin 세포골격 기반 재료는 형상 조절 및 힘 생성과 같은 세포 역학의 물리적 메커니즘과 흥미로운 부드러운 고분자 재료를 설명하기 위해 모델 세포 재료로 널리 연구되고 있습니다. 이 방법에서는 형광 현미경 연구를 위해 정제된 단백질을 사용하여 in vitro 에서 액틴 기반 어셈블리를 만드는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 샘플 챔버에서 긴 액틴 필라멘트를 중합하고 폴리머 디플레턴트를 사용하여 필라멘트를 계면활성제 층으로 부동태화된 표면에 대해 2차원(2D) 얽힌 네트워크로 밀집시킵니다. 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP)이 있는 상태에서 골격근 미오신 II 필라멘트를 추가하면 액틴 네트워크의 수축이 유도됩니다. 액틴 필라멘트를 가교제(crosslinker)와 번들링함으로써 어셈블리의 수축성을 조정하여 좌굴되는 재료에서 미시적으로 미끄러지는 재료로 전환합니다. 캡핑 단백질이 있는 상태에서 액틴을 공중합하여 액틴 필라멘트의 길이를 줄임으로써, 우리는 물질을 2D 네트워크에서 액정으로 조정합니다. 분산된 짧은 액틴 필라멘트의 가교는 3차원(3D) 액정 액적을 형성합니다.

Introduction

활성 생물학적 물질은 세포 내 수송, 세포 이동, 세포 형태 조절 및 생물학적 힘 생성을 포함한 다양한 생리학적 과정에서 기계적 과정의 기초가 됩니다 ^1,2,3. 완충액에서 자체 조립된 정제 및 엔지니어링된 단백질 구성 요소로 구성된 세포골격 시스템의 시험관 내 어셈블리는 기본적인 생물물리학 및 생화학적 과정을 특성화하기 위한 확립된 도구입니다 4,5,6,7. 이러한 단순화된 모델 시스템을 통해 세포 환경의 복잡성 없이 단백질을 연구할 수 있으므로 개별 구성 요소의 역할을 식별할 수 있습니다. 기본적인 생물학적 연구를 지원하는 것 외에도 체외 세포골격 어셈블리는 액정 및 활성 또는 평형을 벗어난 물질 8,9,10,11,12,13,14,15 를 조사하기 위한 실험 시스템으로 널리 개발되고 있습니다.

Actin은 세포 골격 어셈블리의 핵심 바이오 폴리머로, 모터 및 중합 구동 힘을 통해 세포 역학 및 역학을 조절합니다 ^3,16. 형광 현미경 실험을 통해 단백질을 가교하여 모터 구동 수축 및 액틴 번들링과 같은 프로세스 중 액틴 네트워크 구조 변화를 시각화할 수 있습니다. 내장된 운동 단백질에 의해 리모델링되는 3차원 액틴 네트워크를 이미징하면 네트워크 수축 및 패턴 형성을 위한 액틴 교차결합제의 역할이 밝혀졌습니다 ^12,17,18,19. 그러나 준 2차원 액틴 네트워크는 네트워크 구조 변화를 포착하기에 충분한 시공간 해상도로 이미징의 문제를 극복합니다. 또한, 고밀도, 준-2차원 액틴 구조는 세포²⁰의 조밀한 액틴 피질(actin cortex)과 같은 세포 어셈블리(cellular assemblies)에 더 가깝게 모방된다. 준2차원 액틴 구조를 생성하기 위한 전략에는 커버슬립^21,22에 액틴 핵형성 단백질의 부착, 링커 분자 10,23,24를 통한 표면에 액틴의 결합, 커버슬립 표면^25,26에서 비드에 부착된 조밀한 액틴 다발의 형성, 분자 밀집제^{10을 사용하여 커버슬립 표면에서 액틴 필라멘트 농축 등이 있습니다,27}.

여기에서는 재현 가능한 모델 액틴 기반 어셈블리를 만드는 방법과 활성 네트워크에서 준 2D 액정 및 네마틱 액적에 대한 변형을 준비하기 위해 수정하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 이전에 유사한 방법을 사용하여 교차결합제 첨가¹¹을 통한 짧은 액틴 필라멘트의 상 분리된 액정 방울의 형성, 필라멘트 가교 결합 및 연결성²⁸을 통한 미오신 II 생성 액틴 네트워크 변형 모드(예: 필라멘트 좌굴 또는 상대 슬라이딩)의 변화, 다양한 간격 및 컴플라이언스를 가진 액틴 다발에 대한 미오신 II 생성 힘의 차이²⁹, 및 myosin II 수송³⁰. 가교 결합 단백질과 액틴 캡핑 단백질을 사용하면 액틴 필라멘트 길이와 조립 구조를 체계적으로 변경할 수 있습니다.

Protocol

참고: 단백질 및 라벨링: 이 프로토콜의 목적을 위해 연구자는 형광 현미경 검사에 적합할 때 형광 표지된 정제된 단백질의 재고로 시작하는 것으로 가정합니다. 이러한 단백질은 실험실 31,32,33,34,35,36,37에서 구매하거나 정제하고 형광 표지할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 액체 질소에서 동결되고 -80°C에서 보관된 단백질 스톡이 사용되었습니다. 단백질은 일반적으로 유사한 방법을 통해 표지할 수 있습니다. 단백질은 정제 단계로 또는 냉동 스톡에서 라벨링할 수 있습니다. 라벨링을 진행하기 전에 얼음 위에서 냉동 단백질 스톡을 해동합니다. 다음은 골격근 미오신 II(미오신 II)를 말레이미드 기능화 형광단(³⁸에서 수정)으로 형광 표지하는 방법입니다.

1. 형광 표지된 미오신 준비

1. 5-10 mg/mL 농도의 ~2 mL의 미오신 농도로 시작합니다.
   참고: 이 프로토콜에서는 발표된 방법³⁵ 을 사용하여 닭 근육에서 정제된 골격근 미오신 II가 사용되었습니다. 미오신 저장 완충액 (25 mM KPO₄, 0.6 M KCl, 10 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1 mM 디티오 트레이톨 (DTT), pH 6.6)은 정제 직후 또는 냉동 재고에서 저장된다. 운동 활동 상실을 방지하기 위해 미오신 농도를 항상 차갑게 유지하는 것이 중요합니다.
2. 해동된 미오신 용액에 DTT를 최종 농도 10mM까지 첨가합니다. 1M DTT 원액을 사용하여 부피를 제한하십시오.
   참고: DTT는 미오신 단백질의 시스테인에 있는 티올 그룹을 감소시켜 라벨링을 위해 말레이미드와 반응할 수 있도록 준비합니다.
3. 라벨링 반응에 대한 간섭을 방지하려면 4°C에서 50mM HEPES, 500mM KCl, 1mM EDTA, pH 7.6에서 밤새 투석하여 DTT를 제거합니다.
4. 투석 후 미오신 용액을 100,000 x g , 4°C에서 15분 동안 원심분리하여 응집체를 펠렛화합니다. 상층액을 수집합니다.
5. 분광 광도계를 사용하여 상등액의 미오신 농도를 결정합니다. 골격근 미오신³⁸에 대해 280nm에서 ~148,000 ^{M-1 cm-1}의 흡광 계수를 사용하여 미오신 농도를 추정합니다. 이 흡광 계수는 "단량체"가 하나의 중쇄, 하나의 필수 경쇄 및 하나의 조절 경쇄로 구성된다고 가정합니다.
6. 건조 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 분말 형광단을 5mM 형광단 농도로 재현탁하여 라벨링 반응을 위한 형광단을 준비합니다.
   참고: maleimide 반응성 그룹이 있는 모든 형광단이 작동해야 합니다. Alexa 647 maleimide가 사용되었습니다. DMSO는 흡습성이 있으며 물을 축적합니다. "건조한" DMSO는 수분 축적을 방지하기 위한 환경에 저장된 DMSO를 의미합니다. 용매가 건조한 DMSO인지 확인하기 위해 이 단계에 갓 개봉한 DMSO 앰플을 사용했습니다. DMSO 용액을 얼음 위에 올려 놓지 마십시오. DMSO의 융점은 19°C이므로 피펫³⁹에 대해 실온(또는 약간 더 따뜻함)이어야 합니다.
   주의: DMSO는 장갑을 관통할 수 있으므로 이중 니트릴 장갑을 착용하고 엎지르지 않도록 주의하는 것이 좋습니다.
7. 형광단을 추가하기 위해 미오신 용액을 준비하려면 얼음에서 미오신 용액을 잠시 꺼내 실온(RT)으로 데웁니다.
   참고: 미오신 RT를 필요 이상으로 오래 방치하지 마십시오. 형광단이 DMSO에 부유한 후 이 단계를 수행합니다.
8. 미오신 용액이 RT에 가까워지자마자 형광단 용액을 미오신 용액에 첨가하고 형광단 : 미오신 (myosin)의 5 : 1 몰 비율이 되도록 빠르게 혼합합니다. 미오신 용액이 형광단과 섞이자마자 얼음 위에 놓습니다.
9. 빛으로부터 보호되는 얼음에서 1시간 동안 배양한 다음 DTT를 1mM 농도로 첨가하여 반응을 중지합니다. 1M DTT 스톡을 사용하여 추가량을 최소화하십시오.
10. 미반응 형광단을 제거합니다. 아래에 설명된 두 가지 방법 중 하나를 사용합니다.
    1. 옵션 1:
       1. 미오신 (myosin)을 F- 완충액 (10 mM Imidazole, 50 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, 4 mM ATP, pH 7.5)으로 천천히 희석하여 중합시킵니다. 이는 1.8단계에서 첨가된 염료 부피에 따라 약 10배 희석됩니다.
       2. 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 8,000 x g 의 속도로 4°C의 냉장 원심분리기에서 10분 동안 펠릿으로 회전합니다.
       3. 유리 염료를 함유한 상등액을 버리고 Myosin 저장 버퍼로 myosin을 재현탁/해중합합니다(Step 1). 남아 있는 염료를 제거하려면 10kD 컷오프 투석 컵을 사용하여 5mM 2-[4-(2-sulfoethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (PIPES), 0.45 M KCl, pH 7.0(>100 fold volume 초과)에 각각 15분 동안 3회 투석합니다.
    2. 옵션 2:
       1. 컬럼 제조업체의 표준 프로토콜에 따라 5mM PIPES, 0.45M KCl, pH 7.0으로 완충액을 교환하기 위해 탈염 컬럼을 사용합니다.
11. 분광 광도계로 미오신 및 형광단의 농도를 측정하고 280nm에서 미오신 및 제조업체에서 보고한 형광단에 대한 흡광 계수를 사용하여 형광단 대 단백질 비율을 추정합니다. 2-4의 비율이 일반적입니다.
    참고: 라벨링된 myosin은 이제 액체 질소에서 분취액을 급속 동결할 준비가 되었습니다. 부분 표본은 장기 보관을 위해 -80 °C에서 보관됩니다.

2. 선택: 비활성 미오신 제거 절차

참고: 미오신 (Myosin)은 실험에서 해동 된 부분 표본에서 직접 사용할 수 있지만 미오신 (myosin)의 일부는 비활성화됩니다. 다음 절차에서는 비활성 미오신 제거 방법을 설명합니다. 이 단계는 선택 사항이지만 재현성에 매우 중요할 수 있습니다. 미오신 부분 표본은 해동 후 약 3일 동안 사용되며 4°C 또는 얼음에 보관합니다.

1. 표지되지 않은 팔로이딘 안정화 액틴을 중합합니다.
   1. 10μL의 10x F-버퍼, 1μL의 100mM ATP 및 ddH_2O를 혼합하여 마이크로 원심분리기 튜브에서 최종 부피(2.1.2단계의 액틴 포함)가 100μL가 되도록 합니다.
   2. 액틴 단량체를 최종 농도 20μM에 추가하고 피펫 혼합물을 혼합합니다.
   3. 액틴 필라멘트를 안정화하려면 메탄올 및 피펫 혼합물에 100μM 팔로이딘 스톡을 사용하여 팔로이딘을 최종 농도 6.7μM로 추가합니다.
      주의: 팔로이딘은 독소⁴⁰입니다. 유출 및 오염을 피하십시오.
   4. 액틴이 중합될 수 있도록 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 중합 후 향후 스핀다운을 위해 액틴을 4°C에서 보관하십시오.
2. 피펫은 10μL 팔로이딘 안정화 액틴, 3μL의 10x F-완충액, 0.3μL의 100mM ATP, 6μL의 2M KCl 및 ddH_2O를 30μL의 최종 부피(다음 단계에서 미오신 첨가와 관련된 부피 포함)로 얼음 위의 마이크로 원심분리기 튜브에서 혼합합니다.
3. 준비된 스톡에서 원하는 농도로 이량체 표지된 미오신 (dimeric labeled myosin)을 첨가하여 미오신 대 액틴 ≤ 1:6의 몰 비율을 유지합니다.
4. 생성된 용액을 100,000 x g 에서 30분 동안 저온(4°C)으로 원심분리합니다. 비활성 미오신 (myosin)은 액틴 필라멘트에 결합하고 결합 된 상태를 유지합니다. 비활성 myosin 및 actin 필라멘트는 원심분리 중에 펠릿을 형성합니다.
5. 상층액(활성 미오신 함유)을 제거하고 실험에 사용하기 위해 4°C에서 보관하십시오.
6. 라벨링 후 미오신 농도를 측정하기 위해 동일한 분광광도법(spectrophotometric method)을 사용하여 미오신 농도를 추정합니다.
   참고: 상등액에 남아 있는 단백질 및 ATP 농도에서 280nm 흡광도 피크는 260nm ATP 흡광도 피크에 의해 가려지므로 형광단 또는 상대 형광 측정과 관련된 흡광도를 통해 농도를 측정하는 것이 더 정확합니다.

3. 계면활성제 용액 준비

알림: 계면활성제 용액은 미리 혼합되어 바로 사용할 수 있도록 구입할 수도 있습니다.

1. 깨끗한 유리병으로 시작하십시오. 바이알을 물과 에탄올로 헹구어 계면활성제의 용제인 오일의 잠재적인 오염 물질을 제거합니다. 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)이 라이닝된 캡이 있는 붕규산 유리 바이알을 사용합니다.
2. 피펫 팁을 사용하여 5-20mg의 불소수면활성제를 집어 유리 바이알 바닥 근처에 침전합니다. 밀리그램 미만의 정확도로 저울을 사용하여 계면활성제의 양을 중량으로 측정합니다.
3. 적절한 양의 불소화유를 피펫으로 2 wt% 용액을 만들고 바이알을 닫습니다.
   알림: 오일은 휘발성이므로 측정 후 즉시 바이알을 닫으십시오.
4. 저속으로 소용돌이가 섞입니다.
   참고: 이제 용액을 4°C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다. 계면활성제의 연령과 품질은 액틴의 군집과 외관 모두에 영향을 미칠 수 있습니다. 액틴이 얼룩덜룩하게 나타나거나, 표면에 달라붙거나, 표면에 뭉치지 않는 것은 새로운 계면활성제 용액이 필요하다는 것을 나타낼 수 있습니다. 질소 가스로 보관하면 유통 기한을 향상시킬 수 있습니다.

4. 시료 챔버 준비(3가지 옵션)

참고: 이 섹션에서는 현미경 검사를 위한 샘플을 준비하는 데 사용되는 3개의 표준 샘플 챔버를 구성하는 절차를 제공합니다. 다음 두 섹션에서는 실제 시료 준비와 시료 로딩을 위한 시료 챔버 부동태화에 대해 다룹니다.

1. 옵션 1: 플로우셀
   참고: 간단한 플로우 셀(flow cell)은 많은 실험실에서 현미경 샘플을 만드는 표준 방법입니다. 이 프로토콜의 경우 에멀젼 방울로 둘러싸인 샘플에 특히 적합합니다. 이 프로토콜에 설명된 계면활성제 표면 코팅으로 크고 평평한 시야를 얻기 어려울 수 있으므로 2D 샘플의 경우 옵션 2와 3이 재현성이 더 높은 경우가 많습니다. 채널 형상은 또한 myosin과 같이 나중에 추가되는 구성 요소의 불균일한 혼합을 유발할 수 있습니다.
   1. 현미경 슬라이드의 너비를 가로질러 서로 평행한 양면 테이프 2개를 배치하여 플로우셀 채널의 경계를 형성합니다. 두 테이프 조각 사이에 형성된 채널의 너비는 약 2mm여야 합니다.
      참고: 채널이 작을수록 에멀젼이 채널의 시작 부분에 끼는 것을 방지할 수 있습니다. 좋은 밀봉을 만들려면 유리 슬라이드의 너비보다 긴 테이프 조각을 사용하고 플로우셀을 구성한 후 다듬습니다.
   2. 테이프 채널 위에 커버슬립을 놓습니다. 커버슬립이 현미경 슬라이드에 수직인지 확인하십시오. 슬라이드에 놓을 때 작은 돌출부를 제공하기 때문에 이를 위해 30mm x 40mm 커버슬립을 사용하십시오.
   3. 양호한 밀봉을 만들고 테이프와 커버슬립 사이의 공기 주머니를 제거하려면 양면 테이프와 접촉하는 커버슬립 부분을 아래로 누릅니다.
      알림: 가장자리를 누르는 동안 커버슬립이 파손되지 않도록 주의하십시오. 뚜껑이 있는 마커의 끝과 같은 둥근 물체로 해당 영역을 문지르면 테이프를 누르는 데 효과적입니다.
   4. 면도날을 사용하여 현미경 슬라이드와 커버슬립에서 여분의 테이프를 잘라내어 눈에 보이는 테이프만 s에 있도록 합니다.amp르 채널 내에.
      참고: 테이프를 제거하려고 할 때 실수로 커버슬립이 파손되기 쉬우므로 이 단계를 완료할 때 주의하십시오.
2. 옵션 2: 처리되지 않은 커버슬립의 실린더
   참고: 이 옵션은 2D 평면 샘플에 적합합니다. 현미경 실험 중 다른 시간에 구성 요소를 추가하는 데 편리합니다. 이 샘플 챔버는 침전물이 아닌 크림을 만드는 에멀젼에 사용되어서는 안 되어 이미징을 어렵게 만듭니다.
   1. 커버슬립과 유리 복제 실린더를 물, 에탄올, 물로 헹굽니다. 공기 건조.
   2. 5분 에폭시의 얇은 층을 사용하여 유리 복제 실린더를 커버슬립에 부착합니다.
      알림: 에폭시가 건조되는 동안 실린더 위에 깨끗한 물체를 올려 실린더에 힘을 가하는 것이 도움이 됩니다. 작은 페트리 접시 뚜껑이나 커버슬립 상자가 잘 작동할 수 있습니다.
3. 옵션 3: 실란 코팅된 커버슬립의 실린더
   참고: 이 옵션은 재현성 있게 챔버 중앙에 큰 평면 영역을 생성하고 샘플의 벌크 흐름을 줄입니다. 이를 달성하기 위해 커버슬립의 친수성 영역으로 둘러싸인 소수성 영역이 생성되었으며, 그 결과 액틴이 챔버 가장자리의 친수성 영역에 고정되는 부동태화되고 제한된 영역에 액틴 네트워크가 있는 최종 샘플이 생성되었습니다. 이 샘플 챔버는 완충액의 침전물이 아닌 크림화로 이미징을 어렵게 만드는 에멀젼에 사용되어서는 안 됩니다.
   1. 소수성을 만들기 위해 실란 코팅이 된 커버슬립을 준비합니다.
      1. 깨끗한 유리 커버슬립을 스테인리스 스틸 랙에 넣습니다. 원하는 경우 세제 또는 에탄올로 초음파 처리하여 유리를 사전 세척하십시오.
      2. 유리 염색 접시에서 트리메톡시(옥틸)실란을 이소프로판올의 2% 용액으로 희석합니다.
      3. 커버슬립을 용액에 10분 동안 담그십시오.
      4. 헹구려면 용액을 물로 교체하십시오. 커버슬립 랙을 들어 올렸다가 다시 담그십시오. 중간에 물을 교환하면서 이 과정을 4번 더 반복합니다.
      5. 랙을 알루미늄 호일로 덮어 커버슬립을 먼지로부터 보호하고 25-30°C에서 건조시킵니다.
   2. 옥틸 실란 처리된 커버슬립을 유리 페트리 접시 또는 자외선(UV)-오존 세척제에 들어갈 수 있는 기타 열린 유리 용기의 바닥에 놓습니다.
   3. 집게를 사용하여 2mm x 2mm PTFE 정사각형(시트에서 자른)을 커버슬립에 놓고 다음 UV 오존 처리를 위한 마스크 역할을 합니다.
   4. 커버슬립을 UV 오존으로 10분 동안 처리합니다. 이 과정은 PTFE 마스크로 덮이지 않는 노출 된 영역에서 유리를 친수성으로 만듭니다.
   5. 커버슬립이나 PTFE 사각형을 방해하지 않고 접시를 조심스럽게 제거하십시오. 5분 에폭시를 사용하여 유리 복제 실린더를 커버슬립에 부착합니다. 실린더가 PTFE 사각형을 둘러싸고 있는지 확인하고 에폭시가 건조된 후 집게로 제거할 수 있습니다.
      참고: PTFE 사각형은 향후 실험에서 재사용할 수 있습니다.

5. 액틴 네트워크 조립

참고: 다음은 50μL 시료 준비를 위한 것입니다. 실린더 샘플의 경우 부피가 크면 메니스커스의 영향을 줄이고 샘플 안정성을 높일 수 있습니다.

1. 마이크로 원심분리 튜브에 10x F 완충액 5μL, 최종 부피를 50μL로 만드는 데 필요한 ddH_2O, 25vol% 베타-메르캅토에탄올 1μL, 225mg/mL 포도당 1μL, 포도당 산화효소(135mg/mL) 및 카탈라아제(85,000단위/mL) 혼합물 1μL, 25mM ATP 1μL, 및 10 μL의 2 wt% 15 센티포이즈 메틸셀룰로오스. 피펫은 철저히 섞습니다.
   참고: 베타 메르캅토에탄올은 독소입니다. 유출 및 오염을 피하십시오. 포도당 산화효소, 카탈라아제, 포도당 및 베타-메르캅토에탄올 시약이 샘플에 있어 산소 제거 시스템을 생성합니다. 메틸 셀룰로오스 원액은 4 °C에서 교반하여 제조되며 4 °C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다. 메틸셀룰로오스는 용액에서 침전될 수 있으며 눈에 보이는 침전물이 있거나 액틴 밀집이 불량한 경우 다시 준비해야 합니다.
2. 선택 사항: 가교 단백질(1개의 액틴 단량체마다 0.1-1 가교 단백질)을 추가합니다. 피펫 믹스.
   참고: 가교 단백질은 액틴 중합 후에 첨가할 수도 있으며 미오신 첨가 전에 10-20분 동안 결합하도록 할 수 있습니다. 이는 액틴 필라멘트를 번들링할 수 있을 만큼 충분히 높은 가교제 농도에 바람직하며, 번들은 계면활성제-물 계면에서 더 균일하고 재현성 있게 분포합니다. 실린더 시료 챔버는 액틴이 중합된 후 가교제를 추가할 수 있습니다.
3. 원하는 경우 팔로이딘(1-3 액틴 단량체당 1 팔로이딘)을 추가합니다. 피펫 믹스.
4. 별도의 튜브에서 50μL 샘플에 액틴 혼합물을 모두 추가하면 총 농도가 2.64μM가 되도록 라벨링되지 않은 액틴과 라벨링된 액틴을 혼합합니다. 라벨링되지 않은 액틴 모노머 9개당 1개의 라벨링된 액틴 모노머의 비율을 사용합니다. 피펫 믹스.
   참고: 액틴 단량체는 샘플 용액에 첨가되면 중합되기 시작합니다. 표지된 액틴과 표지되지 않은 액틴을 별도로 추가하면 단일 필라멘트의 윤곽을 따라 어두운 영역과 형광 영역으로 얼룩진 액틴이 나타날 수 있습니다. 액틴 단량체 스톡은 균일하게 라벨링된 액틴 필라멘트를 보장하기 위해 혼합됩니다. 액틴 정제 및 라벨링은³¹에 설명되어 있습니다.
5. 선택 사항: 짧은 액틴 필라멘트를 사용하여 액정 또는 기타 실험을 하려면 5.4단계의 액틴 혼합물에 캡핑 단백질을 추가합니다. 캡핑 단백질의 정확한 양은 단백질의 활성 분율과 표적이 되는 액틴 필라멘트의 길이에 따라 다르지만, 일반적으로 약 1-10 mol%의 캡핑 단백질(액틴과 관련하여)은 액정 실험을 위한 짧은 필라멘트를 생성하기에 충분합니다. Capping 단백질 정제는³⁶에 설명되어 있습니다.
6. 액틴 중합을 시작하려면 액틴 혼합물을 F-버퍼 용액과 피펫 혼합물에 추가합니다.
7. RT에서 마이크로 원심분리 튜브에서 액틴이 중합되도록 방치한 다음 10-30분 후에 샘플 셀에 추가합니다.
8. 선택 사항: 실린더 샘플을 준비하는 경우, 실린더 샘플 챔버 로딩의 7.4단계에서 파이펫을 준비할 수 있도록 전체 용액을 피펫 팁으로 끌어옵니다.

6. 선택 사항: 에멀젼 준비

참고: 이러한 샘플을 제한된 샘플 챔버를 제공하는 에멀젼으로 준비하는 것이 때때로 편리합니다. 에멀젼은 Chowdhury 등과 유사한 시약을 사용하여 제조되며, 이는 계면활성제-매개 수성 에멀젼 방울⁴¹을 갖는 오일 연속 상을 초래합니다. 이 프로토콜에 사용되는 메틸셀룰로오스와 같은 고갈제가 있는 경우 액틴 샘플은 이 에멀젼의 수성 계면으로 밀집됩니다. 이 프로토콜의 기반이 되는 샘플의 경우, 액틴을 에멀젼에 첨가하기 전과 후에 액틴을 중합하는 것의 차이는 나타나지 않습니다. 그러나, 중합 단계는 일부 캡슐화 실험(⁴²)에서 고려하는 것이 중요하다는 것이 보고되었다.

1. 3.5μL의 오일 계면활성제를 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다. 이 단계에서는 투명하거나 밝은 색 또는 투명한 마이크로 원심분리기 튜브를 사용합니다.
2. 혼합하지 않고 액틴 용액 5μL를 오일-계면활성제 층의 상단에 추가합니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 닫습니다.
3. 마이크로 원심분리기 튜브의 상단을 잡고 튜브의 하단 가장자리를 튕기면 처음에는 에멀젼이 보이는 거품이 생성됩니다. 거품이 역광을 받았을 때 눈에 띄는 특징이 없어 마이크로에멀젼을 나타낼 때까지 튜브를 계속 튕깁니다.
   참고: 에멀젼에서 샘플을 준비할 때 액틴 샘플을 만들기 전에 플로우 셀 또는 기타 샘플 챔버를 준비해야 합니다. 유리 실린더 샘플 챔버는 커버 글라스 표면에 침전물이 아닌 공기 계면으로 크림화되기 때문에 에멀젼에 잘 작동하지 않습니다.

7. 샘플 챔버 (실린더 챔버)를 적재합니다.

1. 5 μL의 오일 계면활성제 용액을 유리 실린더 챔버 바닥에 피펫 주입
   참고: 대안적으로, 지지되는 지질 이중층 ^11,29,30으로 표면을 부동태화하여 샘플을 만들 수 있습니다.
2. 커버슬립을 기울이고 천천히 회전하여 커버슬립 표면과 하부 실린더가 계면활성제 용액으로 코팅되도록 합니다.
3. 피펫으로 과도한 유성 계면활성제 용액을 제거하여 휘발성 오일이 완전히 증발하지 않도록 하면서 오일 층을 최대한 얇게 만듭니다.
4. 5.7단계의 샘플 용액을 챔버에 즉시 추가합니다.
5. 증발과 흐름을 방지하기 위해 작은 PTFE 테이프 조각으로 챔버를 덮습니다.

8. 대체: 시료 챔버(플로우 셀)를 로드합니다.

1. 플로우 셀(flow cell)을 로드하기 위해 소량의 5분 에폭시를 혼합합니다. 일반적으로 0.5cm2 미만의 면적을 떨어뜨리면 충분합니다.
2. flow cell에 시료를 배치하려면 먼저 1-3μL의 오일-계면활성제 용액을 flow cell의 시료 채널에 피펫팅하여 채널을 적시는 작은 용액 플러그를 만듭니다.
3. 즉시 일정한 양의 샘플 용액 또는 에멀젼 현탁액을 플로우 셀(flow cell) 입구로 천천히 피펫팅하여 채널을 채웁니다. 일반적으로 약 2mm인 채널의 경우 부피는 약 8μL입니다. 입구는 오일-계면활성제 용액이 첨가된 쪽입니다.
   1. 시료 부피가 플로우셀(flowcell) 부피를 초과하는 경우, 채널의 다른 쪽 끝에 보푸라기가 없는 와이프 또는 여과지를 놓아 플로우셀을 통해 시료를 심지합니다.
   2. 오일 계면활성제 용액의 메니스커스가 후퇴하여 에어 갭이 발생한 경우, 샘플을 추가하기 전에 먼저 플로우셀을 기울여 입구의 에어 갭을 제거합니다.
4. 필요한 경우 채널에서 공기가 더 이상 보이지 않을 때까지 추가 오일 계면활성제 용액을 추가하거나 샘플(특히 에멀젼의 경우)을 채널로 더 밀어 넣습니다.
5. 채널의 각 측면을 5분 에폭시로 밀봉합니다(플로우 셀(flow cell)을 로드하기 직전에 혼합).

9. 이미지 및 미오신 추가

1. 현미경에 샘플을 장착하고 고해상도 이미징을 위한 충분한 개구수를 제공하기 위해 오일 또는 물에 담근 20x, 40x, 60x 또는 100x 대물렌즈를 사용하여 actin의 타임랩스 이미징을 시작합니다. 샘플 챔버에서 중합하는 경우 ~30분 동안 또는 더 이상 필라멘트 연장이나 움직임이 보이지 않을 때까지 중합을 허용합니다.
2. 선택 사항: 교차결합제를 추가합니다.
3. 아래 옵션 1 또는 2를 통해 myosin을 추가합니다.
   1. 샘플 상단에 피펫으로 myosin을 추가합니다(myosin dimer가 확산되므로 혼합이 필요하지 않음).
   2. 미오신 (myosin)을 사전 중합 된 필라멘트로 첨가하십시오. 피펫은 붐비는 액틴을 방해하지 않도록 전체 부피의 약 절반을 매우 천천히 혼합합니다.
      참고: 커버슬립 표면에서 원하는 필라멘트 밀도 또는 크기를 얻기 위한 미오신 추가에 대한 이상적인 방법은 액틴 아키텍처에 따라 다를 수 있으며 실험적으로 결정해야 합니다.
4. 타임랩스 이미징을 시작합니다.

Results

이러한 방법에 설명된 일반적인 전략에 따라 정제된 단백질을 사용하여 모델 시스템에서 광범위한 액틴 어셈블리를 형성할 수 있으며, 여기서 액틴은 어셈블리 아키텍처를 수정하는 부속 단백질이 있는 상태에서 필라멘트로 중합됩니다(그림 1). 액틴이 교차결합제(crosslinker) 또는 캡핑(capping) 단백질 없이 필라멘트로 중합되면 얽힌 필라멘트 네트워크를 형성합니다(그림 1A). 얽힌 네트워크에 가교제를 추가하면 준 2D 네트워크 또는 번들 네트워크가 형성됩니다(그림 1B, C). 네트워크 또는 다발 네트워크가 형성되는지 여부는 액틴 네트워크에 추가된 가교제의 유형과 양에 따라 다릅니다(예: α-액티닌은 낮은 농도에서 네트워크를 형성하고 더 높은 농도에서 다발 네트워크를 형성합니다). 액틴이 중합되는 동안 가교제를 추가할 수도 있지만, 이...

Discussion

재현 가능한 액틴 어셈블리를 생산하기 위해서는 많은 고려 사항이 있습니다. 재현 가능하고 분석 가능한 데이터를 생성하는 데 가장 중요한 것 중 하나는 시료 챔버의 커버 글래스 표면입니다. 체외 액틴 샘플의 단백질, 특히 미오신 단백질은 매우 끈적거리며 처리되지 않았거나 제대로 처리되지 않은 유리 표면에 달라붙어 샘플을 사용할 수 없게 만듭니다(그림 5A). 우리는 오일 계면활성제 층이 있는 실란화된 커버슬립을 부동태화하여 재현 가능한 샘플을 생성하기 위해 표면을 준비하는 표준 방법에 대해 논의했습니다. 그러나 이 샘플 준비는 사용 가능한 리소스에 따라 몇 가지 변형이 있습니다. 샘플은 UV/오존 처리 없이 실란화된 커버슬립 또는 오일 계면활성제 층이 있는 일반 유리 커버슬립에서 만들 수 있습니다(샘플 셀 옵션 #2). 이러한 방법은 전처리가 더 간단하지만 샘플의 오일 표면이 고르지 않을 수 있으므로(...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL 미세 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	05-408-123
008-플루오로계면활성제	RAN Biotechnologies	00115081361-6525
RAN Biotechnologies	008-플루오로계면활	성제의 대체 008-플루오로계면활성제-2wtH-50G	미리 혼합된 용액
2-메르캅토에탄올(&베타;-메르캅토에탄올)	시그마 알드리치	63689	CAS 번호: 60-24-2 원액: MilliQ 물에 25mM, 4°C에서 보관; C
4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄-설폰산(HEPES)	시그마 알드리치	H3375	CAS 번호: 7365-45-9
5분 에폭시	Devcon	14250
액틴	세포골격, Inc.	AKL99-A	>99% 순수 토끼 골격근 (정제 대체)
액틴(로다민 표지)	Cytoskeleton, Inc.	AR05-A	토끼 골격근 (정제 대체)
아데노신 5&프라임;-삼인산염(ATP)	시그마 알드리치	A6419	CAS 번호: 34369-07-8 원액: MilliQ 물에 25mM, -20 &g에서 보관; C 가수분해를 피하기 위해 냉동 보관 염
칼슘(CaCl2)	Sigma Aldrich	C5670	CAS 번호: 10043-52-4
캡핑 단백질(마우스)			HisTag 로 대장균에서 과발현으로부터 정제됨 원액: -80 &g에서 캡핑 단백질 완충액에 20mM;
소 간에서 추출한 C 카탈라아제	Sigma Aldrich	C9322	CAS 번호: 9001-05-2 원액: 85 ku/mL, 포도당 산화효소와 함께 -20°에서 분취하여 보관; C
커버 유리	Fisherbrand	12544C	붕규산염, #1.5, 24mm x 40mm Fisherbrand가 아닌 Fisher Finest
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G8270	CAS 번호: 50-99-7 원액: MilliQ 물에서 225mg/mL, -20 °에서 보관; C
디티오스레이톨(DTT)	시그마 알드리치	3860-OP	CAS 번호: 3483-12-3 원액: MilliQ 물에 1M, -20 &g에서 보관; C
양면 테이프	3M	3136
에틸 알코홀 200 증거	PHARMCO	111000200	CAS 번호: 64-17-5 200 증거
에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N&프라임;,N&프라임;-테트라아세트산(EGTA)	시그마 알드리치	E3889	CAS 번호: 67-42-5
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	시그마 알드리치	E9884	CAS 번호: 60-00-4
포도당 산화효소	시그마 알드리치	345386	CAS 번호: 9001-37-0 원액: MilliQ 물에 135mg/mL, -20 &g에서 카탈라아제와 함께 분취하여 보관; C
글리세롤	시그마 알드리치	356352M	CAS 번호: 56-81-5
이미다졸	피셔 생물 시약	BP305-50	CAS 번호: 288-32-4
염화마그네슘(MgCl2)	Fisher Bioreagents	BP214	CAS 번호: 7786-30-3, 7791-18-6
메틸셀룰로오스	시그마 알드리치	M0512	CAS 번호: 9004-67-5 15센티푸아즈
현미경 슬라이드 일반	전자 현미경 과학/골드 씰	63710-05&	nbsp; 3"x1", 1mm 두께
MilliQ 물	Millipore	CUFBI001	초순수
Novec-7500 Engineered Fluid	3M	7100134816	미리 혼합된 용액에 대체
화칼륨(KCl)	Sigma Aldrich	P3911	CAS 번호: 7447-40-7
인산칼륨(KPO4)	Sigma Aldrich	P3786	CAS 번호: 7758-11-4
토끼 골격근 아세톤 분말	Pel-Freez Biologicals	41995-1	액틴을 정제할 때 사용(구매 대신) -80 °에서 액틴 완충액 G에 약 30mM를 보관합니다. C
아지드화 나트륨	시그마 알드리치	71289	CAS 번호: 26626-22-8
테트라메틸로다민-C6-말레이미드	AnaSpec	AS-81445	CAS 번호: 174568-68-4 액틴을 정제할 때 사용(구매 대신) 액틴 완충액 G에 약 30mM을 -80 °C에서 보관합니다. 액틴 라벨링할 때 사용(구매 대신)
트리스 염산(Tris HCl)	시그마 알드리치	648317	CAS 번호: 1185-53-1
초음파 목욕	에머슨 브랜슨	CPX2800H