Method Article

인간 CD14+ 단핵구에서 톨러겐 수지상 세포 생성을 위한 면역조절제를 테스트하는 간단하고 효율적인 방법

DOI:

10.3791/68159

⸱

April 11th, 2025

 , 
1Chemical and Biological Engineering Department, Drexel University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

in vitro 에서 naive monocyte 유래 수지상 세포에서 내성 수지상 세포를 생성하는 약리학적 제제의 능력을 평가하고 자가 조절 T 세포 생성을 통해 그 효능을 검증하는 절차를 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

톨러겐 수지상 세포(tolDC)는 수지상 세포(DC)의 하위 집합으로, 조절 T 세포(Treg) 표현형에 대한 미접촉 T 세포에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. TolDC는 현재 세포 치료제 및 내인성 DC에서 tolDC를 유도하는 방법으로 자가면역 및 이식을 위한 치료법으로 연구되고 있습니다. 그러나 현재까지 미성숙 DC에서 tolDC를 유도하는 것으로 알려진 제제의 수는 상대적으로 적고 생체 내에서 Tregs를 생성하는 효능은 일관되지 않았으며, 특히 내인성 DC에서 tolDC를 유도하는 치료법은 일관되지 않았습니다. 이는 내성을 생성하기 위해 새로운 화합물을 탐색할 수 있는 기회를 제공합니다.

여기에서는 in vitro 에서 단핵구 유래 DC(moDC)에서 새로운 면역조절 화합물을 테스트하고 자가 Treg를 생성하는 기능을 검증하는 방법을 설명합니다. 먼저, PBMC를 얻고 상업적으로 이용 가능한 자기 분리 키트를 사용하여 CD14+ 단핵구와 CD3+ T 세포를 분리합니다. 다음으로, 단핵구를 moDC로 분화하고, 라파마이신, 덱사메타손, IL-10 또는 비타민 D3와 같은 확립된 면역조절제로 24시간 동안 치료하고, 프로토콜의 검증으로 단핵구의 내성 마커 변화를 테스트합니다. 마지막으로, 항-CD3/CD28 자극이 있는 상태에서 유도된 tolDC를 자가 T 세포와 공동 배양하고 Treg 집단 및 T 세포 증식의 변화를 관찰합니다. 우리는 이 프로토콜이 이미 분화된 DC를 tolDC로 재프로그래밍하기 위해 새로운 면역조절제의 효능을 평가하는 데 사용될 것으로 예상합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

수지상 세포(DC)는 선천성 면역과 적응 면역 사이의 중요한 매개체입니다. 주로 점막, 피부 및 림프 조직에 상주하는 DC는 주요 항원 제시 세포(APC)입니다1. DC는 외래 단백질을 흡수하여 주요 조직적합성(MHC) 단백질에 전달하여 미성숙한 T 세포에 제공합니다. DC는 인간에서 인간 백혈구 항원-DR(HLA-DR)과 같은 MHC 클래스 II 단백질을 특이적으로 발현합니다. 항원 노출 시 DC의 활성화 상태는 다운스트림 T 세포 반응2에 매우 중요합니다. 미성숙 DC는 박테리아 벽 구성 요소인 지질다당류(LPS)3와 같은 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)이라고 하는 분자 클래스를 인식하는 다양한 패턴 인식 수용체(PRR)를 발현합니다. PRR 자극 시, DC는 성숙한 DC가 되어 CD80, CD86 및 CD40과 같은 중요한 T 세포 공동 자극 단백질을 상향 조절하고 종양 괴사 인자 알파(TNFα)와 같은 전염증성 사이토카인을 분비하여 미접촉 T 세포가 기존 효과기 또는 보조 T 세포로 분화하는 것을 촉진합니다2. 반대로, DC 성숙이 중단되거나 DC가 허용....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플은 환자의 동의하에 펜실베이니아 대학의 IRB(Institutional Review Board)의 사전 승인을 받은 비식별 기증자로부터 펜실베니아 대학교의 인간 면역학 코어에서 얻었습니다.

선택 사항: 이 방법에서는 학술 실험실에서 얻은 갓 분리한 PBMC를 사용했지만, PBMC는 전혈 또는 백혈구 성분 채집이 풍부한 혈액 제제에서 분리할 수 있습니다. 밀도 구배 원심분리법(density gradient centrifugation method)을 사용하는 것이 좋은데, 이는 다른 곳에서 기술된 잘 정립되고 신뢰할 수 있는 방법이기 때문이다23.

1. 단핵구/T세포의 분리 및 moDC 분화

  1. PBMC에서 단핵구 및 T 세포 분리-Day 1
    1. 건강한 기증자로부터 2억 개의 인간 PBMC를 얻습니다. 세포를 15mL 튜브에 보관하고 얼음에 옮겨 놓습니다.
    2. 분취 50mL의 분리 완충액(시판되는 분리 키트에 제공됨)을 원뿔형 튜브에 담습니다....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

당사는 human PBMCs에 대한 프로토콜을 설명하고, 상업적으로 이용 가능한 자기 분리 키트를 사용하여 CD3+ T 세포와 CD14+ 단핵구를 모두 분리하고, GM-CSF 및 IL-4를 사용하여 단핵구를 CD14-, HLA-DR+, CD141+, CD1c+ moDC로 분화하고, 24시간 동안 처리하고, 72시간 동안 anti-CD3/CD28 자극으로 자가 T 세포와 공동 배양합니다. 실험적 회로도는 그림 1에 나와 있습니다.

단핵구/T 세포의 분리 및 moDC 분화
초기 대표 결과의 경우, 2억 개의 인간 PBMC를 펜실베이니아 대학교 인간 면역학 코어(HIC)에서 건강한 기증자 한 명으로부터 구매하여 프로토콜 섹션 1 및 2에 설명된 대로 처리했습니다. 혈액은 1일차에 .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 moDC에서 tolDC를 유도하기 위한 면역조절제의 기능을 평가하고 생체 외 자가 T 세포에서 Tregs를 생성하는 기능을 검증하는 신뢰할 수 있고 다재다능한 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 단핵구는 민감하기로 악명이 높으며 최상의 결과를 얻으려면 이전에 냉동되지 않은 신선한 PBMC에서 얻어야 합니다. 단핵구는 가능한 한 빨리 분리하여 분화 칵테일에 넣어야 합니다. 일반적으로 첫 24시간 동안 단핵구 수율이 낮거나 단핵구 사멸률이 높은 것은 동결/해동 주기 또는 PBMC와 단핵구의 분리 사이의 연장된 기간 때문입니다. 둘째, moDC와 T 세포 배양 배지의 분화에 사용되는 사이토카인은 고품질 공급원에서 가져와야 합니다. 일반적으로 moDC의 분화가 불량한 것은 품질이 낮거나 사이토카인의 농도가 잘못되었기 때문입니다. 셋째, T 세포는 1일째와 7일 사이에 동결하고 순진하고 자극되지 않은 표현.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기증자로부터 새로운 인간 PBMC를 제공한 University of Pennsylvania의 Human Immunology Core(HIC)에 감사드립니다. HIC는 NIH P30 AI045008 및 P30 CA016520에 의해 부분적으로 지원됩니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10 & 마이크로; L 여과된 피펫 팁VWR76322-158일반 세포 배양
1.5 mL 원심분리관VWR77508-358일반 세포 배양
10 mL 혈청학적 피펫VWR414004-267일반 세포 배양
100-1000 & L 여과된 피펫 팁VWR76322-164일반 세포 배양
15mL 원뿔형 튜브VWR77508-212일반 세포 배양
20-200 및 마이크로; L 여과 피펫 팁VWR76322-160일반 세포 배양
2-메르캅토에탄올MP 생물 의학194834T 세포 배양
50 mL 원뿔형 튜브VWR21008-736일반 세포 배양
60 x 15 mm 접시, Nunclon DeltaThermo Fischer150326일반 세포 배양
96 웰 원추형(V) 바닥판, 미처리 표면Thermo Fischer277143일반 세포 배양
96웰 플랫 바닥 플레이트Thermo Fischer161093일반 세포 배양
APC/Cyanine7 항인간 CD272(BTLA) 항체Biolegend344518유세포 분석
Attune NxT(적색/청색 레이저, 7채널)Thermo FischerA24863유세포 분석
BSAThermo Fischer15260-037일반 세포 배양
CD14 단클론 항체 (61D3), PEThermo Fischer12-0149-42유세포 분석
CD1c 단클론 항체 (L161), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0015-42유세포 분석
CD209 (DC-SIGN) 단클론 항체 (eB-h209), PerCP-Cyanine5.5Thermo Fischer45-2099-42유세포 분석
CD25 단클론 항체 (CD25-4E3), APCThermo Fischer17-0257-42유세포 분석
CD274(PD-L1, B7-H1) 단클론 항체(MIH1), PEThermo Fischer12-5983-42유세포 분석
CD4 단클론 항체(RPA-T4), Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42유세포 분석
CD40 단클론 항체(5C3), APCThermo Fischer17-0409-42유세포 분석
CD40 단클론 항체 (5C3), APC-eFluor 780Thermo Fischer47-0409-42유세포 분석
CD69 단클론 항체 (FN50), PEThermo FischerMA1-10276유세포 분석
CD86 단클론 항체 (BU63), FITCThermo FischerMHCD8601유세포 분석
CD8a 단클론 항체 (RPA-T8), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0088-42유세포 분석
원추형 바닥(V-웰) 96웰 플레이트Thermo Fischer2605유세포 분석
저온 바이알, 2mLThermo Fischer430488T 세포 배양
디메틸설폭사이드(DMSO), 시퀀싱 등급Thermo Fischer20688일반 세포 배양
DPBSThermo Fischer14200166일반 세포 배양
EasySep 인간 단핵구 분리 키트줄기 세포 기술19359세포 분리
EasySep 인간 T 세포 분리 키트줄기 세포 기술17951세포 분리
EasySep 자석줄기 세포 기술18000세포 분리
EDTAThermo FischerAIM9260G일반 세포 배양
Falcon 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브, 5mL줄기 세포 기술38025세포 분리
Fc 수용체 결합 억제제 다클론 항체Thermo Fischer14-9161-73유세포 분석
태아 혈청Thermo FischerA5670701일반 세포 배양
고정 가능한 생존율 염료 eFluor 780Thermo Fischer65-0865-18유세포 분석
Foxp3 / 전사 인자 염색 완충액 세트Thermo Fischer00-5523-00유세포 분석
FOXP3 단클론 항체(PCH101), PE-시아닌 5.5Thermo Fischer35-4776-42유세포 분석
HBSSThermo Fischer14170-112일반 세포 배양
열 비활성화 태아 소 혈청Thermo FischerA5670801일반 세포 배양
HEPES(1M)Thermo Fischer15630106moDC 세포 배양
HLA-DR 단클론 항체 (L243), Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009유세포 분석
인간 CD3/CD28/CD2 T 세포 활성제StemCell Technologies10970T 세포 배양
인간 GM-CSF 재조합 단백질Thermo Fischer300-03moDC 세포 배양
인간 IL-10 ELISA 키트, 고감도Thermo FischerBMS215-2HS엘리사
인간 IL-4, 동물성 재조합 단백질Thermo FischerAF-200-04moDC 세포 배양
인간 PBMC(신선하게 분리됨)UPenn HICN/A세포
인간 TNF 알파 ELISA 키트Thermo FischerBMS223-4ELISA
광학 현미경(DMi1)Lucia391240일반 세포 배양
리포다당화물(LPS)Invivogentlrl-eblpsmoDC 세포 배양
LIVE/DEAD 고정 가능한 근적외선 사세포 염색 키트Thermo FischerL34975유세포 분석
MEM 비필수 아미노산 용액 (100x)Thermo Fischer11140050T 세포 배양
페니실린-스트렙토마이신 (100x)Thermo Fischer15140122일반 세포 배양
피펫 컨트롤러VWR77575-370일반 세포 배양
라파마이신, 98+%Thermo FischerJ62473. MFmoDC 세포 배양
RPMI 1640 with GlutamaxThermo Fischer61870-036일반 세포 배양
분리 완충액줄기 세포 기술20144세포 분리
T 세포 자극 칵테일 (500x)Thermo Fischer00-4970-93T 세포 배양
UltraComp eBead Plus 보상 비드Thermo Fischer01-3333-41흐름 세포 분석
가변 피펫 세트Fischer Scientific05-403-152일반 세포 배양
극 소

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18 (1), 767-811 (2000).
  2. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440 (7085), 808-812 (2006).
  3. Anderson....

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