신경퇴행성 질환의 전임상 모델에서 관절 운동학을 연구하기 위한 소근육 운동 과제

요약

현재 연구는 기계 학습을 사용하여 TgF344-AD 쥐를 포함한 설치류 모델의 운동 결함을 검사하기 위한 미세 운동 행동 테스트를 설명합니다.

초록

운동 기능 장애는 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD) 및 관련 치매와 같은 신경 퇴행성 질환의 중요한 구성 요소이지만 종종 과소 평가됩니다. 새로운 연구에 따르면 인간의 소근육 운동 행동, 시공간 능력 및 실행 기능과 관련된 작업이 질병을 조기에 발견하는 데 잠재력이 있을 수 있습니다. 그러나 이러한 작업이 AD와 관련된 인지 및 기능 저하를 예측하는 정확한 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 현재 방법에서는 무료 오픈 소스 머신 러닝 소프트웨어를 사용하여 다른 신경퇴행성 질환 및 정상 노화와 비교하여 AD의 전임상 모델에서 질병 진행에 따른 운동 능력의 변화를 조사하기 위해 소근육 운동 과제인 KINEMAT(Kinematic Motor Ability Task)가 만들어졌습니다. 여기서, 개념 증명은 Harmaline 유발 운동 장애가 있거나 없는 Fisher 344 CDF 쥐에 대한 파일럿 연구에서 미세 운동 과제의 설계, 테스트 및 구현과 함께 확립되었습니다. 알츠하이머병 쥐 모델(TgF344-AD)을 사용한 추가 검증을 통해 모델 타당성과 작업 민감도를 추가로 입증했습니다. 쥐들은 방 앞쪽에 있는 작은 구멍을 통해 손을 뻗어 다양한 난이도의 세 그릇 중 하나에서 설탕 알갱이를 꺼내도록 훈련되었습니다. 펠릿 회수는 성공(설탕 펠릿을 성공적으로 잡아 먹는 것), 드롭(잡는 즉시 간식을 잡는 것) 또는 실패(펠릿을 조달하지 못하거나 잡으려고 할 때 펠릿이 그릇에서 떨어짐)의 세 가지 분류 중 하나를 사용하여 점수가 매겨졌습니다. 대조군과 Harmaline 처리한 쥐 사이에서 운동 능력의 유의미한 차이가 관찰되었으며, 이는 총 도달 범위가 감소하고 발 자세 변동성이 증가한 것으로 입증되었습니다. TgF344-AD 쥐는 또한 모든 보울에서 총 도달 범위가 감소하고 성공률이 감소한 것으로 나타났습니다. 이를 설치류의 소근육 운동 과제로 검증함으로써 시간이 지남에 따라 병리학 및 증상이 나타남에 따라 AD를 포함한 신경퇴행성 질환의 정상적인 노화 및 전임상 모델을 연구할 수 있는 향후 잠재력이 있습니다.

서론

알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD) 또는 다른 하위 유형(예: 루이소체(Lewy bodies)을 동반한 치매)로 인해 치매 환자의 운동 기능이 손상된 것으로 나타났습니다. 악력과 보행 속도는 인지 장애가 있는 노인과 그렇지 않은 노인을 구별할 수 있지만^{, 1,2} 치매의 다른 하위 유형(즉, 낮은 특이^성)을 반드시 구별할 수는 없습니다^1,2. 따라서 행동과 질병 상태 간의 복잡한 패턴과 관계를 평가하기 위해 기계 학습과 짝을 이룰 수 있는 초기 치매에 대한 새로운 진단 도구가 계속 필요합니다 ^3,4. 동물 모델은 신경퇴행성 질환의 진행을 조사하여 조기 질병 발병, 행동 상관 관계에 대한 통찰력을 제공하고 기계 학습을 분석 파이프라인에 통합하여 중증도와 증상을 구별하는 데 유용합니다 ^5,6,7.

인간의 새로운 행동 방법은 시공간 능력 및 실행 기능과 같은 인지 처리와 함께 소근육 운동 기술을 포함하는 작업을 식별했습니다 ^8,9,10. 예를 들어, 기능적 상지 작업은 신경 퇴행 패턴을 추적하고 경도 인지 장애(MCI)와 AD를 구별할 수 있습니다. 이 작업에서 인간은 숟가락을 사용하여 생 강낭콩(한 번에 두 개)을 중앙 가정용 컵에서 대상 컵으로 이동합니다. 숟가락으로 콩을 얻는 과제 단계는 콩이 목표 컵으로 운반되는 단계보다 인지(특히 시공간 기억)와 더 강한 연관성을 보여줍니다^11,12. 숟가락이 컵에 들어갈 때 컵 안의 콩을 흔들 수 있으며, 이는 참가자의 움직임이 작업을 더 어렵게 만들 수 있음을 의미합니다. 또한, 임상시험이 진행되고 가정용 컵에 담긴 콩의 수가 줄어들면 작업이 더 어려워집니다(즉, 숟가락으로 콩을 얻는 시간이 늘어남)¹³. 이 작업은 AD 특이적 병리학(아밀로이드)^9,14 및 신경퇴행(해마 위축)^10,15과 상관관계가 있는 것으로 나타났으며^, 이는 그 성과가 질병 진행 초기에 영향을 받는 신경 회로와 행동 과정에 따라 달라질 수 있음을 시사합니다. 운동의 시작, 계획, 실행 및 교정은 대뇌 피질에 위치한 상부 운동 뉴런의 세포체가 척수의 하부 운동 뉴런에서 시냅스를 이루는 운동 피질을 포함하여 뇌를 가로지르는 다양한 네트워크에 의해 제어되는 것으로 알려져 있습니다¹⁶. 이 하부 운동 뉴런은 근육과 직접 소통하여 신경근 접합부에서 움직임을 제어합니다. 상행관(ascending tract)은 주변부에서 척수(spinal cord)로 감각 정보를 전달하는 반면, 뇌 내의 하행관(descending tract)은 근육으로 돌아가는 방법과 위치에 대한 방향 정보를 전달합니다^17,18. 특히 3xTg-AD 마우스 및 TgF344-AD 랫트를 포함한 유전 동물 모델은 이전에 AD 유전자가 운동, 조정 및 기타 운동 장애에 미치는 영향을 연구하는 데 사용되었기 때문에 이러한 경로가 AD 병리학에 의해 어떻게 선택적으로 영향을 받는지 이해하는 것이 질병 진행을 이해하는 데 중요합니다 ^19,20,21. 일반적으로 이러한 작업은 전신 운동과 관련된 대근육 운동 장애에 초점을 맞추지만, 인간의 운동 결핍은 훨씬 더 다양하여 설치류에서 식별하기 어려울 수 있습니다²². 따라서 이러한 가변성을 포착하기 위해 인간과 동물 모델 간의 격차를 해소하기 위한 새로운 작업이 필요합니다.

운동 장애와 떨림과 일반적으로 관련이 있는 뇌 영역 중 하나는 소뇌²³입니다. 소뇌는 정확하고 조정된 움직임을 조절하는 중요한 조절자이며, 이러한 자발적인 움직임을 교정하고 적응하기 위해 하행 경로를 통해 피드백을 제공하는 감각 정보의 처리자 역할을 합니다^24,25. 소뇌 위축은 알츠하이머병 환자에게서 인정되어 왔지만, 해마와 같은 다른 영역과는 달리 소뇌의 아밀로이드 침착 증가는 위축 증가와 상관관계가 없다는 점에 유의하는 것이 중요하다²⁶. 알츠하이머병 병리학의 진행은 소뇌에서 다르지만, 소뇌와 해마 사이에는 AD ^27,28,29에서 중단될 가능성이 있는 다중 시냅스 양방향 연결이 있습니다. 특히, 소뇌와 해마 사이에는 기능적 연관성이 있는데, 소뇌 종양 절제술 후 기억력 결핍이 발생하는 것으로 기록되어 있습니다 30,31,32,33,34,35,36,37. 설치류의 경우, 해마 장소 세포는 소뇌 섭동(cerebellar perturbation)으로 파괴된다³⁸. 이러한 기억력, 사교성, 운동 조절 능력의 중복적 결핍은 인지 기능 저하 전에 발생하는 운동 경로의 잠재적인 조기 변화를 발견하는 것이 중요하다는 점을 강조한다 30,31,38,39. 초기 알츠하이머병 연구에서 소근육 운동 과제를 구현함으로써, 우리는 알츠하이머병에 대한 전통적인 이해를 단순히 인지 장애로 재구성하기 시작할 수 있으며, 질병 진행을 예측할 수 있고 인지 장애가 있는 사람과 그렇지 않은 고령화를 더 크게 구별할 수 있는 조기 운동 변화로 진단 노력을 돌릴 수 있습니다.

미세한 운동 행동이 뇌 구조의 변화를 어떻게 나타낼 수 있는지 이해하기 위해 위에서 설명한 인간 작업의 설치류 버전을 만들고 테스트했습니다. 이 설치류 작업은 KINEMAT (KINEmatic Motor Ability Task)로 명명되었으며, 받침대나 계단에서 단일 펠릿을 회수해야 하는 이전 도달 작업과 작업의 모든 단계에서 일관된 펠릿 배치의 결과로 보다 단순한 채점 작업에서 벗어납니다 40,41,42,43,44,45,46^{, 47,48}쪽. 이 미세한 모터 도달 작업에는 새로운 채점 방법, 다양한 난이도의 볼, 인간을 모방하기 위한 자체 교란 기능이 포함되며, 펠릿 이동 및 후속 참가자 전략 조정이 설계의 핵심입니다. 이 작업은 기계 학습 도구인 Social LEAP Estimates Animal Poses(SLEAP) 및 키포인트-MoSeq^49,50을 사용하여 소근육 운동 능력과 도달 행동에 대한 편견 없고 정량적인 측정을 가능하게 합니다. 설치류의 숙련된 도달 작업을 위해 다른 주목할만한 계산 모델이 개발되었지만, 44,45,51, keypoint-MoSeq는 움직임을 정확하게 정량화하고 자세를 잡는 ⁵⁰을 가능하게 하기 위해 노이즈를 제거합니다. 작업 수행 및 운동 학습 전략은 Harmaline⁵²를 사용하여 일반 및 모터 교란 쥐에서 고성능 머신 비전 카메라를 사용하여 재구성되었습니다. 하마린(Harmaline)은 하부 감람핵(inferor olivary nucleus)을 과활성화하고 글루타메이터성 등반 섬유(glutamatergic climbing fibers)를 통해 소뇌 기능을 방해한다^53,54. 또한, TgF344-AD 랫트의 하위 집합에서 소근육 운동 능력을 조사했습니다. 따라서, 소근육 운동 과제는 개념 증명으로서 Harmaline 처리 및 TgF344-AD 쥐에서 일반적인 쥐와 비교하여 측정 가능한 손상을 찾을 수 있을 것으로 예상되었습니다. 이 프로토콜은 미세 운동 작업을 구성하고, 동물을 훈련 및 테스트하고, SLEAP 및 keypoint-MoSeq를 사용하여 도달 행동을 정량화하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 애리조나 주립 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 챔버의 설계 및 시공

1. 투명한 아크릴 패널을 준비합니다. 상자의 회로도는 https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask 에 있습니다. 투명 아크릴 패널을 다음 치수로 자릅니다(모든 패널의 두께는 1cm).
   1. 두 개의 측면 패널을 잘라냅니다 : 26cm × 22cm.
   2. 상단 패널 잘라내기: 27cm × 12cm.
   3. 첫 번째 바닥 패널 잘라 내기: 26cm x 10cm
   4. 두 번째 바닥 패널 잘라내기: 26cm x 11cm
   5. 전면 패널 컷: 20cm × 11cm.
   6. 뒷 부분을 잘라 : 20cm×12cm
   7. 전면 패널 슬롯(140mm x 12mm)을 잘라냅니다. 아래쪽 가장자리가 패널 아래쪽과 정렬되도록 슬롯을 중앙에 배치합니다.
   8. 내부 홈을 잘라냅니다 : 1cm. 측면 패널의 내부 가장자리에 움푹 들어간 곳이나 홈을 만들어 전면 패널이 안전하게 안팎으로 미끄러질 수 있도록 합니다.
      알림: 슬라이딩 기능이 필요하지 않은 경우 전면 패널을 영구적으로 접착하여 시공을 단순화할 수 있습니다.
   9. 두 번째 하단 패널에 균일한 간격의 구멍(직경 5mm)을 뚫어 떨어뜨렸을 때 펠릿이 떨어질 수 있도록 합니다. 구멍을 격자 패턴으로 1cm 간격으로 간격을 둡니다.
2. 접착제로 챔버를 조립합니다(그림 1A).
   알림: 아크릴 재료용으로 명시적으로 설계된 강력하고 투명한 접착제를 사용하십시오.
   1. 측면 패널: 하단 패널의 가장자리를 따라 연속적인 접착제 선을 적용합니다. 측면 패널을 수직으로 배치하고 단단히 누릅니다. 제조 지침에 따라 접착제가 경화되도록 합니다.
   2. 후면 패널: 측면 및 하단 패널의 뒤쪽 가장자리에 접착제를 바릅니다. 후면 패널을 배치하고 제자리에 밀어 넣습니다.
   3. 상단 패널: 측면 및 후면 패널의 상단 가장자리에 접착제를 바릅니다. 상단 패널을 배치하고 단단히 누릅니다.
   4. 전면 패널: 전면 패널을 측면 패널의 홈에 조심스럽게 밀어 넣어 꼭 맞지만 매끄럽게 맞도록 하거나 전면 패널의 가장자리를 따라 접착제를 바르고 측면, 상단 및 하단 패널에 고정합니다.
      1. 패널의 움직임을 테스트하고 챔버의 나머지 부분과 정확하게 정렬되는지 확인합니다.
3. 설정 조명
   1. 적외선(IR) 조명을 테스트 챔버의 반대쪽 끝에 놓고 챔버를 향하도록 합니다. 챔버 위에 흰색 공사용 종이 한 장을 올려 빛을 반사합니다.
      참고: 조명은 적절한 추적을 위해 매우 중요하며 모든 녹음은 어두운 방의 IR 조명 아래에서 이루어져야 합니다.
4. 트레이닝 볼을 준비합니다.
   1. 3D 프린터를 사용하여 반경 31mm, 확장 32mm의 트레이닝 볼을 제작합니다. https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask 에서 사용 가능한 STL 파일(그림 1B: 상단)
   2. 트레이닝 볼을 슬롯 바로 앞의 챔버 바닥에 부착합니다. 나무 블록과 같은 지지 스탠드를 사용하여 그릇의 상단 가장자리가 챔버 내의 쥐의 눈높이보다 대략 위에 오도록 그릇을 배치합니다.
5. 테스트 그릇을 준비합니다(그림 1B: 중간 및 하단).
   1. 제공된 STL 파일을 사용하여 그릇을 인쇄합니다. 두 가지 뚜렷한 그릇 디자인이 제공됩니다: "Plain-Less"와 "Plinko". (https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask)
      1. 치수 정확도 및 내구성을 검사합니다(치수: 깊이 50mm x 너비 40mm).

2. 컴퓨터 및 카메라 하드웨어

1. 삼각대를 사용하여 카메라를 단단히 장착하십시오.
2. 챔버의 전면 패널에서 약 15-20cm 떨어진 곳에 카메라를 배치합니다.
   1. 삼각대 높이와 각도를 조정하여 카메라가 슬롯과 보울의 등각 투영 45° 뷰를 캡처하도록 합니다.
      알림: 카메라의 시야가 쥐 발과 완전한 도달 거리, 슬롯, 훈련 또는 테스트 그릇을 포함하는지 확인하십시오. 최적의 가시성을 얻기 위해 필요한 경우 다양한 각도와 거리를 테스트합니다.
3. 행동 기록(https://www.teledynevisionsolutions.com/products/spinnaker-sdk)을 위해 카메라와 페어링하는 소프트웨어를 다운로드하고 소프트웨어를 열어 카메라를 사용하여 행동을 기록합니다.
   1. 다음 카메라 설정을 사용합니다: 획득 모드: 연속, 프레임 속도: 216Hz, 노출 모드: 시간 지정, 자동 노출: 꺼짐, 노출 시간: 4430μs, 게인 자동: 꺼짐, 게인: 16.85dB, 감마: 0.8.
   2. 녹음 설정은 H264 파일 형식, 500만(5,000,000) 비트 전송률입니다.
   3. 10분 동안 녹화하려면 130,000프레임을 입력하고 스트리밍 모드를 사용하여 저장합니다.
      참고: 데이터 저장을 위해 최소 16GB RAM과 1TB 내부 솔리드 스테이트 하드 드라이브가 있는 전용 컴퓨터를 사용하는 것이 좋습니다.

그림 1: 미세 운동 작업의 개략도. (A) 쥐가 설탕 알갱이를 얻기 위해 슬롯을 통해 손을 뻗는 미세 운동 작업에 대한 만화 표현. 도달 범위는 기계 학습 분석을 위해 기록됩니다. 세 개의 개별 그릇이 사용됩니다: (왼쪽 아래) 트레이닝 볼, (가운데 아래) Plain/Less 볼, (오른쪽 아래) 장애물이 빨간색으로 표시된 Plinko 볼. (B) (위) 트레이닝 보울, (가운데) Plain/Less 보울 및 (아래) Plinko 보울을 포함한 각 보울 설계도의 개식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 동물 준비

1. 동물이 가장 활동적일 때 테스트할 수 있도록 Fisher 344 CDF 쥐(수컷 및 암컷, >3개월)를 역으로 밝음/어둡게 주기로 짝을 지어 수용합니다.
2. 습관화가 시작되기 1주일 전에 모든 설치류의 무게를 측정하고 무게가 300g 이상인 설치류의 경우 ~30g, 설치류의 경우 ~15g의 음식을 제공하여 동물의 체중을 90%의 체중으로 유지하기 위해 100-300g을 제공합니다.
   1. 매일 쥐의 무게를 측정하고 그에 따라 음식을 조정하여 설치류가 체중의 1%에 도달할 때까지 하루에 2-90g씩 제공되는 음식의 양을 줄입니다. 매일 다루면 실험자가 동물을 습관화하는 데 도움이 될 것입니다.
   2. 습관화 및 테스트 전반에 걸쳐 이 절차를 계속하여 체중이 임계값 이하로 떨어지거나 초과할 때 음식을 +/- 0.5g씩 조정합니다.
   3. 실험하는 동안, 과제를 시작하기 전에 동물의 무게를 측정하고, 임무 완료 후 우리로 돌아오는 즉시 할당된 음식을 제공하십시오.
      참고: 1-2일에 걸쳐 갑작스러운 체중 감소(>15%)는 근본적인 문제의 신호일 수 있으므로 수의사와 상담해야 합니다.

4. 습관화 (2일)

1. IR 조명, 카메라 및 컴퓨터를 켭니다.
2. 펠릿이 든 훈련 용기를 개구부 슬롯에 놓고 그릇의 끝이 장치 안으로 약간 확장되도록합니다 (처음에는 약 2cm).
3. 케이지를 실험실로 옮기고 쥐가 5분 동안 적응할 수 있도록 합니다.
4. 1일차: 한 쌍의 쥐를 방에 추가하고 20분 동안 탐험하게 합니다. 실험 후 3-5 개의 설탕 알갱이를 가정용 케이지에 넣어 쥐가 알갱이에 익숙해 질 수 있도록합니다.
   참고: 45mg의 펠릿 크기로 단일 펠릿 회수가 가능합니다.
5. 쥐 사이에 소독용 물티슈로 챔버를 청소하십시오. 하루가 끝나면 에탄올을 뿌려 소독하십시오.
6. 2일차: 동일한 절차(20분)를 사용하여 설치류를 장치에 개별적으로 습관화합니다. 설치류가 겁을 먹거나 기구와 그릇 앞쪽을 피하는 경우 이 행동이 해결될 때까지 계속 습관화하십시오. 가정용 케이지에서 펠릿을 간식으로 계속 제공하십시오(3-5펠릿).
   1. 그릇에 대한 친숙함과 접근을 장려하려면 길쭉한 튜브를 습관화 전반에 걸쳐 점진적으로 장치 셔터 안으로 더 멀리 이동시키고 팁을 한 번에 0.5cm 더 설치류에 더 가깝게 이동하여 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.
      참고: 습관화, 테스트 및 교육은 모두 새로운 주변 환경의 영향을 제거하기 위해 적색 조명 아래에서 동일한 위치에서 수행해야 합니다.

5. 형성 (10 일)

1. IR 조명, 카메라 및 컴퓨터를 켭니다.
2. 케이지를 방으로 옮기고 쥐가 5분 동안 적응할 수 있도록 합니다.
3. 트레이닝 볼을 사용하여 익스텐션을 따라 1-5개의 펠릿을 제공하고 첫날에는 익스텐션을 장치 내부에 완전히 넣습니다. 10분 세션으로 동물을 훈련시킵니다. 성형 중 녹음은 선택 사항입니다.
   알림: 설치류가 펠릿에 익숙해지도록 하려면 그릇의 펠릿에 대한 혐오감을 줄이기 위해 장치 자체 내에 몇 개의 설탕 펠릿을 제공하는 것이 중요합니다. 설치류는 쉽게 구할 수 있고 그릇에 있는 이러한 펠릿을 인식할 것이기 때문에 장치 내의 펠릿을 먹을 가능성이 높습니다. 장치의 올바른 방향을 향하는 데 익숙해지고 그릇을 만지는 데 익숙해지는 것이 중요합니다.
4. 다음 교육일에는 장치에서 보울 익스텐션을 집어넣기 시작합니다. 이를 위해서는 설치류가 앞쪽에 있는 장치 개구부에 접근하고 장치 바로 바깥쪽의 확장 장치와의 상호 작용을 장려해야 합니다.
   1. 이 디자인은 펠릿의 특정 배치를 허용합니다. 예를 들어, 설치류에 가장 가까운 그릇 끝에 펠릿을 놓고 점차 더 멀리 이동하여 설치류가 장치 밖으로 손을 뻗도록 합니다.
5. 설치류가 확장 장치의 가장자리에서 펠릿을 섭취하는 것이 더 편안해짐에 따라, 입으로만이라도 핀셋을 통해 펠릿을 도입하여 도달 행동을 장려하기 시작합니다.
   1. 장치 바로 바깥의 핀셋에 펠릿 하나를 잡고 설치류가 핀셋을 만질 수 있도록 합니다. 이 행동에 즉시 보상하여 더 많은 도달을 장려합니다.
   2. 설치류가 핀셋을 만지는 것이 더 편안해지면 핀셋을 장치 입구에서 조금 더 멀리 잡고 펠릿을 만지거나 잡기 위해 장치에서 조금 더 멀리 손을 뻗을 수 있도록 합니다.
      참고: 모든 동물의 행동, 특히 동물이 그릇을 무서워하거나 손을 뻗지 않는 경우 모든 동물의 행동을 기록하십시오. 이 동물들은 추가적인 형성 일일이 필요할 수 있습니다.
6. 설치류가 최소 3일 동안 지속적이고 독립적으로 도달하면(그림 2A), 도달 행동이 확립될 때까지 플레인 볼로 전환합니다(하루에 최소 10번의 독립적인 도달로 3일 동안 연속 도달).
   1. 설치류를 플레인 그릇에 소개할 때 설치류가 그릇 옆에서 펠릿을 시각화할 수 있도록 그릇에 펠릿이 최대한 채워져 있는지 확인하십시오.
      참고: 이 단계에서는 핀셋을 사용하여 도달 범위를 장려해야 할 수 있습니다.
7. 쥐 사이에 소독용 물티슈로 챔버를 청소하십시오. 하루가 끝나면 에탄올을 뿌려 소독하십시오.

6. 테스트 준비:

1. 테스트는 9일에 걸쳐 완료되며(그림 2A), 각 설치류는 보울당 3번의 시도를 수행하며, 각 10분 시도는 연속적으로 진행됩니다.
   참고: 검사는 아침에 수행하는 것이 가장 좋습니다.
2. 매일 실험할 때마다 쥐의 무게를 잰다. 완료되면 쥐는 체중 측정이 스트레스를 유발하고 도달 행동을 억제할 수 있으므로 테스트 전에 30-60분 동안 가정용 케이지에 남겨둡니다.
3. 컴퓨터를 켜고 그릇을 설정합니다. 카메라와 조명을 연결합니다. 녹화 소프트웨어를 열고 프로토콜의 섹션 2에 설명된 대로 카메라 설정을 조정합니다.
   참고: 모든 발 움직임을 캡처하려면 초당 최소 200프레임(fps)을 기록하는 것이 좋습니다.
4. 그릇을 카메라 프레임에 정렬하고 재생 버튼을 눌러 녹음 소프트웨어에서 시각화합니다. 그릇을 기기 및 카메라와 같은 높이로 그릇 측면과 45° 각도로 놓습니다.
   1. 카메라를 움직여 손을 직접 뻗는 것을 정면으로 포착하여 개별 손가락과 손바닥의 움직임은 물론 손을 뻗는 동안 그릇 위의 손바닥 높이와 관련된 움직임을 연구합니다.
   2. 카메라를 그릇에 수직으로 직접 배치하여 그릇을 오가는 팔과 손의 움직임을 캡처하지만 숫자 배치나 잡기 동작에 대한 세부 정보는 캡처하지 않습니다.
      참고: x, y 및 z 평면을 따라 이동을 캡처하려면 45° 각도를 사용하는 것이 좋지만 다른 구성에서는 원하는 스터디에 대한 정보를 더 쉽게 캡처할 수 있습니다.

7. 테스트(9일)

1. 쥐를 방에 넣어 1 시간 동안 습관화하십시오.
2. 첫 번째 그릇을 그릇 플랫폼에 놓고 치과 왁스로 고정합니다. 그릇의 앞면이 같은 높이이고 장치 입구의 중앙에 있는지 확인하십시오.
3. Spinview 내에서 쥐 식별 번호, 녹화 날짜 및 녹화 시간으로 비디오 파일의 이름을 지정합니다.
4. 쥐를 장치에 넣으십시오. 뚜껑을 닫고 그 위에 흰색 마분지를 올려 빛을 굴절시킵니다.
5. 이 시점에서 카메라 각도를 다시 확인하여 적절한 장면이 캡처되었는지 확인하고 중앙에 있지 않은 경우 그릇을 조정합니다.
6. 그릇에 정확한 양의 펠릿을 붓고 녹음 시작을 누릅니다.
   1-3일차 플레인 볼: ~100 펠릿
   4-6일차 그릇 감소: ~50 펠릿
   7-9일차 플링코 볼: ~50펠릿
7. 실험하는 동안 방에 남아 쥐를 지속적으로 모니터링하고, 성능 및 행동에 도달하는 것을 기록하고, 정확한 양을 유지하기 위해 필요에 따라 펠릿을 추가합니다.
   1. 플레인 그릇의 경우 설치류가 그릇 가장자리 너머로 펠릿을 볼 수 있고 항상 펠릿을 얻을 수 있는지 확인합니다(즉, 펠릿이 줄어들고 펠릿이 겹쳐짐에 따라 시험 내내 그릇을 채웁니다).
   2. Less 그릇의 경우: 펠릿이 서로 겹쳐져 있지 않고 펠릿 사이에 약간의 공간이 있어 쥐가 손을 뻗으려고 할 때 펠릿이 흩어질 수 있는지 확인하십시오.
   3. Plinko 그릇의 경우: 장애물 사이에 접근할 수 있는 충분한 펠릿이 있는지 확인하십시오.
8. 동물을 집 우리로 되돌리고 할당된 음식을 제공하십시오. 쥐 사이에 소독용 물티슈로 챔버를 청소하십시오.
9. 하루가 끝나면 에탄올을 뿌려 챔버 전체를 소독하고 다음 날을 준비합니다.
   참고: 수컷과 암컷 설치류를 모두 테스트하는 경우 일부 암컷과 일부 수컷은 아침 일찍 테스트하고 나중에 유사한 혼합을 테스트하여 암수 균형을 맞춰야 합니다. 전체 실험에서 테스터의 순서를 유지합니다.

그림 2: 소근육 운동 과제를 수행하는 쥐의 훈련 및 테스트. (A) 실험 일정. 쥐는 2일 동안 장치에 익숙해진 다음 10일 동안 성형 절차를 거쳤습니다. 동물들은 각 그릇마다 3일 동안 세 개의 그릇 모두에 걸쳐 소근육 운동 능력을 테스트했습니다. 그런 다음 동물들에게 하말린을 주사하고 3일에 걸쳐 각 그릇에 대해 재검사했습니다. (B) 랫트(n = 6)는 성형 과정에서 두 가지 다른 보울(트레이닝 볼과 플레인)을 받았고, 리치를 개선하기 위해 5일째에 보울 유형을 전환했습니다. 기준(F(9, 45) = 13.5, p < 0.001)에 도달하기 위해 10일에 걸쳐 쉐이프가 크게 증가했습니다. 회색 막대는 원래 튜브와 현재 길쭉한 튜브 훈련 그릇 사이의 스위치를 나타냅니다. (C) 3개의 그릇을 모두 테스트한 경우, 9일간의 테스트 기간 동안 총 도달 거리에서 유의한 차이가 있었습니다(F(8, 32) = 3.74, p = 0.003). 참고: 랫 2는 성형 후 제거되었습니다. Plinko 보울은 Less 보울(p = 0.001)과 플레인 보울(p = 0.027) 간에 상당한 차이를 보였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

8. Harmaline을 사용한 미세 운동 파괴 모델링

참고 : 미세 운동 작업에서 미세 운동 능력 및 성능에 대한 운동 장애의 영향을 확인하기 위해 쥐에게 모노 아민 산화 효소 -A의 가역적 억제제이며 열등한 올리브^{52 , 55 , 56 , 57}을 표적으로 하는 β 탄수화물 알칼로이드 인 Harmaline (10 mg / kg)을 주입했습니다. 설치류 모델의 Harmaline은 자세와 균형에 영향을 미치고, 미세한 운동 협응을 제한하며, 상지의 운동 장애를 유발합니다.

1. 적절한 Harmaline 복용량을 계산하기 위해 쥐의 무게를 잰다.
2. 쥐가 1시간 동안 시험장에 익숙해지도록 합니다.
3. 컴퓨터를 켜고 그릇을 설정합니다. 카메라와 조명을 연결합니다. 녹화 소프트웨어를 열고 프로토콜의 섹션 2에 설명된 대로 카메라 설정을 조정합니다.
4. 설치류에 Harmaline (10 mg/kg, i.p.)을 주입합니다.
5. 15분 후 펠릿을 적절한 그릇에 붓고 녹음을 시작합니다. 3일에 걸쳐 각 그릇에 쥐를 테스트하십시오.
   1일차 플레인 볼: ~100 펠릿
   2일차 그릇 감소: ~50 펠릿
   3일차 플링코 볼: ~50 펠릿
   참고: 주사 후 최대 3시간 동안 주사 부위에 피부 자극, 통증 행동, 운동 실조, 저체온증, 자세 변화를 포함한 이상이 있는지 모니터링합니다. 3시간 이후에는 먹거나 마시는 잠복 또는 잔류 떨림을 포함한 행동의 변화를 계속 모니터링합니다.

9. 머신러닝을 활용한 영상분석

참고: 데이터 수집 및 비디오 녹화 후, 도달 범위는 수동으로 계산되었으며 다음과 같이 점수가 매겨졌습니다: 성공(펠릿 회수 및 소비), 드롭(펠릿을 회수하지만 소비 전에 펠릿을 드롭), 실패(펠릿을 회수할 수 없음). 이 수작업 점수 데이터는 기계 학습 분석을 위한 실측 데이터로 사용되었습니다.

1. https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask 에서 사용자 정의 Python 코드를 사용하여 Baseline과 Harmaline 처리된 동물을 비교하여 도달 성능의 변화를 식별했습니다(그림 3, 그림 4, 그림 5 및 그림 6).
2. 다양한 그릇 유형에 걸친 도달 궤적, 발 형태 및 위치, 도달 전략의 변화를 포함한 도달 동작의 공동 운동학을 분석하려면 무료 오픈 소스 머신 러닝 소프트웨어 Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP) (오픈 소스 프로그램⁴⁹ 사용에 대한 자세한 설명 및 단계별 가이드는 https://sleap.ai/ 참조)를 사용하십시오.
   참고: SLEAP⁴⁹ 는 https://github.com/talmolab/sleap 에서 다운로드할 수 있습니다.
3. 새 프로젝트를 열고 도달 작업에 대한 비디오 3개를 추가합니다.
4. 15개의 노드(위쪽 팔뚝 1개, 손목 1개, 손바닥 중앙 1개, 베이스 4개, 너클 4개, 손가락 끝 노드 4개)로 구성된 스켈레톤을 만듭니다(https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask 에서 스켈레톤 다운로드).
5. 위쪽 팔이 손목에 연결되도록 노드 사이에 가장자리를 추가한 다음 손바닥 중심에 연결합니다. 손바닥 중심에서 바닥, 손가락 관절 및 손가락 끝 노드를 연결하여 손바닥 중심이 항상 시작 노드가 되도록 합니다(그림 7A).
6. 훈련을 실행하기 전에 최소 50프레임에 레이블을 지정합니다. 여기에서 새 모델을 훈련하거나 github: https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask 에서 중심 및 중심에 대한 모델을 사용할 수 있습니다.
7. 모델이 훈련되면 새 비디오를 열고 추론을 실행합니다. trackin.match: greedy, n_instances:1, tracking.clean_instance_count: 1, tracking.target_instance_count: 1, tracking.pre_cull_to_target: 1.
   참고: 추론은 로컬 클러스터에서 bash 스크립트로 실행할 수 있습니다. 트래킹된 비디오는 교정이 필요할 수 있습니다(교정 지침은 https://sleap.ai/ 참조).
8. 노드를 추가로 분석하고 조인트 운동학에서 그룹 간의 차이점을 이해하려면 무료 오픈 소스 키포인트인 MoSeq⁵⁰을 사용하십시오(다운로드 및 사용 지침에 대한 자세한 내용은 https://github.com/dattalab/keypoint-moseq 참조).
9. keypoint-MoSeq⁵⁰ 을 사용하여 동작의 개별 음절을 생성합니다(그림 7B). 보울당 Harmaline과 Baseline 조건 사이의 전이 빈도 변화를 매핑하기 위해 추가 분석을 수행합니다(그림 7C, D). 분석 코드는 https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask 참조하세요.

그림 3: 그릇을 가로지르는 도달 범위와 처리의 변화. (A) 기준선(n = 5) 테스트의 경우, 3개의 보울 모두에서 총 리치(H(df) = 8.48, p = 0.014, Kruskal-Wallis)에서 상당한 차이가 있었으며, Plinko 보울 유형(p = 0.011, Bonferroni 보정을 사용한 Post-hoc Dunn의 테스트)에서 더 많은 리치가 발생했습니다. (B) Harmaline (n = 5) 섭동은 그릇 유형 간에 차이를 일으키지 않았습니다. 오류는 S.E.M. *p < 0.05로 보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 컨디션 간 성능과 보울 유형 간의 성능 비교. (A) 기준선 테스트 중에 유의한 보울(F(2) = 5.78, p = 0.007)과 결과 차이(F(2) = 3.92, p = 0.029)가 있었습니다. 볼 유형이 더 어려워짐에 따라 리치 시도가 증가했지만, 하멀린 상태의 모든 볼에서 리치가 베이스라인에서 감소했습니다. (B) Harmaline 처리된 쥐에서는 그릇에 걸친 도달 거리 수에 대한 차이가 발견되지 않았습니다. (C) 성능별로 분석했을 때 기준선 테스트 동안 유의한 결과 차이(F(2) = 2.07, p < 0.001)가 있었습니다. (D) Harmaline 처리된 쥐에서 보울 또는 결과 성능에 대한 차이는 발견되지 않았습니다. 오류는 S.E.M. 으로 보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 기준선 조건과 Harmaline 조건의 비교. (A) 조건 간 성능 성공에는 차이가 없었습니다. (B) 고장 횟수의 경우, 기준선과 Harmaline 조건(H(df) = 4.85, p = 0.028, Kruskal-Wallis) 간에 유의한 차이가 있었으며, Harmaline 조건(p = 0.028, Bonferroni 보정을 사용한 Post-hoc Dunn의 검정)에서 유의미한 효과가 발견되었습니다. 오류는 S.E.M. 으로 보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 학습 및 도달 속도. (A) Harmaline 동물은 기준 조건(t-stat = 2.833, p = 0.022)에 비해 교란 학습률을 보였다. (B) 분당 총 도달 거리의 경우, 보울(적음)과 상태(하말린)(F(1,5) = 9.83, p = 0.002, 혼합 선형 모델), 보울(플링코)과 상태(하말린)(F(1,5) = 22.67, p < 0.001, 혼합 선형 모델) 사이에 유의한 상호 작용이 있었습니다. Harmaline은 기준선에 비해 모든 볼 유형(Less: p = 0.01, Plinko: p < 0.001)에서 분당 총 도달 거리를 줄였습니다. 오류는 S.E.M. *p < 0.05, ***p < 0.001로 보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 기계 학습은 고유한 포즈와 작업 전략을 식별합니다. (A) SSEAP 를 사용하여 레이블이 지정된 쥐 발의 노드 위치. (B) 도달하는 동안 keypoint-MoSeq에 의해 식별되는 음절의 예. (C) 연속된 음절 사이의 바이그램 전이 빈도 매트릭스. 전이 확률은 총 바이그램 수로 정규화됩니다. (D) Harmaline과 Baseline 사이의 음절 전이 차이를 비교하는 전이 그래프. 그래프의 노드는 음절을 나타내고 가장자리는 음절 사이의 전환을 나타냅니다. 더 눈에 띄는 가장자리는 더 높은 주파수의 음절 전환을 나타냅니다. 빨간색 연결은 상향 조절된 전이를 나타내고, 파란색 연결은 Harmaline 처리된 동물에서 하향 조절된 전이를 나타냅니다. 빨간색 원은 상향 조절된 사용을 나타내고 파란색 원은 Harmaline 처리된 동물에서 표시된 음절의 하향 조절된 사용을 나타냅니다. 주파수가 0.005 미만인 음절 쌍은 제외되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

쥐가 체중의 90%에 도달한 음식 제한에 도달한 후, 2일 동안 챔버에 익숙해진 후 1-2주 동안 성형 절차를 거쳤습니다. 성공, 삭제 및 실패한 도달 횟수는 각 조건에 대해 눈이 먼 훈련된 관찰자에 의해 점수가 매겨졌습니다. 9일(기준선) 동안 쥐는 3가지 다른 그릇 구성(Plain, Less 및 Plinko)에서 미세 운동 능력을 테스트했습니다. 그런 다음 동일한 쥐(그룹당 n = 5마리, 질병으로 인해 훈련 그릇 성형 후 1마리 제거)에게 3일에 걸쳐 하루에 한 번 Harmaline(10mg/kg, i.p.)을 주사하여 도달 능력, 전략 및 성과(그림 2A). 설계 및 시공 단계에서 예비 훈련 볼은 도달 능력을 높이지 못했습니다(1-4일차). 그 결과 길쭉한 특징이 있는 훈련 그릇이 재설계되었으며, 동물들은 지속적으로 펠릿에 손을 뻗기 시작했고(5-10일차), 10일차에는 훈련 기준에 도달했습니다(

토론

설치류에 대한 도달 작업은 일반적으로 단일 펠릿으로 제한되며 신경 퇴행성 병리학 환자에게 일반적인 어려움인 장애물이나 자체 교란 기능을 포함하지 않습니다. 여기에 제시된 방법은 재창조된 펠릿 도달 작업과 머신 러닝을 모두 사용하여 개별 숫자 움직임 외에도 포즈 기능 및 전환 분석을 통해 조정과 전략을 모두 감지할 수 있습니다. 여기에서 생성된 소근육 운동 과제는 포즈 분석과 포즈 간 전환을 통해 조정과 전략을 감지했습니다. 일반적인 도달 작업은 일반적으로 실험 대상이 회수할 수 있도록 단일 음식 보상이 놓인 선반과 관련이 있습니다. 단일하고 반복적인 도달 전략에 의존하는 단일 펠릿 반복에는 작업 난이도, 종단적으로 사용될 때 잠재적인 학습, 테스트 전반에 걸친 펠릿 배치 변경으로 인한 전략 조정의 어려움과 관련된 메트릭이 부족하며, 이는 이 새로운 방법으로 포착됩니다. 전통적인 단일 펠릿 작업에서 이러한 누락은 설치류가 단일의 반복적인 리치에 대한 숙달로 인해 속도와 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3D 프린팅 재료	아마존 (서곡)	B07PGY2JP1	PLA 필라멘트 1.75mm PLA 3D 프린터 필라멘트, 치수 정확도 +/- 0.03mm
카메라	에드먼드 옵틱스	BFS-U3-13Y3M-C	1.3 MP, 모노, 170 FPS, ON 세미 파이썬 1300 x2
카메라 케이블	에드먼드 옵틱스	ACC-01-2300	USB 3.1, 3 m, Type-A에서 Micro-B로(잠금) 케이블
카메라 렌즈	토르 연구소	MVL5WA	4.5mm EFL, F/1.4, 1/2" 포맷 머신 비전 렌즈
카메라와 삼각대 연결	에드먼드 옵틱스	88-210	카메라와 삼각대의 연결
청소용 물티슈	아마존 (산니-클로스)	B00KMZ7KMO	AF3 표면 소독제 클리너 와이프 캔스터 약한 향 160 ct p13872
컴퓨터	델	정밀도	인텔 코어 i7-13700 @ 2.1 GHz, NVIDIA T1000 8 GB, RAM 16 GB
적외선 조명	아마존 (세를리움)	B0BJFDBT44	카메라 적외선, 48개의 LED 적외선 조명, 방수 적외선 야간 투시경 보안용 CCTV 카메라 등; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp;
패널 글루	아마존 (스딘타르)	B0B1DLRPNZ	유리 접착제
플렉시글라스	아마존 (TOOLINHAND  미국)	B0BRJ1L8TR	12 & times; 12인치 클리어 캐스트 아크릴/플렉시글라스 시트 - 투명 1/8" 두께 (3 mm)와 nbsp;
파이썬	그리고 nbsp; 파이썬 소프트웨어 재단	파이썬 3.7
스핀뷰	텔레다인 테크놀로지스	버전 3.1.0.79
설탕 펠릿 (45mg)	바이오서브	F0023	45mg, 무향 50,000/박스; 성분: 자당, 덱스트로스, 스테아레이트 마그네슘, 규산칼슘, 미네랄 오일
삼각대	아마존 (유이)	B086PYJF9D	아마존 플렉블렉스 데스크 웹캠 삼각대
핀셋	파인 사이언스 툴즈	11064-07	홍채 겸자
왁스	아마존 (정형역학)	B00FKDC0UU	진짜 오소왁스