이 논문은 신생아 Sprague-Dawley(SD) 쥐에서 1차 망막 뮐러 세포를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차에는 안구 적출, 망막 조직 해부, 세포 추출 및 식별, 후속 세포 배양을 위한 주요 고려 사항이 포함됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
망막 뮐러 세포(RMC)는 망막 내에서 구조적 지지를 제공하고 다양한 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 망막 미세환경의 핵심 구성 요소인 RMC는 몇 가지 중요한 기능을 수행합니다. 이 세포는 풍부한 이온 채널, 리간드, 수용체, 막관통 수송체 및 효소 시스템을 통해 신경전달물질 및 영양인자 분비에 기여하고 망막 대사를 조절하며 물-이온 항상성을 유지합니다. 특히, RMC는 최근 내인성 망막 재생 줄기세포의 중요한 공급원으로 확인되어 망막 퇴행성 질환 치료를 위한 새로운 치료 표적을 제공합니다. 따라서 RMC에 대한 연구는 망막 질환의 기저에 있는 병리학적 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 본 연구는 1차 RMC의 트립신 분해 및 정제, 도립 광학 현미경 및 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색을 통한 형태학적 관찰, 면역형광 염색을 통한 특이 단백질 동정, 유세포 분석을 통한 세포 순도 분석을 포함하는 표준화된 실험 프로토콜을 체계적으로 수립합니다. 이 프로토콜은 RMC와 관련된 기초 연구 및 임상 응용 프로그램 모두에 대한 귀중한 참고 자료 역할을 하며, 망막 질환에서 RMC의 메커니즘 탐구를 지원하고 치료 전략 개발을 촉진합니다.
서론
망막의 우세한 거대아교세포(macroglia)인 망막 뮐러 신경교세포(Retinal Müller glial cell, RMC)는 망막 신경혈관 단위(retinal neurovascular unit 1,2)의 핵심을 형성합니다. 거의 전체 망막 두께에 걸쳐 있는 RMC는 거의 모든 망막 뉴런과 미세혈관 구조를 감싸고 있습니다. 이들의 과정은 위쪽으로 내측제한막(inner limiting membrane, ILM)까지 확장되어 정점 말단발을 형성하고, 아래쪽으로는 외제한막(OLM)으로 확장되어 특수한 미세융모를 발달시킵니다3. 이 독특한 구조를 통해 RMC는 망막 조직 4,5의 주요 구조 골격으로 기능할 수 있습니다.
RMC는 이온 채널, 리간드, 수용체, 막관통 수송체 및 효소6로 풍부하며, 해당작용(glycolysis)7을 통해 망막 포도당 대사에 참여합니다. 칼륨 이온 채널(Kir2.1, Kir4.1)과 수분 채널 단백질(AQP4, AQP9, AQP11)은 세포막 전반에 걸쳐 이온과 물의 항상성을 공동으로 조절하여 망막의 생리학적 균형을 유지합니다7. 또한 RMC는 글루타메이트, γ-아미노낙산(GABA) 및 글리신 7,8을 포함하여 뉴런에서 방출되는 신경 전달 물질을 흡수하고 제거합니다.
당뇨병성 망막병증7, 녹내장9, 색소성 망막염10과 같은 병리학적 질환은 RMC를 손상시키고, 혈액-망막 장벽을 파괴하고, 염증을 유발하고, 혈관 투과성을 증가시키고, 망막 기능을 손상시킬 수 있습니다. RMC는 또한 망막 재생 세포의 잠재 고유 공급원으로 인식됩니다11,12. 어류와 특정 양서류에서 RMC는 손상으로 손실된 뉴런을 대체하는 망막 전구 세포로 역분화될 수 있습니다13. 성인 포유류 망막에서 RMC는 줄기세포 관련 마커 단백질을 발현하며, 14,15 이는 노화 관련 황반변성, 녹내장, 당뇨병성 망막병증과 같은 퇴행성 질환에서 망막 뉴런으로 분화하고 손상된 세포를 대체할 수 있는 잠재력을 부여합니다16. 원발성 RMC는 생체 내 상태를 밀접하게 모방하며 망막 퇴행성 질환을 연구하고 치료하는 데 큰 가치가 있습니다. 그러나 문헌에는 특히 신생아 Sprague-Dawley(SD) 쥐에서 1차 RMC를 분리하고 배양하는 확립된 방법이 거의 포함되어 있지 않습니다.
이 프로토콜은 성별 선호 없이 3-5일 된 신생아 SD 쥐를 사용합니다. 무균 상태에서 안구는 적출되고 망막 조직은 트립신을 사용하여 소화됩니다. 그런 다음 1차 RMC는 후속 배양 및 계대를 위해 원심분리 및 정제 를 통해 분리됩니다. 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색과 결합된 도립 광학 현미경을 사용한 형태학적 분석은 분리된 세포가 특징적인 RMC 특징을 나타내는 것을 보여주었습니다. 면역형광 염색을 통해 글루타민 합성효소(GS), 세포 레틴알데히드 결합 단백질(CRALBP), 비멘틴, 아쿠아포린-4(AQP4) 및 내부 정류기 칼륨 채널 4.1(Kir4.1)을 포함한 RMC 특이적 단백질 마커의 발현을 확인했습니다. GS 및 CRALBP 항체로 라벨링한 후 유세포 분석은 ≥90%의 세포 순도를 입증했으며, 이는 RMC 기반 생물학적 실험에 대해 확립된 기준을 충족하고 후속 기능 연구에 대한 적합성을 보장합니다. 실험 과정에서 네 번째 계대에 있는 세포는 배양 플라스크에 대한 순응도 감소, 형태학적 변화 및 노화 징후를 보였으며 궁극적으로 세포 사멸로 이어졌습니다. 따라서 처음 3개의 계대에서 나온 세포들만이 후속 실험에서 사용되었다.
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프로토콜
모든 동물 실험은 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 수행되었으며 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine의 동물 윤리 위원회(윤리 번호: 2024069)의 승인을 받았습니다. 50마리의 특이 병원체가 없는(SPF) Sprague-Dawley 쥐(생후 3-5일, 성별 불명, 체중 7-10g)가 연구에 사용되었습니다. 이 동물들은 표준 실험실 조건에서 상업적으로 입수되어 청두 전통 중의학 대학의 실험 동물 센터(시설 사용 허가 번호: SYXK [쓰촨] 2024-049)에서 사육되었습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.
1. 1차 RMC의 격리 및 문화
- 실험 품목의 준비
- 사용하기 전에 클린 벤치에서 최소 30분 동안 자외선 아래에서 T25 배양 플라스크, 원심분리기 튜브 및 랙, 피펫 및 스탠드, 액체 폐기물 용기, 담배 라이터, 증류주 알코올 램프 및 마커.
- 1mL 피펫 팁, 벤딩 플레이트, 뚜껑이 있는 유리 페트리 접시, 곡선형 핀셋, 45μm 나일론 메쉬(300메쉬), 톱니 핀셋, 이빨 없는 핀셋 및 마이크로 각막 가위.
- 환경 준비: 안구 박리를 위한 환경 및 수술대를 자외선으로 30분 이상 소독합니다. 깨끗한 벤치에 들어가기 전과 나간 후에 매번 실험자의 손에 알코올을 뿌립니다. 인큐베이터를 37°C 및 5% CO2로 설정합니다. 인큐베이터를 열기 전과 후에 실험자의 손에 알코올을 뿌립니다.
- 용액 준비: D-Hank's solution, phosphate-buffered saline (PBS), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM high-glucose), fetal bovine serum (FBS, heat-inactivated), penicillin/streptomycin solution (100x) 및 0.25% trypsin-EDTA solution을 준비합니다.
알림: 사용하기 전에 DMEM과 FBS를 37°C 수조에서 데우십시오.- D-Hank's 또는 PBS 용액 10mL에 각각 100μL의 페니실린/스트렙토마이신 용액을 첨가하여 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 D-Hank's 및 PBS 용액을 준비합니다.
- 10mL의 고포도당 DMEM에 100μL의 페니실린/스트렙토마이신 용액과 2mL의 FBS를 첨가하여 완전한 배양 배지를 준비합니다.
알림: 실험실 클린 벤치에서 용액을 준비하고 가능하면 즉시 사용하십시오. 전체 배양 배지를 4°C에서 보관하고 매번 사용하기 전에 37°C로 데우십시오. 일주일 이상 보관한 경우 폐기하십시오.
- 눈 제거
- 신생아 SD 쥐를 자궁경부 탈구(CO2 질식 없이)로 기관적으로 승인된 프로토콜에 따라 멸균된 작업대에서 안락사시킵니다. 소독을 위해 시신을 75% 알코올에 5분 동안 담근 다음 멸균된 곡선형 접시에 옮깁니다.
- D-Hank의 용액을 10cm 유리 배양 접시 2개에 붓습니다.
- 톱니가 있는 핀셋을 사용하여 안구 열구를 따라 눈꺼풀을 찢어 안구를 노출시킵니다.
- 이빨이 없는 핀셋을 사용하여 안와를 눌러 안와와 평행하게 엽니다. 시신경에 도달하여 안구가 노출되면 핀셋을 닫아 안구를 들어 올려 추출합니다.
- D-Hank's 용액이 담긴 유리 배양 접시에 안구를 넣고 헹구고 신선한 D-Hank's 용액이 담긴 다른 접시에 옮깁니다.
알림: 안구가 손상되지 않았는지 확인하십시오. 이상적으로는 망막 조직 분리를 용이하게 하기 위해 시신경의 일부가 부착된 상태로 유지되어야 합니다.
- 망막 박리
- 멸균된 뚜껑이 있는 빈 배양 접시를 준비하고 현미경을 조정합니다.
- 1.4.5단계의 유리 배양 접시를 현미경 아래에 놓습니다. 구부러진 안과용 마이크로 집게를 사용하여 각막과 시신경 사이의 부위를 부드럽게 고정하여 각막을 노출시킵니다.
- 마이크로 각막 가위를 사용하여 각막 접합부를 뚫습니다. 윤부를 따라 원형으로 자른 다음 약 2mm 길이의 대칭적인 공막 절개를 만듭니다. 겸자를 풀고 시신경과 공막의 접합부에서 다시 clamp .
- 두 번째 집게를 사용하여 시신경근 근처를 부드럽게 눌러 각막-시신경 계면 쪽으로 압력을 가합니다. 렌즈 조직이 나타나면 조심스럽게 제거하고 망막 조직이 나올 때까지 계속 누릅니다.
참고: 실수로 망막 조직을 추출하지 않도록 렌즈를 조심스럽게 제거하십시오. - 분리된 망막 조직을 겸자를 사용하여 다른 멸균 배양 접시로 옮깁니다. 접시를 덮고 알코올을 뿌린 다음 깨끗한 벤치에 놓습니다.
- 1차 RMC 추출
- 클린 벤치 환기 스위치를 켭니다.
- 배양 접시 뚜껑을 엽니다. 1mL 팁이 있는 피펫을 사용하여 망막 조직을 위아래로 약 15회 피펫팅하여 작은 조각으로 부수십시오. 0.25% 트립신 1mL를 넣고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
- 인큐베이터에서 배양 접시를 꺼내 깨끗한 벤치에 놓습니다. 2mL의 완전한 배지와 피펫을 부드럽게 첨가하여 소화를 멈춥니다.
참고: 소화를 종결하기 위해 트립신 부피의 두 배를 사용하십시오. 예를 들어, 1mL의 트립신을 사용한 경우 2mL의 완전한 배지로 종료합니다. - 300메시 나일론 스크린을 통해 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 여과합니다. 준비된 PBS로 접시를 씻고 남은 현탁액을 수집합니다.
- 튜브를 878 x g 에서 실온(RT)에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 버립니다. 펠릿을 2mL의 완전한 배지에 재현탁시키고 878 x g 에서 5분 동안 다시 원심분리하여 세포를 정제합니다.
- 원심분리 후 상층액을 버리십시오. 완전한 배지 2mL에 세포를 재현탁합니다. 각 T25 플라스크에 미리 3mL의 완전한 배지를 추가한 다음 1mL의 세포 현탁액을 추가합니다. 플라스크를 십자 모양으로 흔들어 인큐베이터에 넣습니다.
- 배양 48시간 후 첫 번째 매체 변경을 수행합니다. 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 깨끗한 벤치에 놓습니다. 사용한 배지를 버리고 PBS 1mL로 세포 부착 표면을 3회 세척합니다.
- 신선한 완전 배지 5mL를 추가합니다. 세포 포화도가 90%를 초과할 때까지 격일로 배지를 계속 변경한 다음 외종배양을 진행합니다.
2. RMC의 패시에이징
참고: 합류가 90%를 초과할 때 세포를 통과시킵니다. 이 프로토콜에서 1차 배양은 일반적으로 분리 후 5-6일에 계대배양이 필요합니다. 첫 번째 통로의 타이밍은 도금 밀도에 따라 달라질 수 있습니다. 세포 밀도를 4 x 103 cells/mL로 조정하고 세포를 T25 배양 플라스크에 시딩합니다. 3-4일 후에 합류율이 >90%에 도달하면 패시징을 진행하십시오.
- 인큐베이터에서 T25 배양 플라스크를 꺼냅니다. 배양 배지를 버리고 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 PBS 용액 1mL로 세포를 3회 세척합니다.
- 플라스크에 0.25% 트립신-EDTA 용액 1mL를 추가하고 1분 30초 동안 배양합니다.
- 도립 현미경으로 플라스크를 관찰합니다. 세포가 둥글고 분리되어 떠다니기 시작하면 인큐베이터에서 플라스크를 꺼냅니다. 이를 클린 벤치로 옮기고 2mL의 완전 배양 배지를 추가하여 분해를 종료합니다.
- 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 흡인합니다. 플라스크 벽에 부드럽게 피펫을 넣어 남아 있는 부착 세포를 제거합니다.
- 전체 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 PBS 2mL로 플라스크 벽을 헹구고 동일한 튜브에 추가합니다. 상온에서 5분 동안 878 x g 에서 튜브를 원심분리합니다.
- 상등액을 버리십시오. 세포 펠릿을 적절한 부피의 완전한 배지에 재현탁시킵니다. 필요에 따라 1:2 또는 1:3의 비율로 세포를 통과시킵니다.
참고: 다운스트림 실험을 위해 통로 2(P2)의 세포를 사용합니다(그림 1).
3. Hematoxylin 및 Eosin (H & E) 염색
- 2 x 10 웰당5개의 세포의 밀도로 사전 배치된 멸균 커버슬립을 포함하는 6웰 플레이트의 시드 통로 2(P2) 세포. 각 웰에 2mL의 완전 배양 배지를 추가합니다. 세포가 약 80% 합류점에 도달하면 배양 배지를 버리고 1mL의 PBS로 각 웰을 두 번 부드럽게 헹굽니다.
- 각 웰에 4% 파라포름알데히드 고정제 1mL를 추가하고 세포를 고정하기 위해 30분 동안 배양합니다. 고정제를 버리고 PBS 1mL로 세포를 두 번 세척합니다.
- 각 웰에 헤마톡실린 염색제 1mL를 추가하고 15분 동안 배양합니다. 염색 용액을 버리고 PBS 1mL로 웰을 2-3회 헹굽니다.
- 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 헤마톡실린 염색이 너무 어둡게 보이면 1% 염산 알코올을 사용하여 과도한 세포질 염색을 구별하고 제거합니다. PBS 1mL로 2-3회 세척합니다.
- 각 웰에 에오신 염색 용액 1mL를 추가합니다. 약 30초 동안 또는 원하는 색상 강도에 도달할 때까지 현미경으로 염색을 관찰합니다. PBS 1mL로 웰을 2-3회 헹굽니다. 중성 수지를 사용하여 슬라이드에 커버슬립을 장착합니다.
4. 면역형광 염색
- 사전 배치된 멸균 커버슬립이 포함된 6웰 플레이트에 P2 세포를 2 x 10웰당 5개의 세포로 시드합니다. 각 웰에 2mL의 완전 배양 배지를 추가합니다.
- 세포가 약 80% 합류점에 도달하면 배양 배지를 폐기합니다. 커버슬립을 제거하고 염색 용기에 넣습니다. PBS 1mL로 커버슬립을 5분씩 3회 세척합니다.
- 세포를 덮기 위해 약 50μL의 투과화 용액(Triton X-100: PBS = 1:200)을 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양한 다음 PBS 1mL로 5분씩 3회 세척합니다. 약 50 μL의 3% BSA 차단 용액을 첨가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
- 차단 용액을 부드럽게 버리십시오. PBS에서 준비된 약 200μL의 1차 항체 용액을 추가하여 AQP4(1:100), Kir4.1(1:200), GS(1:200), CRALBP(1:50) 또는 Vimentin(1:200)을 슬라이드를 덮습니다. 커버슬립을 가습실에 넣고 4°C에서 밤새 배양합니다.
- PBS 1mL로 커버슬립을 5분씩 3회 세척합니다.
- 약 200μL의 FITC 표지 염소 항토끼 IgG 2차 항체17을 추가합니다. 실온에서 어두운 곳에서 50분 동안 배양합니다. PBS 1mL로 커버슬립을 5분씩 3회 세척합니다.
- 10분 동안 DAPI로 핵을 염색합니다. PBS 1mL로 5분씩 3회 세척합니다.
- 슬라이드에 페이드 방지 장착 매체 한 방울을 추가합니다. 커버슬립 셀 면이 아래로 향하게 하여 장착합니다. 형광 현미경으로 밀봉하고 관찰하십시오.
5. 유세포 분석
- 유세포 분석 염색 버퍼를 사용하여 세포 농도를 1.0 x 107 cells/mL로 조정합니다.
- 100 μL의 단일 세포 현탁액을 조건에 따라 두 개의 개별 샘플 튜브로 분취합니다. 하나의 튜브를 음극(염색되지 않은) 대조군으로 지정합니다.
- 각 튜브에 100μL의 투과성 배지 A(시판된 키트에서 발췌, 재료 표 참조)를 추가합니다. 부드럽게 섞어 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 각 튜브에 사전 냉각된 유세포 분석 염색 완충액 3mL를 추가합니다. 상온에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다.
- 100μL의 투과 배지 B(상업적으로 입수한 키트에서)를 각 튜브와 와류에 추가하여 혼합합니다. 지정된 샘플 튜브에 0.1μL의 CRALBP 항체를 추가하고 해당 튜브에 0.8μL의 GS 항체를 추가합니다. 음성 대조관에 항체를 추가하지 마십시오. 4 ° C에서 30-60 분 동안 어두운 곳에서 배양하십시오.
- 각 튜브에 3mL의 유세포 분석 염색 완충액을 추가합니다. 상온에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다.
- 각 튜브를 100μL의 유세포 분석 염색 완충액에 재현탁합니다. 각 CRALBP 염색 튜브에 1μL의 FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG(H&L)를 추가하고, 각 GS-stained tube에 1μL의 PE 접합 염소 anti-rabbit IgG(H&L)를 추가합니다. 음성 대조관에 항체를 추가하지 마십시오. 4 ° C에서 30-60 분 동안 어두운 곳에서 배양하십시오.
- 각 튜브에 3mL의 유세포 분석 염색 완충액을 추가합니다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다.
- 각 튜브를 300 μL의 유세포 분석 염색 완충액에 재현탁합니다. 유세포 분석을 즉시 진행하십시오. 또는 500μL의 1%-4% 파라포름알데히드에 재현탁하고 어두운 곳에서 2-8°C에 보관한 후 24시간 이내에 분석합니다.
- 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 negative 및 positive 샘플을 분석합니다.
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결과
일차 세포를 배양 플라스크에 파종한 후, 후속 배지 변화 및 계대 배양은 부착성이 떨어지는 RMC를 제거하고 계대 배양 중에 생성된 세포 파편을 제거하여 배양에서 RMC 집단을 풍부하게 하는 데 도움이 됩니다. RMC는 도립 광학 현미경(그림 1)과 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색(그림 2)을 사용하여 형태를 기반으로 식별되었습니다. 단백질 발현을 관찰하기 위해 GS, Vimentin, CRALBP, AQP4 및 Kir4.1에 대한 특정 항체를 사용하여 면역형광 염색을 수행했습니다(그림 3). 또한 RMC 집단의 순도를 측정하기 위해 GS 및 CRALBP 항체 라벨링을 사용하여 유세포 분석을 수행했습니다(그림 4).
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토론
이 논문은 신생아 SD 랫트에서 원발성 RMC를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 사전 실험 준비, 안구 적출, 망막 조직 분리 및 RMC 추출, 배양, 계대 형성 및 식별을 위한 단계별 절차를 포함한 모든 단계를 다룹니다. 또한 전체 세포 배양 과정에서 관찰해야 하는 주요 고려 사항을 강조하여 관련 연구를 위한 표준화된 기술 지침을 제공합니다.
RMC 추출을 위해 3-5일 된 신생아 SD 쥐를 선택했습니다. 이 연령대의 쥐는 안구의 크기가 작기 때문에 안구 분리 및 망막 조직 추출 절차는 높은 기술적 숙련도를 요구하는 중요한 운영상의 문제를 야기합니다. 특히 조직 크기가 작으면 1차 세포 수율이 낮아집니다. 또한, 계대 수가 증가함에 따라 배양27 중에 세포 생존율이 점차 감소하며, 후속 연구에 필요한 세포 수를 달성하기 위해 더 많은 실험 동물을 사...
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공개 사항
모든 저자는 이 기사의 내용과 관련된 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 쓰촨성 자연 재단 기금(2023NSFSC0690)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.1% Triton X-100 | Solarbio | T8200 | |
| 0.25% 트립신-EDTA | 하이클론 | SH30042.01B | |
| 1% 염산 알코올 | BIOSYSTEMS | 3803651E | |
| 4% 파라포름알데히드 | Solarbio | P1110 | |
| 45μ m 나일론 메쉬(300 메쉬) | Solarbio | YA0926 | |
| 6웰 플레이트 | Servicebio | IMC202302001 | |
| 6cm 유리 페트리 접시 | Normax | 5058541 | |
| 75% 알코올 | KESHI | GEA004 | |
| 아쿠아포린-4(AQP4) | Proteintech Group, Inc | 16473-1-AP | |
| BSA | Servicebio | GC305010 | |
| 세포 배양 인큐베이터 | Thermo | FORMA311 | |
| 세포 레티알데히드 결합 단백질(CRALBP) | HUABOI | HA721330 | |
| 원심분리기 | 후난 Xiangyi | TDZ5-WS | |
| 클린 벤치 | ZHICHENG | ZHJH-C12 | |
| 각막 가위 | Jinzhong | BXGJ | |
| DAPI | Solarbio | G1012 | |
| D-행크 솔루션 | Solarbio | H1045 | |
| DMEM 고포도당 중지 | Gibco | C11995500BT | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Sbjbio 생명과학 | BC-SE-FBS01 | |
| FIX& PERM 미디엄 A | MultiSciences | GAS006/2 | |
| FIX& PERM 배지 B | MultiSciences | GAS006/2 | |
| 유세포 분석 염색 완충액 | MultiSciences | S1001 | |
| Fluoromount-G 형광 마운팅 미디어 | SourthernBiotech | 0100-01 | |
| 글루타민 합성 효소 다클론 항체 Proteintech | Group, Inc | PTG-11037-2-AP-50ul | |
| 염소 324 항토끼 IgG H& L PE | Bioss | bs-0295G-PE | |
| 염소 안티 - 323 토끼 IgG H& L FITC | Bioss | bs-0295G-FITC | |
| 헤마목실린 에오신 (HE) 염색 키트 | Solarbio | G1120 | |
| 고압 소독기 | zealway (xiamen) 기기 Inc | GI80DS | |
| 도립 형광 현미경 | Nikon | SMZ1500 | |
| 반전 위상차 현미경 | Leica | DMIL | |
| 내향 정류기 칼륨 채널 4.1 (Kir4.1) | Proteintech Group, Inc | 12503-1-AP | |
| 중성 수지 | Solarbio | G8590-100 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액 (100×) | Hyclone | SV30010 | |
| Phosphate Buffer 식염수(PBS)(pH7.2-7.4) | Solarbio | P1020-500ml | |
| 2차 항체(FITC 표지 염소 항토끼) | Servicebio | GB22303 | |
| Sprague-Dawley 쥐 | 청두 Dashuo 실험 동물 유한 회사 | 생산 허가 번호: SCXK [쓰촨성] 2020-0030 | |
| T25 배양 플라스크 | Cornning | 430639 | |
| 토네이도 튜브: 15mL | WHB | WHB-15-1 | |
| 토네이도 튜브: 50mL | WHB | WHB-50-1 | |
| 자외선 소독 살균기 | GEMEISI | xd06 | |
| Vimentin | Abcam | ab92547 |
참고문헌
- Bringmann, A., Pannicke, T., Grosche, J., et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Kugler, E. C., Greenwood, J., MacDonald, R. B. The "neuro-glial-vascular" unit: The role of glia in neurovascular unit formation and dysfunction. Front Cell Dev Biol. 9, 732820(2021).
- Reichenbach, A., Bringmann, A. Glia of the human retina. Glia. 68 (4), 768-796 (2020).
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