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방법 논문

육상 기후에서 튀르키예에서 푸사리움 시들음병과 뿌리썩음병의 존재에 대한 렌즈콩 밭 스크리닝

857 조회수

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DOI:

10.3791/68156

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2025년 4월 11일

 ,  ,  , 
1Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Yozgat Bozok University, 2Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, University of Tokat Gaziosmanpaşa, 3Department of Field Crops, Faculty of Agriculture, Yozgat Bozok University

이 논문에서

요약

요즈갓(Yozgat) 지방에서 실시된 한 연구에서는 시들음병과 뿌리썩음병과 같은 곰팡이 질병과 같은 생물학적 요인이 렌틸콩 생산을 제한하는 것으로 나타났습니다. 푸사리움 분리물은 샘플의 95.4%에서 발견되었으며, 이는 지속 가능한 기술 개발 및 효과적인 제어 전략을 위한 주기적인 현지 조사와 정기적인 모니터링을 시사합니다.

초록

렌틸콩은 중요한 자가수분 콩과 식물 작물입니다. 그것의 생산은 다양한 생물 요인, 특히 시들음병과 뿌리 썩음 복합체를 일으키는 곰팡이 제제에 의해 제한됩니다. 이 연구는 토양 매개 Fusarium spp.에 대한 통제 전략을 개발하기 위해 식물 병원성 곰팡이 병원체의 지역 역학 및 병인을 이해하는 것을 목표로 했습니다. 이 연구는 2022년과 2023년 동안 일반적인 푸사리움 종에 의해 유발된 시들음병, 뿌리 및 크라운 썩음병에 대해 Yozgat 지방의 83개 렌틸콩 파종 지역을 조사했습니다. 증상이 있는 렌틸콩 식물은 진균 분리 및 식별을 위해 수집되었습니다. Fusarium isolates는 콜로니 형태에 따라 그룹화되고 PDA 배지에서 배양되었습니다. 또한, Fusarium isolates에서 얻은 게놈 DNA는 PCR을 사용하여 분석하고 NCBI GenBank에 등록된 다른 Fusarium isolates와 비교했습니다. Fusarium 분리물 간의 유전적 관계는 Mega 11 프로그램에서 MP(Maximum Parsimony) 방법을 사용하여 결정되었습니다. 그 결과, 요즈갓 주에서 시들음병과 뿌리썩음병의 평균 발병률과 질병 중증도율은 각각 16.9%와 38.6%로 확인되었다. 푸사리움 분리물은 샘플의 95.4%에서 발견되었습니다. F. oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. acuminatum 및 F. solani isolates 사이에는 99.5%에서 100%의 뉴클레오티드 서열 균질성이 있었으며, 가장 고립된 종은 F. oxysporum이었다. Fusarium isolates의 MP dendrogram은 두 가지 주요 분기로 나뉘었으며 첫 번째 분기에는 모든 F. solani isolates가 포함되었습니다. 두 번째 주요 분기에는 본 연구와 NCBI GenBank에서 분리된 다른 Fusarium 종이 포함되었습니다. 이 연구는 렌틸콩의 억제를 위한 푸사리움 시들음병의 빈도를 결정하기 위해 주기적인 지역 조사를 제안한다. 푸사리움 기반 피해를 적시에 억제하는 것이 질병을 통제하고 렌틸콩 생산 시스템을 보존하기 위해 강력히 제안됩니다.

서론

렌틸콩(Lens culinaris Medik.)은 Fabaceae과에 속하는 작은 식용 곡물 콩과 식물로, 잎이 바늘 모양이고 흰색에서 옅은 자주색 또는 짙은 자주색 꽃을 피우는 서늘한 계절에 자가수분을 하는 작물입니다1. 약 10,000년 전 비옥한 초승달 지대의 메소포타미아 지역에서 인간에 의해 길들여졌으며 지중해 분지와 중앙 아시아를 포함한 신세계로 빠르게 퍼졌으며 나중에 아메리카 대륙에 귀화했습니다2. 세계 렌즈 콩 재배 면적은 약 550 만 헥타르이며 생산량은 660 만 톤입니다3. 튀르키예는 렌틸콩 생산에서 캐나다, 인도, 호주에 이어 4위를 차지했습니다. 튀르키예에서 렌틸콩 재배는 매우 중요하며 전 세계 생산량의 6.7%를 차지합니다. 튀르키예의 총 렌틸콩 생산량은 474,000톤이며 최소 40개 주에서 생산됩니다4. 튀르키예 렌틸콩 생산량의 약 89.5%는 적색 및 녹색 렌틸콩을 구성하며, 이는 아나톨리아 남동부 지역의 겨울 작물의 10.5%를 차지합니다. 나머지 작물은 여름 작물로 재배합니다. 요즈가트(Yozgat, 39.5%), 콘야(Konya, 23.7%), 크르셰히르(Kırşehir, 16.3%), 초룸(Çorum, 7.6%), 앙카라(Ankara, 2.9%) 주가 녹색 렌틸콩 생산에 크게 기여하고 있다4. 렌틸콩 생산은 생물적 및 비생물적 스트레스 요인에 의해 제한될 수 있습니다. 서리와 가뭄은 여름 녹색 렌틸콩 생산에서 가장 흔한 비생물적 스트레스 요인입니다5. Ascochyta lentis, Rhizoctonia solani, R. bataticola, Aphanomyces euteiche, Pythium 및 Fusarium 종에 의해 발생하는 시들음병, 뿌리썩음병 복합체와 같은 곰팡이 질병은 가장 중요한 곰팡이 질병으로, 감염 시기, 숙주 감수성 및 기상 조건에 따라 댐핑 오프, 묘목 마름병, 시들음병 및 뿌리 썩음병을 포함한 질병의 조합을 유발합니다 6,7, 8.

푸사리움(Fusarium)은 토양, 식물 및 유기 기질에서 발견되는 필라멘트 불완전한 곰팡이이며 이러한 병원체 중 세계적인 속입니다9. 그것은 Fusarium 시들음병, 뿌리 고리 썩음병과 같은 다양한 질병을 일으키며, 밀의 Fusarium 머리 마름병, 박과박과의 Fusarium 시들음병, 렌즈 콩 10,11,12를 포함한 대부분의 콩과 식물에서 뿌리 썩음병을 유발합니다. Fusarium spp.에 의해 유발되는 혈관 시들음병, 뿌리 및 뿌리 쇄골 부패병은 전 세계적으로 많은 렌틸콩 재배 지역에서 렌틸콩의 가장 중요한 질병이다10. Fusarium oxysporum은 렌틸콩의 시들음병, 뿌리 및 뿌리 칼라 썩음병과 관련된 가장 흔한 Fusarium 종입니다. 전 세계적으로 렌틸콩 재배 지역에서 F. graminearum, F. sporotrichioides, F. equity, F. acuminatum, F. redolent, F. avenaceum, F. culmorum, F. solani, F. verticillioides에 의해 시들음병, 뿌리병, 크라운썩음병이 발생한다7. Fusarium spp.에 의해 발생하는 시들음병, 뿌리썩음병, 크라운썩음병은 묘목과 성충 단계 모두에서 발생하며 잎의 갑작스러운 시들음, 건조 및 결국 죽음을 유발합니다. 이 질병의 증상으로는 종자 썩음병, 뿌리 썩음병, 위쪽 잎 시들음, 발육 부진, 수축 및 잎 말리기가 있습니다. 꼬투리를 채우는 중기 및 후기 단계에서는 일반적으로 씨앗이 줄어들고 뿌리 증상으로는 성장 저해, 갈색 변색, 원뿌리 끝 손상, 2차 뿌리 증식 등이 있습니다. 모든 사례에서 혈관 조직의 변색이 나타나는 것은 아니다13.

중부 아나톨리아 지역에서는 렌틸콩의 시들음병과 뿌리썩음병 상태에 대한 연구가 제한된 수로 수행되었습니다. Yozgat은 여름에 비해 겨울에 강우량이 풍부한 온화하고 온화한 기후를 가지고 있으며 Köppen과 Geiger14에 의해 Dsb (따뜻하고 습한 육상 기후)로 분류됩니다. 평균 기온은 9.6 °C이며 평균 강수량은 512 mm입니다. Yozgat는 북반구에 위치하고 있습니다. 여름은 6월, 7월, 8월, 9월입니다. 질병을 통제하기 위해 토양 매개 Fusarium spp.에 대한 다양한 방제 전략을 개발하기 위해 질병을 유발하는 식물 병원성 곰팡이 병원체의 지역 역학 및 병인에 대한 정보를 얻는 것이 매우 중요합니다15. 이러한 맥락에서 본 연구의 목적은 전체 녹색 렌틸콩 생산의 약 40%가 병원성 푸사리움(Fusarium )인 요즈갓(Yozgat) 지방에서 조사를 수행하여 렌틸콩의 시들음병, 뿌리병, 크라운썩음병의 질병 매개변수(질병 유병률, 발병률 및 중증도)를 결정하고 식별하는 것입니다 렌틸콩에서 시들음병과 뿌리썩음병을 유발하는 종은 형태학적 및 분자 분석을 통해 발생하며, 병원성 테스트를 수행하여 Fusarium 종의 개별 독성 수준을 결정합니다.

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프로토콜

참고: 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 현장 조사, 샘플링 및 곰팡이 격리

참고: Endes16에 따르면 조사 작업은 2022년과 2023년에 수행되었습니다. 요즈갓(Yozgat) 주의 9개 지역을 포괄하는 총 83개의 렌틸콩 재배 지역에서 시들음병, 뿌리썩음병(root collar rot disease)이 관찰되었다(그림 1).

  1. 1000m2 이상의 면적을 샘플링 영역으로 선택한 렌틸콩 밭을 선택합니다. 1m2 프레임을 사용하여 대각선을 따라 지그재그로 걸어 경계에서 필드의 중앙 또는 중앙까지 무작위로 걸어 각 샘플을 수집하고 무작위로 선택된 최소 3 개의 다른 지점에 무작위로 배치합니다. 각 지점에서 질병 증상을 보이는 렌틸콩 식물을 수집하여 종이 봉지에 넣고 곰팡이 분리 및 식별 연구에 사용하기 위해 실험실로 옮깁니다.
    참고: 실험실로 옮겨진 병든 렌즈콩 식물의 뿌리와 뿌리 고리는 먼저 거친 잔류물을 제거하기 위해 수돗물로 씻었습니다. 나중에, 그들은 Endes16에 의해 설명 된대로 곰팡이 병원체의 격리를 위해 표면 소독을 받았다.
  2. 병든 식물 조직을 70% 에탄올에 10-15초 동안 담근 다음 멸균수에서 각각 3분 동안 3번 헹굽니다. 1% 차아염소산나트륨(NaOCl)에 모두 5분 동안 담갔다가 멸균수로 다시 3분씩 5분씩 헹굽니다.
  3. 멸균 캐비닛의 여과지에 젖은 식물 조직을 건조시켜 표면 소독 과정을 마칩니다. 그런 다음 소독된 식물 조직을 5-10mm 길이의 조각으로 자르고 페트리 접시(직경 90mm) 내에 0.01% 스트렙토마이신이 포함된 PDA 배지에 4-5개를 놓습니다. 페트리 접시를 25 ± 1 °C의 어두운 곳에서 4-7 일 동안 인큐베이터에 넣고 곰팡이 성장을 관찰하십시오.
    참고: 발달 중인 곰팡이 분리물은 단일 포자 분리 방법을 통해 정제되었습니다. 이를 위해, Ascomycetes, Basidiomycetes, Coelomycetes, Hyphomycetes에 속하는 진균의 단일 포자 배양액을 수득하는 것에 대해 Choi et al.17 에 의해 수행된 연구를 아래와 같이 수정하여 사용하였다.
  4. 진균 분리물을 정제하려면 분리 연구가 끝날 때 얻은 진균 분리물을 인큐베이터에서 25 ± 1°C에서 12시간 동안 형광등/12시간 암흑에서 15일 동안 보관하여 PDA에서 아나모픽 생식 구조의 형성을 촉진합니다.
  5. 주걱으로 15일 된 배양액에서 약 100mg의 곰팡이 균사체의 무게를 측정하고 1.5mL 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 옮긴 다음 균질화를 위해 멸균 플라스틱 절굿공이로 철저히 분쇄합니다.
  6. 멸균수 1mL를 넣고 포자가 물로 이동하도록 1분 동안 와류를 넣습니다. 물로 이동하는 포자의 수를 조정하려면 이 혼합물을 피펫으로 20μL를 추출하고 광학 현미경의 10배 배율에서 포자 수를 확인합니다.
  7. 포자의 양이 원하는 양보다 많을 때 포자-물 혼합물을 1/10, 1/100, 1/1000과 같은 비율로 희석합니다. 현미경 시야에 4-6개의 포자를 포함하는 혼합물을 제공합니다.
  8. 준비된 포자 현탁액 100μL를 0.1% 스트렙토마이신이 보충된 PDA 배지가 포함된 90mm 직경의 페트리 접시로 옮깁니다. 그런 다음 Drigalski 주걱으로 PDA에 전달된 현탁액을 펴 바릅니다.
  9. 준비된 페트리 접시를 25 ± 1 ° C의 어둠 속에서 12-24 시간 동안 배양합니다. 이 기간이 끝나면 접종 루프가 있는 단일 분생포자에서 발달한 작은 균사 조각을 PDA 배지를 포함하는 새로운 페트리 접시로 옮깁니다. 각 포자에서 얻은 각 배양물은 단일 포자 배양물입니다. 병원성 테스트와 형태학 및 분자 식별에 사용하기 위해 보관하십시오.
    참고: 주요 목적은 곰팡이 분리체의 형태, 유전학 및 독성을 변경하지 않고 오랫동안 살아 있게 유지하는 것입니다. 저장 과정은 두 가지 다른 방법을 사용하여 수행되었습니다18,19. 이 연구에서 사용된 모든 저장 방법은 아래에 자세히 설명되어 있습니다.
    1. 샘플을 저장하는 첫 번째 방법은 다음과 같습니다. 12:12 시간 어둠과 함께 25 ± 1 ° C에서 PDA 배지에서 곰팡이 분리 물을 성장시킵니다 : 15 일 동안 밝게 하여 멸균 수에 저장할 수있는 4mm 직경의 균사체 디스크를 얻습니다.
    2. 앞서 언급한 조건에서 자란 곰팡이 배양에서 코르크 천공으로 균사체 디스크(직경 4mm, 디스크 10개)를 자릅니다. 균사체 디스크를 1mL의 멸균수가 들어 있는 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 샘플을 마이크로 원심분리기 튜브에 담아 -20°C의 냉장고에 6개월 동안 보관합니다.
    3. 샘플을 저장하는 두 번째 방법은 다음과 같습니다. 먼저 접종 루프로 얻은 단일 포자 배양액에서 순수한 곰팡이 디스크를 한 꼬집어 클로람페니콜, 젖산, 암피실린, 리팜피신, 테트라사이클린, 스트렙토마이신 등이 보충된 PDA가 함유된 페트리 접시에 옮깁니다.
    4. 보관 과정 전에 5-10일 동안 25 ± 1 °C에서 12 h: 12 h 어둡습니다: 밝은 조건으로 성장합니다. 121°C, 15psi의 오토클레이브에서 60분 동안 1cm x 1cm 범용 여과지를 자르고 살균합니다.
    5. 여과지를 동일하거나 선택적인 매체를 가진 새 페트리 접시에 놓습니다. 순수한 곰팡이 배양에서 군체/포자를 잘라내어 각 조각의 맨 위에 놓습니다.
    6. 페트리 접시를 밀봉하고 적절한 성장 조건(위에서 언급한 대로)의 인큐베이터에 넣습니다. 곰팡이 분리물은 여과지에서 천천히 자랍니다. 완전한 집락화를 보장하기 위해 약 15일 동안 배양하십시오.
    7. 여과지에 포자 형성 또는 완전한 집락 형성 후, 개별 종이 조각을 배양 배지가 없는 새 페트리 접시로 옮깁니다. 나중에 여과지와 곰팡이가 완전히 건조 될 때까지 (약 20-30 일) 페트리 접시를 인큐베이터에 넣으십시오.
    8. 건조 후 각 멸균 종이 봉투에 여과지 10장을 넣고 각 봉투에 라벨을 붙이고 이 봉투를 비닐 봉지에 넣고 봉투가 들어 있는 비닐 봉지를 -20°C의 플라스틱 투명 용기에 보관하십시오.
  10. 아래 주어진 공식에 따라 Yozgat에서 렌즈 콩 시들음병, 뿌리 및 크라운 썩음 병의 유병률을 계산하고 각 렌즈 콩 밭의 질병 유병률을 고려한 다음 지방의 지역 이름을 계산합니다.
    질병 유병률 (%) = (a / b) x 100
    여기서 a는 병에 걸린 필드의 수를 나타냅니다. B는 한 구역에서 조사된 필드의 총 수를 나타냅니다.
  11. Bora 및 Karaca20에서 보고한 가중 평균 방법에 따라 질병의 발병률을 계산합니다. 밭의 각 칸에 있는 식물을 세십시오. 각 사각형에서 병에 걸린 식물과 병에 걸리지 않은 식물로 분리하고 아래 주어진 공식에 따라 질병 유병률을 계산합니다.
    질병 유병률 (%) = (x / y) x 100
    여기서 x는 병에 걸린 식물의 수를 나타냅니다. y는 조사된 총 식물 수를 나타냅니다.
  12. Öğüt21의 척도 0-4에 따라 질병 중증도를 계산하며, 여기서 0 = 증상이 없음, 1 = 잎의 25%에서 경미한 수준의 증상이 나타납니다. 2 = 잎의 26%-50%에서 중간 수준의 증상; 3 = 잎의 51 % -75 %에서 심한 백화증 및 시들음; 4 = 매우 심한 백화증 및 시들음 증상 또는 동일한 순서로 75% 이상의 식물에서 건조, 탈락, 성장 지연 또는 죽은 잎(그림 2).
  13. 얻어진 척도 값16과 함께 다음 공식을 사용하여 질병 중증도를 계산합니다.
    질병 중증도(%) = [∑ [ i (ni x vi) / (V) x N)] x 100
    여기서 ni 스케일 값에서의 식물 수; vi 스케일 값; V 가장 높은 스케일 값; N개의 관찰된 총 식물 수; i는 클래스 수를 나타냅니다.

2. 기상 데이터

  1. 설문 조사를 수행합니다. 이 프로토콜의 경우 2022년 5월과 6월, 2023년 기간 동안 설문조사가 수행되었습니다. 2022년, 2023년 및 장기 연도의 3월-7월 기간의 온도, 상대 습도 및 총 강우량 값을 Yozgat의 지방 기상청에서 가져옵니다(표 1).

3. 형태학적 식별

  1. Fusarium isolates의 문화적(군체 색상, 공중 균사체, 균사체 성장률) 및 원추형(원뿔 치수, 모양, 색상 및 중격 수) 특성을 이전 연구의 특성과 비교하고 곰팡이 종을 잠정적으로 식별합니다.
  2. 그룹에서 형태학적 식별에 사용할 대표 샘플을 선택합니다. 위에서 언급한 단일 포자 분리 방법에 따라 이러한 샘플을 정제합니다. 이 기간 동안 Fusarium isolates의 집락 색소 특성과 미시/거대 분생포자 및 클라미도포자 구조를 관찰합니다.
  3. 얻어진 순수한 진균 배양물에서 미시/대분생포자 및 클라미도스포어와 같은 미세형태학적 구조의 형성을 촉진하기 위해 인큐베이터에서 25-30일 동안 25± 1°C 및 12시간: 12시간 어둡음에서 PDA를 배양합니다. 광학 현미경으로 각 Fusarium isolate에 대한 분생포자의 길이와 너비를 측정합니다. 또한 디지털 카메라와 함께 제공된 광학 현미경을 사용하여 분생포자(conidia)의 구조, 모양, 색상 및 격막 또는 격막 없이 문서화합니다.
  4. 위의 관찰을 바탕으로, Leslie and Suerell22에 기술된 바와 같이 Fusarium isolates를 종 수준에 따라 그룹화합니다.

4. 분자 식별

참고: Fusarium isolates의 총 게놈 DNA는 Cenis23의 프로토콜에서 약간 수정된 다음 방법을 사용하여 추출되었습니다. Fusarium 분리물의 PCR 분석 및 전기영동은 Aras 및 Endes24에 의해 기술된 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다.

  1. 곰팡이 게놈 DNA 추출
    1. PDA에서 배양한 Fusarium isolates의 신선한 배양액(10일)에서 멸균 메스로 100mg의 균사체를 긁어낸 다음 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 -20°C에서 밤새 배양합니다.
    2. 하룻밤 배양 후 500μL의 DNA 추출 완충액(200mM Tris-HCl pH: 8.5, 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5% 도데실황산나트륨)을 튜브에 넣고 멸균 플라스틱 절굿공이로 분쇄합니다.
    3. 그 후, 150μL의 3M 아세트산나트륨(NaOAc) pH 5.2를 튜브에 첨가하고 -20°C에서 30분 동안 배양합니다. 이 단계가 끝나면 4,000 x g 에서 10분 동안 튜브를 원심분리합니다.
    4. 원심분리 후 튜브 상단에 있는 상등액 400μL를 새 튜브(1.5mL)로 옮기고 동일한 부피의 이소프로판올(2-프로판올)을 추가합니다. 새 튜브를 -20°C에서 30분 동안 배양합니다. 이 시간 동안 튜브를 5x 또는 6x 부드럽게 섞습니다.
    5. 4,000 x g 에서 10분 동안 원심분리기를 사용하여 게놈 DNA를 침전시키고 튜브에 남아 있는 모든 액체를 버립니다.
    6. 70% 에탄올 1mL를 튜브 바닥에 흰색 또는 크림색 침전물로 게놈 DNA 펠릿에 추가합니다. 튜브를 약 4분 동안 5x-1x 위아래로 부드럽게 혼합하여 튜브의 모든 에탄올을 버립니다. 그런 다음 층류 공기 흐름에서 튜브를 30분 동안 열어 DNA 펠릿의 에탄올을 완전히 증발시킵니다.
    7. 게놈 DNA를 용해하여 장기간 보관하려면 튜브에 50μL의 TE(1M Tris-HCl pH: 8.0, 0.5M EDTA pH 8.0) 완충 용액을 추가하고 65°C의 수조에서 1시간 동안 튜브를 배양합니다. 이 시간 동안 튜브를 8x-10x 위아래로 부드럽게 섞습니다. TE 완충 용액에 용해된 게놈 DNA를 분자 연구에 사용하기 위해 -20°C 급속 냉동고에 보관합니다.
  2. PCR 연구의 경우 올리고뉴클레오티드 프라이머 ITS5 F(5'GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG3') / ITS4 R(5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3')을 사용하여 rDNA25의 ITS 영역을 증폭합니다. 2.5 μL의 10x PCR 완충액, 2.5 μL의 MgCl2 (25 mM), 2.5 μL의 dNTP (2 mM), 0.5 μL의 각 프라이머(10 μM), 2 μL의 템플릿 DNA, 0.5 μL의 Taq DNA 중합효소(1 U/μL, Fermantas) 및 14 μL의 sQH2O를 총 25 μL의 부피로 각 PCR 반응을 수행합니다.
  3. 25μL PCR 반응의 경우 다음 PCR 프로그램을 95°C에서 2분(초기 변성) 동안 실행한 다음 40사이클을 실행합니다. 30초(변성) 동안 95°C, 45초(어닐링) 동안 55°C, 90초(연장) 동안 72°C, 5분(최종 연장) 동안 72°C. 1x TAE (Tris Base - Glacial Acetic Acid - EDTA) 완충 용액에서 준비된 1.5% 아가로스 겔에서 90V에서 1.5시간 동안 전기영동 PCR 제품.
    1. 겔 전기영동을 위한 TAE 완충액을 준비하려면 242g의 Tris 염기를 700mL의 멸균수에 용해시킵니다. 57.1 mL의 빙초산을 첨가하십시오. 100mL의 0.5M EDTA 용액을 넣고 멸균수를 첨가하여 부피를 1L로 조정합니다. 1L 50x TAE 완충액의 최종 pH를 8.5로 조정합니다. 1x TAE 완충액이 작동하도록 하려면 50x TAE 완충액 1부에 멸균수 49부를 추가합니다.
  4. 0.5 μg/mL 에티듐 브로마이드로 겔을 염색하고 UV transilluminator에서 볼 수 있도록 하여 육안으로 검사합니다.
  5. 뿌리와 크라운 썩음병 제제 분리물 사이의 계통발생학적 관계를 조사하기 위해, 공급업체를 통해 양방향(5'-3' 및 3'-5')으로 합성된 PCR에 의한 ITS 유전자 염기서열을 얻습니다. Blast 프로그램을 사용하여 NCBI(National Center of Biotechnology Information) 웹사이트의 유전자 데이터 및 전 세계 다른 Fusarium isolates의 ITS 유전자 염기서열과 염기서열을 비교합니다. 이를 사용하여 아래에 설명된 대로 종 수준에서 분리물을 식별합니다.
    1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov 웹사이트로 이동합니다. 인기 리소스 섹션에서 BLAST 탭을 클릭합니다.
    2. 새 창에서 Nucleotide BLAST 탭을 클릭합니다. 새 창의 Enter Query Sequence(쿼리 시퀀스 입력) 섹션에서 기본 시퀀스를 Fasta 형식으로 입력하고 Job Title(작업 제목) 섹션에 스터디 이름을 씁니다.
    3. 그런 다음 하단의 Choose Search Set(검색 세트 선택) 섹션의 Database 탭에서 Standard databases (nr etc.) 를 선택합니다.
    4. 프로그램 선택 섹션의 최적화 탭에서 매우 유사한 시퀀스(메가블라스트) 를 선택하고 페이지 하단의 BLAST 탭을 클릭합니다.
  6. MEGA 11 계통발생학적 분석 프로그램을 사용하여 분리푸사리움 사이의 계통발생학적 관계를 결정하십시오. ClustalW 프로그램을 사용하여 염기서열을 정렬하고 ITS 유전자26에 대한 최대 간결성에 따라 분리체의 유전적 가계도를 생성합니다.
    1. Mega 소프트웨어를 다운로드하려면 https://www.megasoftware.net 웹 사이트로 이동하여 Mega 소프트웨어를 설치하십시오. MEGA 소프트웨어는 연구 및 교육에 사용할 수 있도록 무료로 제공됩니다.
    2. 먼저 시퀀스를 바탕 화면에 FASTA 형식의 메모장 파일(.txt)로 저장합니다. Mega 소프트웨어 프로그램을 실행하고 ALIGN 탭을 클릭합니다. 창에서 Edit/Build Alignment 를 클릭합니다. 그런 다음 새 창에서 새 정렬 만들기를 선택하고 확인을 클릭하여 확인합니다.
    3. DNA 탭을 클릭합니다. 삭제 1. 창에 자동으로 나타나는 시퀀스를 선택하고 파일 편집으로 이동한 다음 파일에서 시퀀스 삽입 탭을 클릭합니다. 시퀀스가 포함되어 있고 바탕 화면에 있는 메모장(.txt) 파일을 엽니다.
    4. 이 단계에서 모든 시퀀스가 화면에 나타납니다. 먼저 화면에 나타나는 시퀀스 를 클릭 한 다음 CTRL + A로 모든 시퀀스를 표시합니다. 정렬 파일을 열고 거기에서 Clustal W로 정렬 을 클릭하고 확인을 클릭하여 기본 설정으로 프로그램을 실행합니다.
    5. 염기서열 정렬의 차이를 검토한 후 데이터 파일로 이동하여 계통발생 분석을 클릭한 다음 염기서열이 단백질을 합성하는지 여부에 대한 창의 확인란에서 아니오 를 클릭합니다. 우리의 염기서열은 단백질이 ITS 영역에 속하기 때문에 단백질을 합성하지 않습니다.
    6. Mega 소프트웨어의 기본 창으로 돌아갑니다. 계통발생(Phylogeny )을 클릭하고 최대 간결성 트리(Construct/Test Maximum Parsimony Tree(s))를 선택합니다. 새 창에서 계통 발생 테스트에 대해 Bootstrap Method 를 선택하고 Branch 강도를 테스트하기 위해 bootstrap 값 1,000을 입력합니다. Gaps/missing Data Treatment 탭에서 Partial Deletion을 선택하고 MP 검색 방법으로 SPR(Subtree-pruning-Regrafting) 을 선택한 다음 OK 를 클릭하여 작업을 확인합니다.
    7. 분석 결과에 계통 발생 나무가 표시될 때까지 기다립니다.

5. 병원성 시험

  1. 분자 방법으로 확인된 Fusarium 종의 각 대표 종에 대한 병원성 연구를 위해 4개의 분리물을 사용합니다. 에어컨이 설치된 실내에서 24°C, 형광등 16시간/어두운 광주기 8시간, 습도 65%에서 병원성 연구를 수행합니다.
  2. 렌즈 콩 씨앗을 직경 5cm의 45 개의 구멍이있는 검은 색 플라스틱 유리병에 파종합니다. 각 바이알을 1% 차아염소산나트륨에 3분 동안 보관한 다음 멸균 증류수 3회로 헹굽니다. 멸균 캐비닛에서 씨앗을 24 시간 동안 말리고 각 구멍에 하나의 씨앗을 파종합니다.
    참고: 이 질병에 민감한 Kayı 91 품종의 렌즈콩 씨앗은 모든 병원성 검사에 사용되었다6. 접종 방법으로는 묘목 침지 기법이 사용되었다27.
  3. PDA에서 각 분리물의 순수 배양물을 24 ° C에서 7-10 일 동안 배양합니다. 원료 배양에서 배양된 군체를 배지 표면에서 주걱으로 긁어내고 멸균 증류수를 사용하여 포자/균사체 현탁액을 준비합니다.
  4. 4층 무명천을 통한 여과로 현탁액에서 큰 잔류물을 제거하고 혈구계를 사용하여 포자/균사체 농도를 1 x 106 spores/mL로 조정합니다.
  5. 이 단계가 끝나면 바이알에서 이전에 자란 묘목의 뿌리가 2-3개의 진정한 잎이 있을 때 뿌리를 뽑습니다. 수돗물로 씻고 멸균 바늘로 뿌리를 약간 다치게하십시오. 이 묘목을 준비된 포자/균사체 현탁액에 3분 동안 담근 다음 멸균 토양/이탄(2:1, v/v) 혼합물이 들어 있는 플라스틱 바이알에 이식합니다.
  6. 방제로 사용되는 묘목의 경우 뿌리를 뽑고 상처를 입힌 다음 멸균 물에만 담가 심습니다. 접종 3주 후 0-4 척도에 따라 병원성 검사 평가를 실시합니다.
  7. 계산된 질병 중증도 값을 각도 변환을 거친 후 얻은 값을 분산 분석을 수행하고 Tukey의 HSD(p = 0.05) 검정에 따라 평균 간의 차이를 평가합니다. 질병 중증도: 0%-15%의 분리물은 매우 낮은 병독성(LV)으로 평가되었고, 16%-35%의 분리물은 낮은 독성(LV)으로 평가되었으며, 36%-50%의 분리물은 중등도의 독성(O)으로 평가되었으며, 51%-70%의 분리물은 높은 독성(VV)으로 평가되었으며, 71%-100%의 분리물은 매우 높은 독성(VV)으로 평가되었으며, 질병 증상이 없는 분리물은 부생식물 또는 착생식물 분리물로 평가되었습니다.

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결과

질병 매개변수의 결정
Yozgat의 9개 지역을 포함하는 총 83개의 렌즈콩 파종 지역을 1.1984 x 106m2의 면적에 걸쳐 시들음병, 뿌리 및 크라운 썩음병 증상 측면에서 평가했습니다(표 2). 시들음병 또는 뿌리썩음병 증상은 모든 밭에서 나타났습니다. 그러나 요즈갓의 시들음병과 뿌리썩음병 발병률은 16.9%로 나타났으며, 소르군과 사르카야 지역에서는 38.6%의 중증도를 보였다. 이 질병의 상당한 발병률은 Şefaatli(26.4%), Boğazlayan(23.0%), Sorgun(20.1%) 지역에서도 확인되었다. 역설적이게도, 질병 중증도가 가장 높은 지역은 소르군 지역이 45.2%였고, 보다즐라얀이 36.0%, 사르카야가 35.4%로 그 뒤를 이었다. 또한, 679개의 식물이 조사된 표시된 지역의 렌틸콩 밭에서 채취한 샘플에서 질병 증상을 보였다(

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토론

푸사리움 시들음병은 세계 일부 지역에서 심각한 경제적 수확량 손실을 초래하는 것으로 알려져 있다31. 이 질병은 헝가리에서 처음 보고되었고32 이후 이집트, 인도, 미얀마, 네팔, 파키스탄, 튀르키예, 시리아, 미국과 같은 많은 국가에서 보고되었다33. Kumar 등[34 ]은 렌틸콩 시들음병, 뿌리 고리 썩음병이 광범위하게 분포되어 있으며 전 세계적으로 최소 26개국에서 발생하고 있다고 보고했습니다. 최근 연구에서는 인도의 여러 주에서 채취한 병든 렌틸콩 식물에서 12종의 곰팡이를 분리한 결과, F. oxysporum f. sp. lentis 가 가장 중요한 병원체로 확인되었으며(30%), Rhizoctonia bataticola (1...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 프로젝트 번호가 FÇD-2022-1096인 Bozok University Project Coordination Application and Research Center, BAP 단위의 지원을 받았습니다. 이 연구는 Sevim Atmaca의 박사 학위 연구의 일부입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
(S)-젖산머크(Merck100366연구에서 항생제로 사용되었다.
2-프로판올머크109634분자 연구에 사용됩니다.
조정 가능한 마이크로 자동 피펫(0.1-2.5 &마이크로; L)에펜도르프 리서치LB. EP.3123000012소량의 액체를 측정하는 데 사용됩니다.
조정 가능한 마이크로 자동 피펫 세트(2 – 20 & 마이크로; l, 20 – 200 &마이크로; l, 100 – 1.000 & 마이크로; l)Eppendorf ResearchLB. EP.4924000916소량의 액체를 측정하는 데 사용됩니다.
AgarMerck110453곰팡이 배지를 만드는 데 사용됩니다.
아가로스시그마-알드리치18300012전기영동에서 겔 준비에 사용됩니다.
에어컨 실?klimlab은 통제 된 조건에서 식물을 재배하는 데 사용되었습니다.
AmpisilinSigma-AldrichA9393은 연구에서 항생제로 사용되었습니다.
분석 정밀 저울Shimadzu ATX224는 연구에 사용된 고체 물질의 무게를 측정하는 데 사용되었습니다.
오토클레이브 살균기Zealway GF-120DR연구의 모든 단계에서 고체 및 액체 물질을 살균하는 데 사용되었습니다.
양안 현미경Leica DM750형태학적 진단에 사용됩니다.
생물 안전 캐비닛HFsafe Class II A2작업 영역, 사용자, 환경 및 작동의 안전을 보장합니다.
원심DLAB DM1424LB. DL.903001124모양, 크기 및 밀도에 따라 샘플의 입자를 분리하는 데 사용
ChloramphenicolSigma-Aldrich220551연구에서 항생제로 사용되었습니다.
코르크 천공 세트Sigma-AldrichZ165220페트리 접시에서 곰팡이 배양 샘플을 채취하는 데 사용되었습니다.
커버 유리 및 슬라이드ISOLAB075.01.006 / 075.02.005현미경 연구를 위한 준비 과정에 사용되었습니다.
D(+)-포도당 일수화물Merck108342곰팡이 배지 제조에 사용됩니다.
DFC450 디지털 카메라,라이카디지털 현미경 카메라, C 마운트 인터페이스 및 5 메가 픽셀 ccd 센서.
Dm750 쌍안 현미경 라이카MIC5246곰팡이의 형태학적 식별에 사용되었습니다.
DNA 겔 전기영동thermo fisher scientificB2-UVT
Dna 겔 로딩 염료 (6x)Thermo ScientificR0611분자 진단에 사용됩니다.
dNTP mixThermo ScientificR0192분자 연구에 사용됩니다.
Dreamtaq PCR 마스터 믹스 (2x)Thermo ScientificK1082분자 진단에 사용됩니다.
Drigalski 주걱ISOLAB082.03.001페트리 접시에서 자란 곰팡이 배양을 긁어 퍼뜨리는 데 사용되었습니다.
에드타 Thermo Scientific17892분자 진단에 사용됩니다.
에탄올머크100983분자 연구 및 표면 소독 연구에 사용됩니다.
에티듐 브로마이드시그마-알드리치E7637겔 전기영동 중 겔의 DNA를 염색하는 데 사용됩니다.
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)시그마-알드리치E6758분자 연구에 사용됩니다.
여과지ISOLAB107.58.158가축 배양 연구에 사용됩니다.
강제 공기 건조 캐비닛ZHICHENG ZXDS-A-1090배양 공정에 사용됩니다.
흄 후드Elektromag EM1201LB. 그들. EM1201유해한 화학 증기, 가스 및 먼지를 제어하는 데 사용되었습니다.
겔 이미징 시스템Syngene G:BOX Chemi XX6분자 진단에 사용됩니다.
Generuler 50 bp dna ladderThermo ScientificSM0372분자 진단에 사용됩니다.
빙초산Merck1005706분자 연구에 사용됩니다.
글리세롤머크104094곰팡이의 재고 배양에 사용됩니다.
LancetISOLAB048.50.002식물 샘플에서 병든 조직을 제거하는 데 사용됩니다.
염화마그네슘Sigma-Aldrich814733분자 연구에 사용됩니다.
측정 테이프ISOLAB016.07.500액체의 부피를 측정하는 데 사용됩니다.
마이크로 원심분리기 튜브ISOLAB0778.03.001 / 0778.03.002 / 0778.03.003다양한 양의 액체를 저장하는 데 사용됩니다.
PCR 튜브ISOLAB123.01.002PCR 연구에서 DNA 혼합물을 넣는 데 사용되었습니다.
페트리 접시ISOLAB120.13.090곰팡이 배양 성장에 사용됩니다.
피펫 팁ISOLAB005.01.001 / 005.01.002 / 005.01.003 / 005.01.004분석에 사용되는 액체 부피를 이송합니다.
비닐 봉지ISOLAB039.30.005샘플을 실험실로 운반하는 데 사용되었습니다.
플라스틱 냄비ToXA는 식물을 재배하는 데 사용되었습니다.
플라이어, 클램프ISOLAB048.08.130페트리 접시에서 곰팡이가 자란 후 여과지를 봉투에 넣는 데 사용되었습니다.
도자기 모르타르ISOLAB038.02.150곰팡이 균사체를 분쇄하는 데 사용되었습니다.
감자 포도당 한천Condalab1022곰팡이의 식별 및 재배 용.
순수 시스템인간 CORPORATIONLT. 고등법원. NHP009는 연구 전반에 걸쳐 용액 준비 및 분석에 사용되었습니다.
냉장고 (+4 ° C / -20 ° C)Vestel재고 자재 보관에 사용됩니다.
RifampicinSigma-Aldrich557303연구에서 항생제로 사용되었습니다.
아세트산 나트륨Merck106268분자 연구에 사용됩니다.
염화나트륨Merck1064041000분자 연구에 사용됩니다.
나트륨 도데 실 설페이트시그마 - 알드리치436143분자 연구에 사용됩니다.
차아염소산나트륨 용액Merck105614표면 소독에 사용됩니다.
주걱ISOLAB047.33.210페트리 접시에서 자라는 곰팡이 배양을 긁어내는 데 사용되었습니다.
스트렙토믹™ n 설페이트BioShop CanadaSTP101곰팡이 배양 배양에서 오염을 방지합니다.
Teksoll 엑스트라 퓨어TekkimTK.200650작업의 모든 단계에서 소독제로 사용합니다.
TetrasiklinSigma-AldrichT3258은 연구에서 항생제로 사용되었습니다.
Thermal cycler PCRBio? Rad T100게놈 분석에 사용됩니다.
Thoma lamISOLAB075.03.002포자 계수에 사용됩니다.
Tris HCLRoche10812846001분자 연구에 사용됩니다.
TrizmaSigma-AldrichT1503분자 연구에 사용됩니다.
Tween 80Merck822187병원성 테스트의 포자 용액에 사용됩니다.
소용돌이 믹서 vorteksVelp WIZARDLB. VLP입니다. F202A0175액체 부피의 물질을 혼합하는 데 사용됩니다.
수조Memmert WNB 221018-5702DNA 추출 연구에서 배양 중에 사용되었습니다.
)는 는 는 는 는

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