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방법 논문

손실된 분율 평가: 수생 시스템에서 미세 플라스틱(1-300μm)의 다양성, 풍부도 및 질량

533 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68148

⸱

2025년 8월 22일

 ,  , 
1School of Marine and Atmospheric Science, Stony Brook University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 미크론 크기(1-300μm) MP를 검출, 식별 및 정량화하기 위해 필터에서 수집된 수생 샘플에 적용할 방법론을 설명합니다. 라만 현미경 분광법은 MP 입자의 고분자 화학 구조를 식별하고 물 샘플의 입자 수와 질량 측면에서 풍부도를 정량화할 수 있습니다.

초록

여기에 제시된 프로토콜은 직경이 ~1μm인 미세 플라스틱(MP)의 정량화, 폴리머 유형의 정확한 식별 및 입자 부피의 추정을 가능하게 하여 MP 질량을 계산할 수 있습니다. 뉴욕주 그레이트 사우스 베이(GSB)에서 수집된 샘플의 대표적인 결과에 따르면 1-6μm 등가 구형 직경(ESD) 범위 내의 입자가 가장 풍부했으며 입자의 약 75%가 5μm 미만인 것으로 나타났습니다. 특히, 사전 체질 단계에서 60μm보다 큰 입자를 생성하지 못했으며, 이는 샘플링된 해안 지역에서 큰 MP가 드물다는 것을 시사합니다. 여과 전에 화학적 산화 단계를 사용하여 유기 파편을 제거했으며, 이는 개별 병에서 수집된 샘플에서 더 많은 양의 물(>1L)을 여과하고 필터 막힘을 줄였습니다. 이 접근 방식은 여과 효율성을 크게 향상시켰지만 샘플 준비 및 데이터 분석에 필요한 총 시간을 줄이기 위해 방법론의 측면은 여전히 개선이 필요합니다. 라만 현미 분광법 및 관련 데이터 처리는 특히 복잡한 환경 매트릭스에서 10μm보다 작은 입자를 정확하게 분석하는 데 시간 집약적입니다. 지속적인 노력은 분석 불확실성을 최소화하고, 입자 계수 정확도와 처리 시간 간의 균형을 최적화하고, 검출 워크플로의 아티팩트를 줄이는 데 중점을 두고 있습니다.

서론

미세플라스틱(MP)은 크기, 모양, 색상, 밀도, 화학적 조성 및 기타 물리적 특성이 매우 다양한 매우 이질적인 입자 그룹으로, 식별 및 정량화가 특히 어렵습니다1. MP 조사에는 광학 현미경2 과 같은 시각적 기술부터 열분해-가스 크로마토그래피3와 같은 고급 화학적 접근 방식에 이르기까지 다양한 분석 방법이 사용되었습니다. 광학 현미경은 단순성, 속도 및 비용 효율성으로 인해 더 큰 MP(일반적으로 0.5-5mm)를 특성화하는 데 일반적으로 사용되는 방법입니다1. 표면 형태 및 구조에 대한 정보를 제공하는 동시에 플라스틱과 유사한 입자를 시각적으로 식별하고 정량화할 수 있습니다2. 그러나 이 기술은 화학 성분에 대한 화학적 정보를 생성하지 않으며 분석가의 전문 지식에 의존합니다. 오인은 특히 작고 투명한 입자의 경우 20%에서 70%에 이르는 보고된 오류율과 함께 잘 문서화된 시각적 분석의 한계입니다. 이러한 오류는 환경 샘플의 MP 농도를 상당히 과대평가할 수 있습니다4.

한편, 질량 분석법(MS)과 결합된 열분해-가스 크로마토그래피(GC)는 열분해 생성물을 분석하여 MP의 화학 성분에 대한 자세한 정보를 제공할 수 있습니다3. 열 탈착 단계와 함께 사용하면 동일한 분석 중에 플라스틱 첨가제도 검출할 수 있습니다5. 그러나 이 방법은 플라스틱과 유사한 입자를 수동으로 사전 선택하고 열분해 시스템에 신중하게 배치해야 하므로 시료 처리량이 낮아집니다1.

기존 방법의 한계를 극복하기 위해 MP의 식별과 정량화를 모두 가능하게 하는 자동화 기술이 점점 더 중요해지고 있습니다. 라만 및 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광법은 고유한 스펙트럼 지문 6,7,8을 통해 정확한 폴리머 식별을 제공합니다. 이러한 진동 분광법은 빛, 라만의 경우 레이저 및 FTIR의 경우 적외선에 의해 유도된 분자 진동을 감지하여 특정 분자 구조를 반영하는 스펙트럼을 생성합니다7. 두 기술 모두 다양한 환경 매트릭스에서 작은 MP 입자(<300μm)의 검출 및 특성화를 크게 발전시켰습니다8. 플라스틱과 같은 입자를 화학적으로 확인하여 위양성을 줄이고 위음성을 최소화하며 비파괴적입니다. 현미경(현미경 분광법)과 결합하면 이러한 기술을 통해 0.3mm보다 작은 고분자 입자를 식별하고 정량화할 수 있습니다(μFTIR은 ~10μm까지, μRaman은 ~0.3μm까지 검출함)8. 그러나 각 방법에는 한계가 있습니다: 라만은 특정 폴리머(예: 폴리스티렌)에 대해 더 높은 공간 분해능과 향상된 검출을 제공하지만 형광 간섭에 더 취약하고 일반적으로 더 긴 획득 시간이 필요합니다. 그럼에도 불구하고 라만 현미경 분광법은 0.3μm보다 작은 입자를 검출할 수 있어 FTIR 이미징 8,9보다 더 넓은 미세플라스틱 크기 범위를 커버합니다.

여기에 설명된 작업의 주요 도구는 SoMAS의 NAno-Raman Molecular Imaging Laboratory(NARMIL)에서 사용할 수 있는 공초점 라만 미세 분광 광도계입니다. 이 프로토콜은 플랑크톤 또는 쥐가오리 그물을 사용하여 해양 플라스틱을 샘플링할 때 일반적으로 제외되는 물 샘플의 필터에서 마이크로 크기의 MP(<300μm)를 감지, 식별 및 정량화하도록 최적화되었습니다. 또한 비플라스틱 잔류물(유기 파편)의 존재를 줄이기 위해 화학 산화 공정이 필요합니다. 이는 라만 미세 분광 분석 전에 분석 간섭을 최소화하고, 중요한 것은 필터 기공의 막힘을 방지하여 더 많은 양의 물을 여과할 수 있다는 것입니다. 이 기술을 사용하면 물 샘플에서 필터에 수집된 서브미크론에서 밀리미터 크기 분율의 MP 입자를 검출할 수 있으며 특정 MP 농도, 입자 크기 및 질량을 계산할 수 있습니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 원래 버전9에서 수정되었습니다. 이 프로토콜은 필터에서 MP(<300μm)를 추출, 검출 및 정량화하기 위해 수생 샘플(식수, 강, 호수, 연안 또는 외해)을 분석하기 위한 지침입니다. 사용된 시약 및 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 품질 관리

  1. 사용하기 전에 0.22μm 멤브레인 필터를 통해 모든 시약을 여과해야 합니다.
  2. 직원이 면 실험실 가운(합성 재료 없음)을 착용하고 샘플 취급 전과 취급 사이에 손을 씻으십시오.
  3. 여과 전과 사이에 여과 장비를 0.22μm 여과된 증류수로 헹굽니다. 사용하지 않을 때는 깨끗한 알루미늄 호일로 덮으십시오.
  4. 현장 블랭크: 세척한 샘플 병에 0.22μm 여과된 증류수를 채우고 환경 샘플처럼 처리합니다.
  5. 실험실 블랭크: 각 샘플 배치와 함께 Al2O3 필터를 통해 0.22μm로 여과된 증류수 1L를 처리합니다.

2. MP 정량화를 위한 천연수 샘플 수집 및 준비

  1. 오염을 최소화하기 위해 모든 샘플 병(Niskin 및 유리 용기 포함)을 0.22μm 여과된 증류수로 미리 헹굽니다.
  2. 수생 시스템의 개별 수주 샘플(>1L)은 유리병(지표수) 또는 로제트 장착형 폴리염화비닐(PVC) Niskin 병(수주)과 같은 표준 샘플링 방법을 사용하여 수집하고 유리병에 직접 옮길 수 있습니다.
  3. 200μm 및 60μm 금속 체를 사용하여 수집된 물을 사전 여과하여 유기 파편을 제거하고 MP를 크기 분율로 분리했습니다.
    참고: 잔류된 입자는 현미경으로 직접 식별할 수 있습니다.
  4. 60μm 금속 체를 통과하는 물을 유리병에 보관합니다. 나중에 이 분획을 산화알루미늄(Al2O3) 멤브레인 필터(직경 25mm, 기공 크기 0.2μm)에 걸러냅니다.

3. 물 샘플의 화학 산화

참고: 풍부한 생물학적 입자로 인한 분석 간섭을 최소화하기 위해 샘플은 라만 현미 분광 분석 전에 화학 산화로 세척됩니다.

  1. 100mL의 30%(v/v) 과산화수소와 1L의 샘플을 유리 용기에 넣고 완전히 혼합합니다.
    주의: H2O2 는 조심해서 다루십시오 - 강한 산화제는 피부와 눈에 자극을 줄 수 있습니다. 장갑과 고글을 착용하고 실험실 안전 절차를 따르십시오.
  2. 용기를 뚜껑이나 알루미늄 호일로 덮고 60°C의 오븐에 ~10시간 동안 넣습니다.
  3. 샘플을 10분 동안 식힌 다음 아직 따뜻할 때 여과를 진행합니다.

4. 물 샘플 여과

알림: 필터 고유의 취성으로 인해 멤브레인에 접착된 환형 폴리프로필렌 링에 의해서만 필터를 취급하여 장착 및 제거 중에 Al2O3 멤브레인 필터를 구부리지 않도록 주의해야 합니다.

  1. 층류 후드에서 소결 유리 베이스와 금속 클램프가 있는 전체 유리 여과 시스템을 사용하여 1L 샘플과 블랭크를 필터링합니다.
  2. 여과 후 0.22μm의 여과된 증류수로 필터를 헹굽니다.
  3. 라만 분석을 위해 커버슬립 없이 현미경 슬라이드에 필터를 장착합니다.

5. 여과된 MP 입자의 라만 미세 분광 분석

참고: 공초점 라만 미세 분광 광도계 및 해당 소프트웨어는 MP 입자를 식별하고 정량화하는 분석 방법으로 사용됩니다. 이 기기는 수정 된 직립 epifluorescence 현미경, 모든 치수에서 0.1 μm 스텝 크기를 가진 컴퓨터 제어 전동 x-y-z 스테이지, 4 개의 레이저 라인 (457/514 nm Ar + 이온 레이저, 633 nm He/Ne 레이저, 785 nm 다이오드 레이저) 및 1,040 × 256 펠티에 냉각 CCD 검출기로 구성됩니다.

  1. 라만 소프트웨어의 이미지 획득 기능을 사용하여 수생 샘플의 MPS 분석을 위한 기기 구성을 설정합니다.
    1. 레이저: ~9.3mW 레이저 출력에서 633nm He/Ne(50× 대물렌즈를 통해 ).
    2. 격자: 1200라인/mm.
    3. 스펙트럼 범위: 200-2500cm-1.
    4. 노출 시간: 0.7초/스펙트럼.
  2. x 및 y 차원에서 1μm마다 스펙트럼을 가져와 관심 영역(ROI) 내에 그리드를 설정합니다.
  3. 각 ROI를 카메라 이미지에서 100μm x 100μm 그리드(10,000μm2)로 정의합니다.
    참고: ROI 영역은 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 영역이 작을수록 총 분석 시간이 단축됩니다.
  4. 교차 패턴 모델을 사용하여 무작위로 선택된 필터당 ~40개의 ROI를 분석하여 노출된 전체 필터 영역에 걸쳐 MP 공간 분포를 나타냅니다.
  5. 자동화된 데이터 수집 후 소프트웨어의 이미지 획득 기능을 사용하여 각 ROI의 상세한 2D 화학 맵을 생성합니다.
  6. 각 화학 맵에서 소프트웨어 기능에 따라 성분 분석(음이 아닌 최소 제곱 상관 분석법)을 사용하여 MP 입자를 식별하고 정량화합니다.
  7. 스펙트럼을 참조 라이브러리와 비교합니다. 점수가 >60(내부 라이브러리 점수 0-100)인 일치 항목을 확인된 MP로 수락합니다10.

6. MP 입자의 필터 기반 정량적 열거

  1. ~40 ROI의 입자 수를 합산한 후 방정식 111에 따라 샘플 리터(N)당 MP 입자 수를 계산합니다.
    figure-protocol-1(1)
    여기서 Af 는 총 노출 필터 면적(mm2), n 은 검사된 모든 ROI에서 계산된 MP 입자의 총 수, b 검사된 ROI 수, M 1 ROI의 면적 크기(mm2), V 샘플에서 여과된 물의 부피(l)입니다.
  2. 샘플당 계산된 모든 ROI에서 표준 오차를 계산하여 각 샘플의 총 입자 수(N)에 대한 분석 불확실성을 설정합니다.
  3. L당 총 입자 수를 N ± 1S.E.로 보고합니다.

7. 입자 크기, 부피 및 질량 계산

참고: 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 입자의 치수, 면적 및 등가 구형 직경(ESD)을 결정합니다.

  1. 각 입자 이미지에 할당된 총 플라스틱 포지티브 픽셀을 계산하여 면적을 결정합니다.
  2. 이 입자 영역(Ap)을 사용하여 방정식 211을 적용하여 ESD를 계산합니다.
    figure-protocol-2(2)
  3. 방정식 312를 사용하여 각 입자에 대한 이상화된 타원체 부피 추정치를 계산합니다.
    figure-protocol-3(3)
  4. 부피 추정치와 각 플라스틱 폴리머의 공개된 특정 밀도(ρ; g cm3)(즉, M = ρV)를 사용하여 MP 풀에 있는 각 플라스틱 폴리머의 질량(M)을 계산합니다. 질량은 일반적으로 μg/L로 보고됩니다.
    참고: 각 입자에 대한 질량 계산에서 전파되는 불확실성(질량 상대 오차, RE = SD/평균)을 추정하기 위해 다음 방정식13을 적용하여 부피 알고리즘과 평균 밀도 모두에서 분석 불확실성을 고려합니다.
    figure-protocol-4(4)
    여기서 R.E. vol은 선형 회귀 기울기(3차원 및 "2차원 부피")9의 상대 오차(기울기/기울기의 SE)입니다. R.E. den은 특정 입자에 포함된 각 폴리머에 대해 보고된 밀도 값 범위의 상대적 변화(SE/평균)입니다.

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결과

여기에서는 최신 버전의 방법론을 사용하여 얻은 결과가 제시됩니다. 이 방법은 원래의 출원(9,14)에서 수정되었다. 이 기사에 사용된 샘플은 뉴욕주 롱아일랜드의 세 가지 주요 연안 수역인 그레이트 사우스 베이, 페코닉 하구 및 샤인콕 베이의 MP 오염을 평가하는 프로젝트의 일부입니다. 여기에 제시된 결과는 이러한 수역의 수질에 대한 체계적인 평가라기보다는 개선된 방법에 대한 개념 증명 역할을 합니다. 2024년 8월 28일 미국 뉴욕주 그레이트 사우스 베이(GSB)에 위치한 두 관측소의 지표수가 수집되었습니다(그림 1). 각 스테이션에서 작은 용기(~12m)를 사용하여 1.5L의 지표수를 수집하여 유리 용기로 옮겼습니다. 샘플은 스토니브룩 대학교(SoMAS-SBU) 해양대기과학부 실험실에서 처리 및 분석되었습니다.

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토론

이 방법론을 사용하면 필터에 수집된 물 샘플에서 1μm만큼 작은 미세 플라스틱(MP) 입자를 정량화할 수 있어 입자 풍부도, 화학 성분, 크기 및 질량을 자세히 측정할 수 있습니다. 그러나 특히 복잡한 환경 매트릭스에서 10μm보다 작은 입자를 분석할 때 이 접근 방식에 내재된 불확실성의 원인을 인식하고 해결하는 것이 중요합니다.

현재 미세플라스틱(MP) 연구에서 검출 한계(LOD) 및 정량화(LOQ)를 결정하기 위한 표준화된 절차가 부족하다는 점은 해결해야 할 중요한 측면입니다. 특히 절차적 공백 15,16,17,18,19를 포함하여 배경 오염에 대한 현장 결과를 조정하기 위해 다양한

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공개 사항

저자는 이 논문에 보고된 작업에 영향을 미칠 수 있는 알려진 경쟁 재정적 이해관계나 개인적 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 실험실 및 데이터 분석에 도움을 준 Larissa Chraim, Anthony Hill, Alanna Chen, Maya Butkevich 및 Leslie Mejia에게 감사드립니다. 모든 라만 스펙트럼 데이터는 환경 과학 응용 분야에 전념하는 커뮤니티 리소스이며 NSF-MRI 보조금 OCE-1336724로 설립된 SBU의 해양 및 대기 과학 학교의 NAno 라만 분자 이미징 연구소(NARMIL)에서 생성되었습니다. 연구는 스토니브룩 대학교(SBU) 종자 보조금과 SBU 대통령 논문 완성 펠로우십 CF21의 부분적으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
알루미늄 호일 모든 상업 브랜드
분석용 스테인리스강 체Retsch GmbH, 독일DIN 4188
Anodisc 필터왓맨
필터 홀더피셔브랜드-밀리포어 시그마XX1012542
유리병피셔브랜드-밀리포어 시그마02-912-313모든 유리 용기는 샘플링 공정에 적합합니다.
유리 제품 깔때기피셔브랜드-밀리포어 시그마XX1012514
과산화히드로겐 30%과학 혁신7722-84-1
inVia 공초점 라만 미세 분광 광도계 레니쇼
층류 후드Labconco 또는 실험실 사용을 위한 기타 층류 후드
금속 클램프피셔브랜드-밀리포어 시그마XX1012503
금속 집게피셔브랜드-밀리포어 시그마13-820-061
현미경 슬라이드써모 피셔https://www.thermofisher.com/
니트릴 장갑김테크55080-54
니트로셀룰로스 멤브레인 플리터 0.22GVS 필터 기술 1214898
방사형 열 오븐실험실 라인 기기 3609
진공 펌프웰 치25468-01 ᅡ
와이어 5.2레니쇼

참고문헌

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