En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

요약

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께< 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

초록

망막의 복잡한 층류 구조는 포괄적인 공간 분자 매핑에 중요한 과제를 제시합니다. 조직 구조 및 분자 상호 작용을 조사하기 위한 현재 기술은 공간 관계를 손상시키거나 분자 프로파일링을 제한하는 기술적 제약에 의해 제한됩니다. 단면 절단, 전체 마운트 준비, 화학적 또는 기계적 분해 및 두꺼운 표면 절편과 같은 기존 방법은 조직 무결성을 방해하거나, 중요한 공간 컨텍스트를 잃거나, 대부분의 경우 고차원 공간 염기서열 분석 플랫폼과 호환되지 않습니다.

이 연구는 망막 세포 분포를 매핑하는 데 필수적인 공간 관계를 유지하면서 얇은(<20μm) en face section을 생성하는 cryosectioning 기술을 소개합니다. 이 방법은 RNA 무결성과 조직 구조를 유지하면서 고처리량 분자 분석 플랫폼과 호환되는 절편을 생성합니다. RNA 무결성은 이 기술이 postfixed tfixed와 관련하여 공식적으로 지원하는 공간 전사체 플랫폼 제조업체가 공식적으로 지원하는 신선한 동결 조직을 절단하기 때문에 유지됩니다. 당사는 여러 분자 프로파일링 방법을 사용하여 이 접근 방식을 검증하여 수동 RNAscope in situ hybridization(12개 표적) 및 Xenium 공간 염기서열분석(300개 표적)과의 성공적인 통합을 입증했습니다. 이 기술은 이러한 민감한 분자 응용 분야에 적합한 RNA 품질을 유지하면서 샘플 전반에 걸쳐 조직 구조를 일관되게 보존합니다.

이러한 방법론적 발전을 통해 망막 세포 유형 분포, 층류 전반의 분자 구배, 망막 병리학의 공간적 측면에 대한 새로운 연구를 수행할 수 있습니다. 이 기술의 다양성과 현대 공간 생물학 플랫폼과의 호환성은 망막의 복잡한 세포 조직에 대한 포괄적인 분자 매핑을 위한 기반을 제공합니다.

서론

망막 뉴런은 정보 처리를 용이하게 하는 공간 지형을 진화시켰으며, 이는 많은 종에서 foveas, area centralis 및 줄무늬와 같은 총체적인 전문화를 초래합니다 ^1,2,3. 잘 알려진 광수용체 분포의 다양성과는 대조적으로, 망막 신경절 세포(Retinal Ganglion Cells, RGC)에 의해 형성된 망막 출력의 공간적 전문화는 명확하지 않습니다. 대부분의 종에서 망막 신경절 세포의 공간 분포는 완전히 알려져 있지 않습니다. 가장 많이 연구된 척추동물 모델은 아닐지라도 틀림없이 하나인 쥐의 경우에도, 망막 신경절 세포세포 아형의 1/3 미만이 전체 산 면역조직화학(whole mount immunohistochemistry)²과 같은 전통적인 기술로 매핑되었습니다. 이러한 기술은 대부분의 망막 신경절 세포(RGC) 아형에는 특정 유전적 마커가 없기 때문에 실패합니다. 대신, 단일 세포 RNA 염기서열분석 ^5,6,7을 통해 정확한 망막 신경절 세포(RGC) 분류⁴를 위해서는 더 높은 차원의 분자 정보가 필요합니다.

망막 신경절 세포(RGC) 분포에 대한 정보는 중요한데, 쥐에서 관찰된 지형은 망막 신경절 세포(RGC) 배치와 시각 기능 사이의 명확한 생태학적 상관관계를 보여주기 때문입니다. 가장 두드러진 예는 측두엽 망막에 모여 있는 ɑON-S 망막 신경절 세포의 공간적 조직입니다. 이 영역은 사냥 행동^{9 동안 먹이}8의 이미지를 받는다. 또한 망막 신경절 세포(RGC) 아형은 질병에 차별적으로 취약하며¹⁰, 녹내장과 같은 일부 흔한 질병은 진행에 공간적 요인이 있다는 것을 잘 알고 있다^11,12. 그러므로, 이 분야가 직면한 중요한 질문은 다음과 같습니다: 망막¹호를 타일링할 때 망막 신경절 아형의 공간 조직은 무엇인가? 이러한 지식의 격차는 현재 다른 시각적 유도 행동 및 질병에 대한 통찰력을 제한하고 있습니다.

현재 방법의 초점은 고해상도 분자 분석을 가능하게 하면서 공간 관계를 보존하는 en face cryosectioning 접근 방식을 통해 이러한 분자 지식 격차를 해결하는 것입니다. 10X의 Xenium과 같은 최신 공간 염기서열분석 플랫폼은 분자 프로파일링의 혁신적인 발전을 대표하며 조직 조직 및 세포 상호 작용에 대한 전례 없는 통찰력을 제공합니다. 그러나 이러한 플랫폼은 RNAscope와 같은 저플렉스 기술 및 Visium과 같은 공간적으로 바코드화된 염기서열분석 방법과 함께 20μm보다 얇은 조직 절편이 필요하다는 중요한 기술적 제약을 공유합니다. 이 요구 사항은 일반적으로 두께가 200μm인 망막 조직에 특별한 문제를 제기합니다.

지금까지 연구자들은 이러한 기술을 망막 조직에 적용할 때 주로 단면에 의존해 왔습니다¹³. 단면은 수직 회로의 맥락에서 핵 및 망상층 내의 분자 관계를 효과적으로 드러내지만, 전체 마운트 준비에서 전통적으로 드러났던 망막 세포의 더 넓은 공간 분포를 포착하는 데는 적합하지 않습니다⁸. 최근 단면 절편에 대한 시도는 단면 두께 제약으로 인해 제한되었으며, 연구에서는 현대의 고플렉스 분자 분석 플랫폼에 비해^너무 두꺼운 50μm 절편만 달성했습니다. 개별 망막 층을 연구하기 위해 사용되었지만 현대 공간 염기서열 분석 기술과 호환되지 않는 다른 역사적 접근 방식으로는 기계적 해리와 결합된 효소 분해 ^15,16 또는 기계적 해리만 사용하는 효소 분해^17,18,19,20 등이 있습니다. 여기에서는 이러한 한계를 극복하는 얇고 구부러진 망막 조직을 위해 특별히 설계된 새로운 동결 절편 기술을 제시합니다. 간단히 말해서, 우리의 방법은 눈의 후방을 추출하고, 망막과 공막을 모두 관통하는 릴리프 컷을 만들고, 내부 망막이 있는 조직을 커버 유리에 대고 평평하게 하고, 조직을 OCT에 삽입하고, 마지막으로 바깥쪽에서 안쪽 망막으로 동결 절제하는 것입니다(그림 1). 당사의 방법은 수동 RNAscope(12개 표적)와 자동화된 Xenium 플랫폼(300개 표적)을 사용한 성공적인 구현을 통해 검증된 바와 같이 고차원 공간 생물학 도구를 사용할 수 있을 만큼 충분히 얇은(<20μm) 절편을 생산하는 동시에 공간 관계를 유지하며, 분자 분석의 다양한 복잡성 규모에 걸친 호환성을 입증합니다.

프로토콜

모든 실험은 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인 및 콜로라도 대학교(University of Colorado)가 감독하는 이러한 방법을 승인하는 관련 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 동물 사용 및 안락사와 관련된 모든 단계는 현지 규정 및 실험 허가를 따라야 합니다. 모든 생쥐는 음식과 물을 무료로 이용할 수 있는 공인된 수의학 시설에서 표준 치료를 받으며 수용되었습니다. 이 en face cryosectioning 기술은 C57BL/6 마우스에 최적화된 표준 망막 박리 기술을 기반으로 합니다. 이 기술을 개발하기 위해 6주에서 2세 사이의 암수 약 150마리의 마우스를 사용했습니다. 여기에서 전달된 마지막 기술은 마우스 인구통계학적 특성에 관계없이 약 95%의 성공률을 보입니다. 단계에 대한 온도가 나열되지 않은 경우 약 20-25°C의 실내 온도가 예상됩니다. 온도가 나열되지 않은 용액은 냉각하면 작동하므로 용액의 작동 온도 범위는 4-25 °C입니다.

1. 해부

1. 이소플루란으로 마우스를 마취하고 발가락 꼬집기로 마취를 검증하거나, 다른 방법도 마찬가지로 적절하므로 마취를 유도하고 확인하기 위해 현지 규칙 및 규정에 따릅니다.
2. 경추 탈구로 쥐를 안락사시키기: 한 손으로는 쥐의 머리를 잡고 다른 손으로는 꼬리 밑부분을 고정한 다음 반대 방향으로 당깁니다. 참수에 의한 2차 안락사를 실시한다.
3. 각막에 있는 지구의 측두극을 브랜딩하여 방향을 유지하고 해부를 위한 약점을 만듭니다(그림 2B 및 그림 3A).
4. 여과지 한 조각(지구본보다 크지만 접시보다 작음)이 들어 있는 접시에 지구본을 Ames 용액에 담그십시오.
   참고: Ames 이외의 용액을 사용하면 망막이 악화될 수 있습니다(그림 4A).
5. 날카로운 #5 집게와 홍채 가위를 사용하여 공막에 구멍을 뚫지 않고 지구에서 모든 근육 조직, 근막, 혈관 구조 및 신경을 조심스럽게 제거합니다(그림 2E, F 및 그림 3B).
   참고: 이 단계에서 공막에 구멍을 뚫으면(그림 4B) 조직 탈출증이 발생합니다(그림 4C).
6. 하나의 홍채 가위날 끝을 각막 브랜드에 수직으로 놓고 가위를 시신경 머리와 평행하게 놓습니다. 이 위치에서 지구본에 구멍을 뚫습니다(그림 3C, D).
7. 각막과 윤부를 한 번 깨끗하게 절개하여 공막과 망막으로 들어가 시신경두를 향해 계속합니다(그림 3E).
   알림: 시신경두를 절단하지 마십시오. 그렇지 않으면 공막과 망막이 분리됩니다. 이 절개의 정확한 길이는 지구의 크기에 따라 달라지며, 이는 늙은 동물과 어린 동물 간에 크게 다를 수 있을 뿐만 아니라 야생형 동물과 관련된 일부 Cre 라인에서도 크게 다를 수 있습니다. 절개 부위의 가장 깊은 부분과 시신경두 사이에 약 1mm의 조직을 남겨두는 것이 좋습니다.
8. 블레이드를 초기 절단(그림 3F, G)에 수직으로 배치하고 가장자리에서 약 1mm 후방(그림 2C)에 배치합니다. 공막과 망막을 방사상으로 절단하기 시작합니다.
   1. 지구를 안내하고 회전시키기 위해 날카로운 집게를 사용하여 가장자리의 뒤쪽과 평행하게 일관된 절단선을 유지하십시오. 절단을 최소화하는 것이 이상적이지만 깨끗한 방사형 경로를 유지하는 것이 우선시됩니다. 망막과 공막이 분리되어 있으면 홍채 가위날의 위치를 변경하여 함께 자릅니다.
      참고: 가장자리를 절단하면 수정체 추출 중에 공막에서 망막이 분리될 수 있습니다. 작은 가위와 회전은 허용됩니다. 고정하기 위해 힘을 가하면 망막 탈장의 위험이 있으므로 피하십시오.
   2. 홍채 가위날의 중간 너비를 사용하여 1mm 후방 거리를 추정합니다. 불확실할 때는 망막과 윤부의 연결이 내부적으로 구부러지므로 더 뒤쪽 위치로 잘못 잡습니다. 더 뒤쪽 절단은 편평한 망막 추출을 용이하게 합니다.
9. 변연계와 평행한 방사상 절단을 완료한 후 나머지 망막 연결을 검사합니다. 전방 및 후방 지구 부분이 분리될 때까지 홍채 가위로 조심스럽게 절단합니다.
10. 두 쌍의 날카로운 #5 집게를 사용하여 지구의 앞쪽과 뒤쪽 부분을 부드럽게 분리합니다(그림 3H). 나이가 많은 쥐에서는 투명한 섬유가 수정체를 망막 컵에 연결할 수 있습니다. 홍채 가위로 조심스럽게 절단하면서 망막-공막 분리를 최소화하십시오.
    알림: 렌즈는 변연계와 각막에 부착된 상태로 유지되어야 합니다.
11. 여과지를 지지 플랫폼으로 사용하여 홍채 가위로 망막을 클로버 잎(철 십자가라고도 함) 패턴으로 자릅니다(그림 3I-K).
    참고: 클로버 잎 절개는 이 절편으로 방향을 기록하려는 경우 가장자리를 통해 처음에 만든 기본 방향 절개보다 짧아야 합니다. 이 세 개의 새로운 요골 절개 부위의 크기를 기본 절개 부위보다 약 1-2mm 짧게 줄이는 것이 좋습니다. 옵신 구배(opsin gradient)와 같은 다른 특징이 방향에 사용되는 경우, 망막과 공막의 분리를 방지하기 위해 절개의 가장 깊은 부분과 시신경두 사이에 항상 약 1mm의 조직을 유지하면서 모든 절개 부위의 길이가 같아야 합니다.
12. 두 번째 눈으로 해부를 반복합니다. 괴사를 최소화하려면 안락사 후 10분 이내에 두 번째 눈의 전방제거를 완료하십시오.

2. 냉동 보존

1. 절개된 망막과 공막(이하 망막이라고 함)보다 큰 구멍을 만들기 위해 팁을 절단하여 일회용 전사 플라스틱 피펫을 준비합니다.
2. 망막을 피펫으로 부드럽게 흡입하여 유리 현미경 슬라이드에 놓습니다. 실험실용 물티슈를 사용하여 망막 주위의 여분의 에임스 용액이 더 이상 자유롭게 떠다니지 않고 평평해질 수 있을 때까지 조심스럽게 제거합니다.
3. 두 개의 날카로운 #5 집게를 사용하여 망막을 펼치고 안쪽 아이컵이 위를 향하도록 평평하게 놓습니다. 조직의 크기에 따라 각 클로버잎 부분을 0.5-2mm씩 릴리프 컷하여 망막을 더 평평하게 만들고 조직이 접히지 않도록 조심스럽게 조정합니다(그림 5A). 액체가 망막에 인접하기만 남을 때까지 추가 Ames 용액을 제거합니다.
4. 커버슬립을 사용하여 망막(그림 5B)을 주변 액체와 함께 빠르게 눌러 전달하여 바깥쪽 공막이 위쪽을 향하고 안쪽 눈컵이 커버슬립에 닿도록, 즉 망막 신경절 세포가 위를 향하도록 합니다(그림 5C).
5. 망막이 접혀 있지 않은지 확인하고 필요에 따라 조정합니다. 더 쉽게 조작할 수 있도록 Ames 솔루션을 추가합니다. 과도한 액체로 인해 조직이 말리게 되므로 실험실 물티슈를 사용하여 여분의 Ames 용액을 모두 제거하고 망막을 5-10초 동안 자연 건조시킵니다.
   참고: 짧은 공기 건조를 허용하지 않으면 냉동 절편 중에 무작위로 조직-OCT 분리가 발생할 수 있습니다. 과도한 공기 건조는 염분 결정 관련 조직 손상으로 이어질 수 있습니다.
6. 망막을 덮기 위해 OCT 배지를 바르고 집게를 사용하여 커버슬립 전체에 이 층을 고르게 펴 망막 부양을 방지합니다. OCT 배지가 망막을 관통할 때까지 30초 동안 기다립니다.
7. 액체 질소 증기로 간접적으로 냉각된 금속판을 사용하거나 드라이아이스와 직접 접촉시켜 망막을 OCT에서 급속 동결(그림 5D)합니다.
8. 망막을 즉시 사용하는 경우 드라이아이스에 보관하고, 장기간 보관하는 경우 -80°C 냉동고에 비닐 봉지나 건조제가 들어 있는 용기에 보관하십시오.

3. 냉동 절편

1. 저온 유지 챔버를 -18°C로 설정하고 스테이지를 -12°C로 설정합니다. 온도와 평형을 이루도록 망막을 챔버에 놓습니다.
2. 시편 척에 OCT 돔을 생성합니다. 동일한 모델의 저온 유지 장치를 사용하는 경우 이 돔이 내부 2-3 환형을 차지하는지 확인하십시오. 일단 얼면 OCT 돔을 다듬어 척의 블레이드와 평행한 평평한 스테이지 표면을 만들어 층류 평탄도를 유지합니다(그림 6A).
3. 척과 저온 유지 장치 단계와 관련된 방향 가이드를 생성하거나 기록해 둡니다.
   참고: 우리가 권장하는 모델 저온 유지 장치에서 방향 가이드는 척 홀더 위의 12시 위치에 새겨진 중심선이고 척 자체에는 가장 바깥쪽 고리에 삼각형 컷이 있습니다. 이러한 기능을 함께 방향 가이드라고 합니다. 저온 유지 장치에 이러한 기능이 없는 경우 영구 마커를 사용하여 직접 만드는 것이 좋습니다.
4. 면도날을 사용하여 망막을 측면으로 둘러싼 여분의 OCT를 제거한 다음 커버슬립에서 망막을 조심스럽게 분리하여 움직일 수 있도록 망막을 옮길 준비를 합니다.
5. 스테이지에서 척을 제거하고 준비된 평평한 OCT 스테이지 표면에 액체 OCT를 소량 떨어뜨립니다.
6. 망막을 액체 OCT에 직접 놓습니다. 미리 냉각된(-18 °C) 유리 슬라이드를 사용하여 망막이 얼 때까지 10-30초 동안 OCT 스테이지에 대해 망막을 누르고 유지합니다.
7. 완전한 접착을 보장하기 위해 망막과 병기에 OCT를 추가로 적용합니다. 저온 유지 장치의 급속 동결 영역에서 동결합니다. 완전한 결합을 보장하기 위해 최소 30분 동안 저온 유지 장치에서 망막/OCT 단계를 배양합니다.
8. 단면화 시작:
   1. 망막이 보일 때까지 여분의 OCT를 조심스럽게 잘라냅니다(그림 6B). 면도날을 사용하여 블록 가장자리에서 과도한 OCT를 제거합니다.
      알림: 항상 s를 집어넣으십시오.tage 수동 방사형 트리밍 후 단면화를 재개하기 전에. 면을 따라 슬라이스를 트리밍하려면 원하는 섹션에 사용되는 것과 동일한 절단 두께를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 트리밍 두께는 사용자 선호도에 따라 10 μm 내지 100 μm 사이일 수 있다.
   2. 공막이 있는지 섹션을 검사하면서 계속 다듬습니다. 공막이 보이면 스테이지 각도를 필요에 따라 조정합니다. 단면이 동일한 공막 분포를 보일 때까지 트리밍을 계속하여 각 섹션에서 최적의 평탄도와 최대 클로버잎 면적을 보장합니다.
   3. 조직 절편을 수집합니다(그림 6C).
      참고: 최적의 두께는 수행 중인 최종 분석에 따라 달라지며 이 다운스트림 프로토콜을 준수해야 합니다. 예를 들어, 10X 제늄을 사용하는 경우 20μm 두께의 절편을 권장합니다. 반면 10X Visium의 경우 15μm 두께의 절편이 더 적합합니다.
   4. 미리 냉각된 슬라이드를 사용하고 두 개의 페인트 브러시를 사용하여 섹션을 제자리로 조작합니다.
   5. OCT가 녹고 조직이 부착될 때까지(약 5초) 섹션 아래에 손가락을 놓습니다.
   6. 조직을 다시 얼리기 위해 슬라이드를 차가운 표면으로 되돌립니다.
      알림: 작은 영역(예: Xenium)에서 섹션을 수집할 때 여러 번의 동결-해동 주기가 필요할 수 있습니다. 이는 프로브 기반 기술에는 영향을 미치지 않지만 편향되지 않은 염기서열분석 접근법을 위한 RNA 품질에 영향을 미칠 수 있습니다.
9. 즉시 사용할 수 있도록 드라이아이스에 슬라이드를 보관하고, 다음 날 RNAscope의 경우 -20°C에서, 장기 보관을 위해 -80°C에서 보관하십시오.

4. 표적 탐지 및 현미경 검사

참고: 이 기술은 다른 분자 프로파일링 방법과 호환되지만 RNAscope를 검증된 하나의 예로 자세히 설명합니다.

1. 시료 전처리:
   1. -80°C 보관에서 슬라이드를 제거하고 -20°C에서 1시간 동안 예열합니다.
      참고: 슬라이드는 이 절차의 나머지 부분을 시작하기 전에 최대 12시간 동안 -20°C에서 보관할 수 있지만 RNA 분해를 최소화하기 위해 -20°C에서 너무 오래 방치해서는 안 됩니다.
2. 슬라이드를 37°C에서 10초 동안 빠르게 가열합니다.
3. 슬라이드를 실온에서 30분 동안 신선한 4% PFA에 담궈 조직을 고정합니다.
4. 1x PBS로 슬라이드를 철저히 씻으십시오.
5. 에탄올 시리즈를 통한 조직 탈수: 50% 에탄올 5분, 70% 에탄올 5분, 100% 에탄올 5분, 신선한 100% 에탄올 5분.
   참고: 이것은 조직 장착을 위한 중요한 품질 관리 단계입니다. 탈수 중에 조직 박리가 발생하면 장착 중 인접한 부분에서 OCT가 겹치고 있음을 나타냅니다. 절편 및 장착 중 과도한 OCT를 조심스럽게 트리밍하면 이 문제를 방지할 수 있습니다.
6. 장벽 준비:
   1. 실온에서 5분 동안 벤치탑의 슬라이드를 자연 건조합니다.
   2. 소수성 장벽 펜을 사용하여 각 조직 섹션 주위에 장벽을 그립니다. 장벽이 실온에서 5분 동안 완전히 건조되도록 합니다.
7. 분자 검출:
   1. 조직 투과화를 위해 프로테아제 IV 치료를 적용합니다.
   2. 타겟 프로브 혼성화(40°C에서 2시간), 신호 증폭 단계(순차 증폭기 3개), 형광단 검출(3플렉스 염색을 위한 순차 라운드 4회)에 대한 제조업체의 프로토콜을 진행합니다.
8. 이미징:
   1. 각 커버 유리를 장착하기 전에 DAPI 핵 대조염색을 수행합니다.
   2. 변색 방지 장착 매체를 사용하여 커버 유리를 장착합니다.
   3. 적절한 필터 세트와 함께 형광 현미경을 사용한 이미지.
   4. 멀티플렉스 감지의 경우, 계산 등록을 위해 4번의 감지 라운드 모두에서 동일한 필드를 캡처합니다.
   5. 정확한 신호 비교를 위해 라운드 간에 일관된 노출 설정을 유지합니다.
      참고: RNAscope 구현에 대한 자세한 내용은 제조업체 프로토콜을 참조하십시오( 재료 표 참조). Xenium과 같은 완전 자동화된 플랫폼의 경우 제공된 대로 모든 제조업체 프로토콜 단계를 정확하게 따릅니다. 모든 프로토콜에 대해 이 예시 프로토콜에 명시된 바와 같이 OCT 중복으로 인해 조기 탈수 또는 세척 단계에서 조직 분리로 인한 실패가 발생할 가능성이 가장 높다는 것을 예상하십시오.

결과

이 프로토콜의 성공적인 구현은 망막 표면 전체에 걸쳐 공간 관계를 유지하면서 여러 분자 프로파일링 접근 방식에 적합한 온전한 망 막 단면을 생성합니다. 당사는 기존의 면역조직화학(immunohistochemistry)에서 수동 멀티플렉스 RNA 검출을 거쳐 자동화된 고처리량 분자 프로파일링(high-throughput molecular profiling)에 이르기까지 체계적인 검증 접근 방식을 통해 프로토콜의 유용성을 입증합니다.

본 프로토콜의 초기 검증은 모든 망막 층판에 걸쳐 조직 무결성과 구조적 보존을 평가하기 위해 두 가지 잘 특성화된 마커를 사용합니다(그림 7). 망막 신경절 세포는 항-RBPMS 면역염색으로 표지되며, 혈관 구조망은 토마토 렉틴(Tomato Lectin)을 사용하여 시각화됩니다. 이 조합은 두 마커 모두 건강한 망막에서 뚜렷하고 잘 문서화된 분포 패턴을 가지고 있기 때문에 프로토콜 성...

토론

여기에 제시된 방법은 현대 분자 프로파일링 기술에 적합한 얇은 표면 절편을 생산할 수 있도록 함으로써 망막 공간 생물학의 중요한 기술적 장벽을 해결합니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 초기 해부 중 조직 취급과 냉동 보존 및 절편 중 온도 및 수화의 정확한 제어에 중점을 둡니다. 성공적인 구현은 특히 OCT 포매 전에 적절한 조직 평탄화를 달성하고 절편 프로세스 전반에 걸쳐 일관된 온도 제어를 유지하는 데 달려 있습니다.

일반적인 기술 아티팩트 및 문제 해결:
프로토콜 구현 중에 몇 가지 기술적 문제가 발생할 수 있으며, 각 문제에는 고유한 원인과 솔루션이 있습니다.

조직 박리: 가장 일반적인 기술적 결함은 조직이 슬라이드에서 분리될 때 탈수 단계에서 발생합니다. 이는 일반적으로 장착 중에 인접한 섹션 간의 OCT ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
에임스&프라임; 미디엄	시그마-알드리치	A1420-10X1L	특정 브랜드는 중요하지 않음
비드스미스 스레드 잭, 스레드 버너	비드스미스 스토어	7.90524E+11	대체 소작기를 사용할 수 있습니다
Cryostat	Leica	cm1950	중요한 고려 사항은 부피와 스테이지 온도를 별도로 제어할 수 있다는 것입니다.
라이아이스	NA	NA NA	Fine
Science Tools Dumont #5 집게	Fine Science Tools 1129500	NC9889584	특정 브랜드 중요하지 않음
Fisher Healthcare Tissue-Plus OCT 컴파운드	Fisher Scientific	23-730-571	특정 브랜드 중요하지 않음
Fisherbrand 고정밀 스트레이트 슬렌더 파인 포인트 핀셋/집게	Fisher Scientific	12-000-127	특정 브랜드는 중요하지 않음
Fisherbrand 표준 해부 가위	Fisher Scientific	08-951-20	특정 브랜드는 중요하지 않음
Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드	Fisher Scientific	22-037-246	특정 브랜드는 중요하지 않음
Integra Miltex Noyes Iris 가위	Integra Miltex 181510	12-460-278	특정 브랜드는 중요
하지 않음Olympus IX81 회전 디스크 epifluorescence 현미경			그림 7
RNAscope HiPlex	ACDBio
직사각형 커버 안경	Fisher Scientific	12-541-033	특정 브랜드는 중요하지 않음
탄산나트륨	Sigma-Aldrich	S6014-25G	특정 브랜드는 중요하지 않음
Thermo Scientific Nunc 유리 바닥 접시	Fisher 과학	12-567-400	특정 브랜드는 중요하지 않음
세계 정밀 기기 정밀 스테레오 줌 삼안 현미경(IV) 붐 스탠드 세계	정밀 기기 PZMTIVBS	50-253-8607	특정 브랜드는 중요하지 않음
Zeiss Axio Imager.M2 epifluorescence 현미경			광학 절편화 활성화(그림 8의 경우)