이 논문은 신생아 Sprague-Dawley(SD) 쥐에서 1차 망막 뮐러 세포를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차에는 안구 적출, 망막 조직 해부, 세포 추출 및 식별, 후속 세포 배양을 위한 주요 고려 사항이 포함됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
망막 뮐러 세포(RMC)는 망막 내에서 구조적 지지를 제공하고 다양한 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 망막 미세환경의 핵심 구성 요소인 RMC는 몇 가지 중요한 기능을 수행합니다. 이 세포는 풍부한 이온 채널, 리간드, 수용체, 막관통 수송체 및 효소 시스템을 통해 신경전달물질 및 영양인자 분비에 기여하고 망막 대사를 조절하며 물-이온 항상성을 유지합니다. 특히, RMC는 최근 내인성 망막 재생 줄기세포의 중요한 공급원으로 확인되어 망막 퇴행성 질환 치료를 위한 새로운 치료 표적을 제공합니다. 따라서 RMC에 대한 연구는 망막 질환의 기저에 있는 병리학적 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 본 연구는 1차 RMC의 트립신 분해 및 정제, 도립 광학 현미경 및 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색을 통한 형태학적 관찰, 면역형광 염색을 통한 특이 단백질 동정, 유세포 분석을 통한 세포 순도 분석을 포함하는 표준화된 실험 프로토콜을 체계적으로 수립합니다. 이 프로토콜은 RMC와 관련된 기초 연구 및 임상 응용 프로그램 모두에 대한 귀중한 참고 자료 역할을 하며, 망막 질환에서 RMC의 메커니즘 탐구를 지원하고 치료 전략 개발을 촉진합니다.
서론
망막의 우세한 거대아교세포(macroglia)인 망막 뮐러 신경교세포(Retinal Müller glial cell, RMC)는 망막 신경혈관 단위(retinal neurovascular unit 1,2)의 핵심을 형성합니다. 거의 전체 망막 두께에 걸쳐 있는 RMC는 거의 모든 망막 뉴런과 미세혈관 구조를 감싸고 있습니다. 이들의 과정은 위쪽으로 내측제한막(inner limiting membrane, ILM)까지 확장되어 정점 말단발을 형성하고, 아래쪽으로는 외제한막(OLM)으로 확장되어 특수한 미세융모를 발달시킵니다3. 이 독특한 구조를 통해 RMC는 망막 조직 4,5의 주요 구조 골격으로 기능할 수 있습니다.
RMC는 이온 채널, 리간드, 수용체, 막관통 수송체 및 효소6로 풍부하며, 해당작용(glycolysis)7을 통해 망막....
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프로토콜
모든 동물 실험은 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 수행되었으며 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine의 동물 윤리 위원회(윤리 번호: 2024069)의 승인을 받았습니다. 50마리의 특이 병원체가 없는(SPF) Sprague-Dawley 쥐(생후 3-5일, 성별 불명, 체중 7-10g)가 연구에 사용되었습니다. 이 동물들은 표준 실험실 조건에서 상업적으로 입수되어 청두 전통 중의학 대학의 실험 동물 센터(시설 사용 허가 번호: SYXK [쓰촨] 2024-049)에서 사육되었습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.
1. 1차 RMC의 격리 및 문화
- 실험 품목의 준비
- 사용하기 전에 클린 벤치에서 최소 30분 동안 자외선 아래에서 T25 배양 플라스크, 원심분리기 튜브 및 랙, 피펫 및 스탠드, 액체 폐기물 용기, 담배 라이터, 증류주 알코올 램프 및 마커.
- 1mL 피펫 팁, 벤딩 플레이트, 뚜껑이 있는 유리 페트리 접시, 곡선형 핀셋, 45μm 나일론 메쉬(300메쉬....
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결과
일차 세포를 배양 플라스크에 파종한 후, 후속 배지 변화 및 계대 배양은 부착성이 떨어지는 RMC를 제거하고 계대 배양 중에 생성된 세포 파편을 제거하여 배양에서 RMC 집단을 풍부하게 하는 데 도움이 됩니다. RMC는 도립 광학 현미경(그림 1)과 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색(그림 2)을 사용하여 형태를 기반으로 식별되었습니다. 단백질 발현을 관찰하기 위해 GS, Vimentin, CRALBP, AQP4 및 Kir4.1에 대한 특정 항체를 사용하여 면역형광 염색을 수행했습니다(그림 3). 또한 RMC 집단의 순도를 측정하기 위해 GS 및 CRALBP 항체 라벨링을 사용하여 유세포 분석을 수행했습니다(그림 4).
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토론
이 논문은 신생아 SD 랫트에서 원발성 RMC를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 사전 실험 준비, 안구 적출, 망막 조직 분리 및 RMC 추출, 배양, 계대 형성 및 식별을 위한 단계별 절차를 포함한 모든 단계를 다룹니다. 또한 전체 세포 배양 과정에서 관찰해야 하는 주요 고려 사항을 강조하여 관련 연구를 위한 표준화된 기술 지침을 제공합니다.
RMC 추출을 위해 3-5일 된 신생아 SD 쥐를 선택했습니다. 이 연령대의 쥐는 안구의 크기가 작기 때문에 안구 분리 및 망막 조직 추출 절차는 높은 기술적 숙련도를 요구하는 중요한 운영상의 문제를 야기합니다. 특히 조직 크기가 작으면 1차 세포 수율이 낮아집니다. 또한, 계대 수가 증가함에 따라 배양27 중에 세포 생존율이 점차 감소하며, 후속 연구에 필요한 세포 수를 달성하기 위해 더 많은 실험 동물을 사.......
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공개 사항
모든 저자는 이 기사의 내용과 관련된 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 쓰촨성 자연 재단 기금(2023NSFSC0690)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.1% Triton X-100 | Solarbio | T8200 | |
| 0.25% 트립신-EDTA | 하이클론 | SH30042.01B | |
| 1% 염산 알코올 | BIOSYSTEMS | 3803651E | |
| 4% 파라포름알데히드 | Solarbio | P1110 | |
| 45μ m 나일론 메쉬(300 메쉬) | Solarbio | YA0926 | |
| 6웰 플레이트 | Servicebio | IMC202302001 | |
| 6cm 유리 페트리 접시 | Normax | 5058541 | |
| 75% 알코올 | KESHI | GEA004 | |
| 아쿠아포린-4(AQP4) | Proteintech Group, Inc | 16473-1-AP | |
| BSA | Servicebio | GC305010 | |
| 세포 배양 인큐베이터 | Thermo | FORMA311 | |
| 세포 레티알데히드 결합 단백질(CRALBP) | HUABOI | HA721330 | |
| 원심분리기 | 후난 Xiangyi | TDZ5-WS | |
| 클린 벤치 | ZHICHENG | ZHJH-C12 | |
| 각막 가위 | Jinzhong | BXGJ | |
| DAPI | Solarbio | G1012 | |
| D-행크 솔루션 | Solarbio | H1045 | |
| DMEM 고포도당 중지 | Gibco | C11995500BT | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Sbjbio 생명과학 | BC-SE-FBS01 | |
| FIX& PERM 미디엄 A | MultiSciences | GAS006/2 | |
| FIX& PERM 배지 B | MultiSciences | GAS006/2 | |
| 유세포 분석 염색 완충액 | MultiSciences | S1001 | |
| Fluoromount-G 형광 마운팅 미디어 | SourthernBiotech | 0100-01 | |
| 글루타민 합성 효소 다클론 항체 Proteintech | Group, Inc | PTG-11037-2-AP-50ul | |
| 염소 324 항토끼 IgG H& L PE | Bioss | bs-0295G-PE | |
| 염소 안티 - 323 토끼 IgG H& L FITC | Bioss | bs-0295G-FITC | |
| 헤마목실린 에오신 (HE) 염색 키트 | Solarbio | G1120 | |
| 고압 소독기 | zealway (xiamen) 기기 Inc | GI80DS | |
| 도립 형광 현미경 | Nikon | SMZ1500 | |
| 반전 위상차 현미경 | Leica | DMIL | |
| 내향 정류기 칼륨 채널 4.1 (Kir4.1) | Proteintech Group, Inc | 12503-1-AP | |
| 중성 수지 | Solarbio | G8590-100 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액 (100×) | Hyclone | SV30010 | |
| Phosphate Buffer 식염수(PBS)(pH7.2-7.4) | Solarbio | P1020-500ml | |
| 2차 항체(FITC 표지 염소 항토끼) | Servicebio | GB22303 | |
| Sprague-Dawley 쥐 | 청두 Dashuo 실험 동물 유한 회사 | 생산 허가 번호: SCXK [쓰촨성] 2020-0030 | |
| T25 배양 플라스크 | Cornning | 430639 | |
| 토네이도 튜브: 15mL | WHB | WHB-15-1 | |
| 토네이도 튜브: 50mL | WHB | WHB-50-1 | |
| 자외선 소독 살균기 | GEMEISI | xd06 | |
| Vimentin | Abcam | ab92547 |
참고문헌
- Bringmann, A., Pannicke, T., Grosche, J., et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Kugler, E. C., Greenwood, J., MacDonald, R. B. The "neuro-glial-vascular" ....
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재인쇄 및 허가
