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방법 논문

지방을 특수 성분으로 전환하기 위한 혁신적인 지방 조직 분획

1.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68152

⸱

2025년 7월 11일

 ,  , 
1Department of Plastic and Cosmetic Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University

이 논문에서

요약

여기에서는 자가 지방 조직을 서로 다른 물리화학적 특성과 기능을 가진 다양한 지방 구성 물질로 변환할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

초록

전통적인 자가 지방 조직 이식은 일반적으로 부피 증강 및 조직 재생에 사용됩니다. 그러나 지방 이식편의 균일한 물리적 및 생물학적 특성으로 인해 다양한 환자 시나리오와 다면적인 요구 사항에서 최적이 아닌 성능을 발휘하는 경우가 많습니다. 자가 지방 이식의 기초를 확장하여 자가 지방 성분 이식이라는 선구적인 접근 방식을 소개합니다. 이 혁신적인 개념은 자가 지방 조직을 다양한 지방 구성 요소로 변환하는 것을 목표로 세심하게 설계된 프로토콜을 통합하며, 각 구성 요소는 다양한 임상 맥락에서 특정 응용 분야를 다루기 위해 맞춤화된 고유한 물리화학적 특성을 특징으로 합니다. 일련의 물리적 방법을 통해 지방 조직은 충분한 단단한 지지력을 제공하는 지방 매트릭스 복합체(AMC), 추가 충전을 위한 고밀도 지방(HDF), 작고 정밀한 주사를 위한 SVF(Stromal Vascular Fraction) 젤, 잔주름 및/또는 안면 회춘 요구를 위한 지방 콜라겐 조각(ACF)으로 변형될 수 있습니다. 이러한 뚜렷한 지방 성분은 정확하고 표적화된 이식 전략에 적합한 고유한 특성을 가지고 있으며, 개별 환자의 요구에 맞는 미묘한 요구를 충족시킵니다. 새로운 지방 조직 분획 프로토콜은 지방 조직 이식에 혁명을 일으킬 수 있는 큰 잠재력을 보여줍니다. 보다 정교하고 맞춤화된 이식을 위한 새로운 관점과 방법론을 제공합니다.

서론

자가 지방 조직 이식은 체적 향상 및 조직 재생에 널리 사용되는 기술로, 공여자 부위 준비, 지방 추출, 가공 및 이식의 발전에 힘입어 1,2,3,4. 그러나 전통적인 지방 이식편의 균일한 물리적 및 생물학적 특성으로 인해 다양한 임상적 요구를 해결하는 데 있어 효과가 제한되는 경우가 많습니다5. 이러한 한계를 극복하기 위해 우리 연구팀은 혁신적인 지방 조직 분획 프로토콜을 개발하여 자가 지방을 뚜렷한 물리화학적 특성과 기능을 가진 특수 성분으로 변환했습니다.

이 프로토콜의 주요 목표는 자가 지방 조직을 특정 임상 문제를 해결하도록 설계된 지방 매트릭스 복합체(AMC), 기질 혈관 분획(SVF) 겔 및 지방 콜라겐 단편(ACF)과 같은 특수 구성 요소로 분획하는 것입니다. 향상된 강성, 높은 세포 밀도 및 콜라겐이 풍부한 제형과 같은 고유한 특성을 가진 구성 요소를 제공함으로써 이 프로토콜은 정확하고 표적화된 이식 전략을 가능하게 합니다 6,7,8,9,10,11.

기존의 지방 이식은 부피 증대에는 효과적이지만 복잡한 임상 시나리오의 미묘한 요구 사항을 충족시키지 못하는 경우가 많습니다. 예측할 수 없는 지방 흡수는 불안정한 볼륨 복원으로 이어집니다. 더욱이, 전통적인 지방 이식편의 균일한 물리적, 생물학적 특성으로 인해 구조적 지지, 정밀한 소면적 주사 수행, 표적 콜라겐 자극 달성과 같은 특정 이식 요구 사항이 있는 부위에 대한 표적 충전을 제공할 수 없습니다. 이러한 문제로 인해 여러 차례의 수술이 필요한 경우가 많아 환자의 통증과 재정적 부담이 증가한다 1,2,5. 이 분획 프로토콜은 기존 지방 조직에서 특정 가치의 함량으로 지방 조직을 특이적으로 풍부하게 함으로써 이러한 한계를 해결합니다. 이 과정을 통해 우리는 맞춤형 특성을 가진 지방 조직 구성 요소를 형성하여 임상의에게 맞춤형 치료를 위한 다양한 툴킷을 제공합니다. 합성 충전제 또는 전통적인 지방 이식과 비교했을 때, 이 접근법은 자가 조직을 활용하여 면역 거부 반응의 위험을 없애고 생체 적합성을 보장한다3. 또한 분별 공정은 구조적 지지를 제공하고 흡수율이 낮은 AMC와 같은 고유한 특성을 가진 구성 요소를 만듭니다. SVF-gel은 정밀한 주사를 제공하고 기질 혈관 분획 세포의 밀도가 높은 것이 특징입니다. 및 ACF는 지방 인자의 방출을 조절할 수 있는 콜라겐 단백질 골격으로, 피부 회춘에 임상적으로 적용할 수 있는 잠재력을 보여줍니다 7,9,11. 이 접근법은 또한 이식편 유지율과 환자 만족도를 향상시켜 반복 시술의 필요성을 줄여줍니다10,12.

치료 결과를 최적화하기 위해 생물학적 조직을 분획한다는 개념은 표적 의료 응용 분야를 위해 혈액을 혈장, 적혈구 및 혈소판으로 분리하는 것에서 볼 수 있듯이 잘 확립되어 있습니다. 최근 몇 년 동안 지방 조직 구성 요소의 연구 및 임상 적용도 점차 발전하고 있습니다 13,14,15,16,17,18. 이 지방 분획 프로토콜은 이러한 원리를 기반으로 하며, 맞춤형 임상 사용을 위해 고유한 특성을 가진 성분을 분리합니다. 임상의는 환자의 해부학적 필요, 원하는 결과(예: 볼륨 확대, 구조적 지지 또는 피부 회춘) 및 사용 가능한 장비를 고려하여 이 방법의 적합성을 결정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 안면 회춘, 흉터 교정 또는 복잡한 재건 절차와 같은 이식 특성에 대한 정밀한 제어가 필요한 경우에 특히 효과적입니다 7,10,12.

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프로토콜

이 연구는 중국 광저우시 난팡 병원(Nanfang Hospital)의 윤리검토위원회(Ethical Review Board)의 승인을 받았다. 지방 조직은 연구 참여에 대한 서면 동의서를 제공한 건강한 기증자로부터 수집되었습니다. 모든 동물 실험은 Nanfang Hospital Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았으며 National Health and Medical Research Council(중국)의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 지방 준비

  1. 전신 마취 및 tumescent 유체 침투
    1. 환자를 전신 마취 하에 둡니다. 정맥 주사 유도 단계에서는 프로포폴(2mg/kg), 펜타닐(1.5μg/kg) 및 로쿠로늄(0.6mg/kg)을 조합하여 투여한 다음 세보플루란(1.5%) 및 레미펜타닐(0.1μg/kg/min)을 사용하여 마취 깊이를 유지합니다. 절차 전반에 걸쳐 BIS 모니터링(목표값 40-60), 순환 매개변수(MAP >65mmHg) 및 EtCO2 (35-45mmHg)를 기반으로 마취 계획을 동적으로 조정합니다.
    2. 압박 지점에서 보호용 패딩을 낀 채 환자를 누운 자세로 눕히고 클로르헥시딘 알코올로 수술 부위를 엄격하게 소독합니다. 감염 위험을 최소화하기 위해 무균 프로토콜을 준수하십시오.
    3. 20mL 주사기를 사용하여 0.06% 리도카인과 0.001% 에피네프린이 함유된 투메센트액을 지방 흡입 부위(예: 복부 또는 허벅지 등)의 피하 조직에 침투시킵니다. 지방 추출의 예상 볼륨에 대한 침투의 2:1 비율을 유지하고, 환자의 특정 해부학적 특성과 시술 영역의 크기에 따라 총 주입량을 조정합니다.
    4. 마취 효과를 확인하여 전체 투메센트 유체 침투를 확인하십시오. 다음 단계를 수행하기 전에 지방 흡입 부위를 찌르거나 꼬집습니다. 환자가 약간의 압력만 느끼면 침투만으로 충분하여 불편함을 줄이면서 지방을 모을 수 있습니다.
  2. 지방 수확
    1. 지방 수집을 위해 직경 3mm의 날카로운 측면 구멍이 있는 1mm 멀티포트 캐뉼라를 사용하십시오. 지방 조직의 손상을 최소화하고 수집된 지방 세포의 무결성과 생존력을 보장하기 위해 -0.75기압의 흡입 압력에서 작업을 수행합니다.
  3. 콜맨 지방 준비
    1. 60mL 주사기에 포집된 지방을 10분 동안 그대로 두어 액체 성분이 용기 바닥에 가라앉도록 합니다.
    2. 하단의 액체 부분을 조심스럽게 버리고 상부의 비교적 순수한 지방층을 모아 혈액 및 tumescent 액체와 같은 불순물을 제거합니다.
    3. 수집된 지방을 60ml 주사기와 원심분리기에 실온에서 3분 동안 1,200 x g 으로 유지하여 구성 요소를 더욱 계층화합니다.
    4. 원심분리 후 바닥의 액체 부분을 다시 버리십시오. Coleman 지방으로 정의되는 지방의 상층을 60-에서 유지하십시오.
      밀리리터 주사기.
  4. High- and Low -density 지방 시료 채취
    1. Coleman 지방의 상부 2/3를 20mL 시험관에 옮겨 저밀도 지방(LDF)으로 정의합니다.
    2. Coleman 지방의 나머지 1/3을 다른 20mL 시험관에 옮겨 고밀도 지방(HDF)으로 정의합니다.

2. 구성 요소 추출

  1. 지방 매트릭스 복합체(AMC) 제제
    1. 슬리브와 3개의 내부 체(1.5mm 필터 스크린 간격)가 있는 필터링 장치를 통해 HDF를 통과시킵니다.
    2. 부속된 조직을 모아 거즈로 둘러싸인 100메쉬 필터 백에서 탈수합니다. 집게로 조직을 집어 올릴 때 조직을 관찰하여 종말을 결정합니다. 겸자 픽업에 명백한 액체 방울이 떨어지지 않으면 탈수가 원하는 효과를 달성했음을 나타냅니다. 최종 제품은 AMC로 확인되었습니다. 나중에 사용할 수 있도록 나머지 HDF를 보관합니다.
  2. 기질 혈관 분획(SVF)-겔 추출
    1. LDF의 기계적 유화: 1분 동안 10mL/s의 속도로 내부 직경이 1.4mm인 암-암 Luer-Lok 커넥터로 연결된 두 개의 주사기 사이에 LDF를 통과시켜 LDF를 기계적으로 유화합니다.
    2. 유화된 LDF를 1,600 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 젤과 같은 물질과 유사한 중간층을 SVF-gel로 수집합니다.
  3. 지방 콜라겐 단편(ACF) 생산
    1. LDF 분쇄: 30,000rpm에서 60초 동안 특수 ACF 추출기에서 LDF를 분쇄하여 뚱뚱한 현탁액을 얻습니다.
    2. 필터링: 지방 현탁액을 20mL 주사기로 옮깁니다. 0.25mm 단방향 필터에 연결하고 피스톤을 밀어 다른 20mL 주사기에 여과액을 수집합니다. 그런 다음 이 주사기를 0.15mm 단방향 필터에 연결하고 피스톤을 다시 밀어 세 번째 20mL 주사기에 최종 여과액을 수집합니다. 그런 다음 3,000 x g 에서 3분 동안 팻 서스펜션을 원심분리합니다.
    3. 바닥의 단단한 부분을 ACF로 수집합니다.

3. 지방 성분 테스트

  1. 강성 테스트
    1. 범위가 0N에서 225N인 힘 측정 센서와 6mm의 축 방향 이동을 허용하는 전자기 액추에이터가 있는 장치를 사용하십시오.
    2. 각 조직 샘플(AMC 및 Coleman 지방)을 고정하고 25 - 30N의 예압을 적용하여 느슨함을 제거하고 신장을 유발합니다. 램프 하중을 8mm/s로 설정하고 샘플이 전자적으로 파열되기 전에 달성한 가장 높은 힘을 기록합니다. 그런 다음 장치는 조직 강성을 계산합니다.
  2. Hematoxylin 및 eosin (HE) 및 Masson 염색
    1. 구조를 보존하기 위해 샘플을 4% 파라포름알데히드로 고정합니다. 에탄올 그라디언트에서 탈수하여 물을 제거하며, 이는 후속 포매 공정에 필요합니다.
    2. 샘플을 파라핀에 삽입하면 샘플을 얇은 부분으로 쉽게 절단할 수 있습니다. 다음으로, 파라핀 함유 샘플을 절편화합니다.
    3. HE와 Masson의 삼색 얼룩으로 섹션을 염색합니다. 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하여 샘플을 검사합니다.
  3. 이식 연구
    1. 체중이 15 - 18g이고 4 - 6주령(성별에 관계없이)의 건강 SPF 수준인 70마리의 누드 마우스를 선택합니다. 기관 지침에 따라 쥐를 보관하고, 12시간 라이트/다크 주기의 개별 케이지에 보관하고, 표준 음식과 물을 임의로 제공합니다.
    2. 펜토바르비탈 나트륨(50mg/kg)의 복강내 주사로 마우스를 마취합니다. 발가락 핀치 반사를 사용하여 마취 깊이를 확인합니다. 건조를 방지하기 위해 안구를 바르십시오.
    3. 준비된 AMC 또는 지방 조직(대조군의 Coleman 지방) 0.3mL를 각 마우스의 피하 조직에 주입하여 지방 이식 기준선 역할을 합니다. 동물이 의식을 회복할 때까지 관찰한 다음 우리로 옮깁니다.
    4. 이식 후 7일, 14일, 30일, 60일, 90일째에 접목을 주변 조직과 조심스럽게 분리하여 이식편을 수확합니다. 그들의 부피를 측정하십시오. 이식편의 유지율은 다음과 같이 정의되었습니다.
      유지율(%) = 수확 시 이식 부피/주입 지방 부피(여기서는 0.3mL) x 100%.

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결과

수술 과정에서 수행된 다양한 기계적 시술을 통해 지방 조직을 서로 다른 특성을 가진 별개의 지방 성분으로 성공적으로 변형시켰습니다. 풍부하고 견고한 지지력을 제공하는 AMC(그림 1A), 추가 충전을 위한 HDF(그림 1B), 작은 부위에 정밀한 주입을 위한 SVF-겔(그림 1C), 잔주름 또는 안면 수복 요구 사항을 해결하기 위한 ACF(그림 1D) 순으로 제공됩니다. 지방 성분 물질인 AMC, SVF-gal 및 ACF의 특성과 효능은 철저한 테스트를 거쳤습니다.

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토론

이 지방 조직 분획 프로토콜에는 특수 구성 요소의 성공적인 분리를 보장하는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 첫째, 수확 된 지방 조직의 원심 분리는 고밀도 지방 (HDF)과 저밀도 지방 (LDF)으로 분리하며, 각각은 뚜렷한 세포 및 세포 외 기질 (ECM) 조성을 갖습니다23 , 24 . 생존 가능한 지방세포와 기질 혈관 분획(SVF) 세포가 풍부한 HDF를 추가로 처리하여 높은 콜라겐 함량으로 인해 구조적 지지를 제공하는 지방 매트릭스 복합체(AMC)를 얻습니다7. 반면에, LDF는 기계적으로 유화되어 작은 부위에 정밀하게 주입할 수 있도록 설계된 제품인 SVF-gel을 생산합니다10. 마지막으로, LDF를 기계적으로 분쇄하면 콜라겐이 풍부한 제형인 ACF(Adipose C...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Nature Science Foundation of China)의 지원을 받았습니다(보조금 81801932, 81901976, 81971852, 81772101, 81901975).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.001% 에피네프린시그마-알드리치E4375
0.06% 리도카인시그마-알드리치L5647
3mm 멀티포트 캐뉼라튤립 의료 제품, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국/
50ml 원심분리기 튜브Corning430829
BOSE ElectroForce 부하 테스트 장치Bose Corporation/
콜라게나제Worthington 생화학LS004176
여성-여성 Luer-Lok 커넥터BD Biosciences309628
필터링 장치(슬리브 및 체 포함맞춤형(Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.)/
GauzeMedline IndustriesMDS093944
헤마트실린/에오신 염색 키트Sigma-AldrichHT110116
Masson's Trichrome 염색 키트Sigma-AldrichHT15
누드 마우스Southern Mdical University/
인산염 완충 식염수(PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
원형 스테인리스 스틸 필터 스크린(0.15mm)Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd./
원형 스테인리스 스틸 필터 스크린(0.25mm)Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd./
멸균 된 100 메쉬 필터 백Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd./
간질 혈관 분획(SVF)-겔 추출기Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd./
트립신써모 피셔 사이언티픽25200056
웨스턴 블롯 분석 키트Bio-Rad1705061
)

참고문헌

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