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방법 논문

Comparative Proteomic Analysis of Whole Kidney, Medulla, and Cortical Tubules in Diabetic Pathogenesis of Kidney Injury in Mice(마우스에서 신장 손상의 당뇨병성 발병기전에서 전체 신장, 수질 및 피질 세뇨관의 비교 단백질체학 분석)

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DOI:

10.3791/68177

⸱

2025년 5월 2일

 ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Hypertension and Proteomics Technology Center, Department of Medicine, University of Louisville School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 전체 신장, 분리된 피질 세뇨관 및 수질 단백질체의 단백질체학 분석을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 연구는 또한 당뇨병성 마우스 모델과 비당뇨병 마우스의 지역 단백질체를 비교합니다.

초록

신장 질환에서 사건의 순서를 정의하는 것은 신장 전문의 툴킷에서 임상 실습의 초석입니다. 조직 단백질체 분석은 신장 병태생리학의 기본적인 생리학적 및 분자적 과정을 이해하기 위한 중요한 접근 방식입니다. 여기에서 제시하는 방법과 프로토콜은 질병 후유증과 관련된 각 특정 관심 영역에서 신장의 분자 박리를 가능하게 합니다. 고유한 기능을 가진 특정 신장 영역 및 구조에 대한 질병의 영향을 결정하기 위해 이 프로토콜의 목표는 간소화된 label-free 정량적 단백질체학 워크플로우와 함께 단순화된 마우스 신장 구획화 및 신장 피질 세뇨관 분리 기술을 입증하는 것입니다. 이러한 방법을 결합하면 신장의 전체 신장, 수질 구획 및 피질 세뇨관 구조에서 교란된 분자 패턴을 식별하는 데 도움이 될 것이며, 병리학적 맥락에서 단일 세포 단백질체학의 궁극적이고 궁극적인 목표를 달성할 수 있습니다. 거의 모든 질병 모델에 이러한 방법을 적용하면 신장 기능 장애와 관련된 병리학의 메커니즘을 설명하는 데 도움이 될 것입니다.

서론

만성 신장 질환(CKD)은 현대 의학계의 주요 관심사로, 미국에서만 860억 달러 이상의 의료 지출이 발생하고 있습니다1. 전 세계적으로 당뇨병 및 관련 신장 동반 질환의 유병률과 함께 CKD의 발병률이 증가하고 있습니다. 미국 인구의 약 14%가 CKD를 앓고 있습니다(USRDS 2024 연례 보고서). 또한, 당뇨병성 신병증은 만성콩팥병의 한 형태이며 말기 신장 질환(ESRD)의 주요 원인이며, ESRD 환자의 60%가 당뇨병을 앓고 있습니다 1,2,3. 당뇨병은 모든 신장 구조와 신장의 기능 단위인 네프론의 세포 유형에 영향을 미칩니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 네프론의 다양한 부분은 신장 피질과 수질 영역에 포함되어 있습니다. 신장의 대부분은 세뇨관으로 구성되어 있습니다. 신세뇨관 기능 장애와 구조적 병변은 당뇨병성 신병증(DN)의 발병에 크게 기여하며, 이러한 변화는 신장 기능 저하 속도(4,5,6,7,8)와 밀접한 관련이 있습니다. 당뇨병 초기에는 모든 세뇨관 분절에서 포도당 및 관련 나트륨 흡수 및 막 수송 단백질 요구량 증가에 대한 반응으로 세뇨관이 비대됩니다. 나중에 당뇨병에서 미세혈관 손상이 증가하면 세뇨관이 위축되고 확장되는 반면, 섬유화와 간질(interstitium)이 확장됩니다9. 우리 실험실의 이전 연구에서는 당뇨병 쥐의 피질 세뇨관에서 변형된 단백질체와 풍부한 스트레스 반응 단백질을 발견했습니다10,11. 수질은 소변 농도를 조절하는 데 중요하며, 신장 질환 중 기능 장애는 산화 스트레스와 관련이 있으며, 당뇨병은 신진대사 활동으로 인한 산소 소비량 증가, 막 수송 단백질의 활동 증가 및 미세혈관 손상으로 인해 신장 이 부위의 산소 장력을 감소시킵니다 12,13,14.

DN의 발달 및 진행에 대한 자세한 메커니즘을 이해하는 것은 질병 모델링 및 신호 전달 과정의 분자 프로파일링, 세포 단백질 역학의 적응적 변화, 만성 질환에서 손상의 영향을 받는 신장 세포 및 조직 구성 요소의 정확한 정의를 호출하는 새롭고 통합된 접근 방식을 요구하는 지속적인 노력입니다. 단백질체학(Proteomics), 대사체학(metabolomics) 및 전사체학(transcriptomics)은 신장 질환의 분자 메커니즘을 분석적으로 조사할 수 있는 가능성을 제공합니다. 오믹스는 생물학적 시스템에 대한 보다 세계적인 이해를 얻기 위해 시스템 생물학 접근 방식을 활용하는 비교적 새로운 분야입니다. 단백질체학은 최근 수십 년 동안 신장학에서 강력한 오믹스 도구였습니다. 지난 20년 동안 바이오마커 연구는 출판물의 증가에서 알 수 있듯이 확장되었지만, 이러한 연구 결과를 임상에 완전히 적용하기 위해서는 광범위한 작업이 필요하다15. 신장 피질과 수질 내에서 세뇨관 세포 집단과 각각의 기능적 역할이 매우 다르기 때문에 전체 신장에 대한 단백질체학 분석은 이러한 서로 다른 영역 내의 특정 구조와 관련된 고유한 변화를 가릴 수 있습니다. 따라서 이 연구의 목표는 신장 피질과 수질의 분리뿐만 아니라 사구체에서 피질 세뇨관의 분리를 입증한 다음 최첨단 질량 분석 및 생물 정보학 분석을 위해 분리된 구조에서 단백질 추출물을 준비하기 위한 자세한 프로토콜을 입증하는 것입니다. 당뇨병성 신병증의 마우스 모델은 질병 진행의 메커니즘을 정의하는 데 중요한 역할을 합니다. 본 연구를 위해 OVE26 형질전환 마우스를 사용하였는데, 이 마우스는 1) 사구체 여과율의 조기 상승 및 후기 감소, 2) 신장 비대, 3) 사구체 기저막 비후 및 중간막 확장, 4) 중증 단백뇨, 5) 세뇨관 간질성 섬유증9 등 인간에서 초기 및 후기 단계의 DN 특징을 보여줍니다. 16,17. 생후 2개월 된 쥐를 선택하여 명백한 구조적 병변이 발생하기 전에 세뇨관 구획의 단백체 변화를 입증했습니다. 이전에 보고되고 그림 2에서 볼 수 있듯이, 2개월 된 OVE26 마우스는 어린 당뇨병 마우스에서 근위세뇨관(그림 2, 노란색 화살표)에 대한 명백한 조직학적 변화 없이 사구체 간막 기질 확장(그림 2, 녹색 화살표)과 중증 단백뇨17을 나타냅니다. 여기에서는 당뇨병이 있는 각 구획의 단백질체의 차이를 설명하고 설명하기 위해 전체 신장, 수질 및 피질 세뇨관의 특성을 규명하기 위한 결합된 정량적 단백질체학 접근법을 제시합니다.

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프로토콜

OVE26 및 FVB 마우스를 사용한 연구는 루이빌 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 지침에 의해 승인되었습니다. 형질전환 여성 OVE26(당뇨병; 균주 #:005564) 및 FVB(비당뇨병성, 배경 균주; 균주 #:001800) 마우스는 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)에서 구입했습니다. 동물들은 25°C에서 12시간 동안 명암 주기로 유지되었으며 물과 음식을 자유롭게 섭취할 수 있었습니다. 모든 연구는 생후 2개월 된 쥐를 대상으로 수행되었습니다.

1. 동물 모형

  1. 신장 격리
    1. 80mg/kg 케타민과 12mg/kg 자일라진을 복강내 투여하여 마우스를 마취합니다.
    2. 작은 수술용 가위로 복부 정중선을 절개하고 면봉을 사용하여 장을 마우스 옆으로 부드럽게 움직여 대정맥을 노출시킵니다.
    3. 오른쪽 신장 위의 대정맥을 작게 절개합니다.
    4. 좌심실을 통해 20mL의 차가운 인산염 완충 식염수(PBS: pH 7.4; 210 mg/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 726 mg/L Na2HPO4·7H2O) 연동 펌프를 사용하여 10mL/분의 속도로 수행합니다.
      참고: 신장에 혈액 단백질과 세포를 포함하는 것이 다운스트림 분석에서 중요한 요소가 아닌 경우 이 단계가 필요하지 않습니다.
    5. 작은 수술용 가위를 사용하여 신장을 제거합니다. 신장 바깥쪽의 과도한 지방을 제거한다. 신장의 무게를 잰 후 얼음 위의 차가운 PBS에 넣습니다.
    6. 신장 캡슐을 제거합니다.
    7. 유리접시에 신장을 올리거나 얼음 위에 올려놓은 페트리 접시에 담습니다. 면도날(그림 3)을 사용하여 신장을 가로로 여러 번 절개하여 신장의 상극과 하극 사이에 3-4개의 슬라이스를 만듭니다.
    8. 각 신장에서 1-2개의 중간 절편과 두 개의 극( 그림 3에서 동그랗게 표시된 신장 절편)을 따로 남겨 두고, "전체 신장" 샘플로 사용합니다. 1.5mL 원심분리 튜브에 일부를 넣고 약 10μL/mg의 조직 샘플(획득한 신장 무게에서 파생된 신장 절편의 추정 질량 기준)에 얼음처럼 차가운 균질화 완충액(10% 글리세롤, 50mM HEPES, 100mM KCl, 2mM EDTA, 0.1% NP40, 10mM NaF, 0.25mM NaVO3, 1x HALTS 프로테아제 억제제)을 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
    9. 중간 가로 절편의 나머지 부분의 경우 절편을 평평하게 놓고 면도날이나 메스를 사용하여 각 절편에서 피질(바깥쪽 1mm)을 조심스럽게 자릅니다(그림 3, 개략적 작업 흐름). 피질 세뇨관 분리 프로토콜을 위해 피질을 수질 영역과 분리하여 유지합니다(아래 1.3단계).
    10. 절개된 수질의 일부를 1.5mL 원심분리 튜브에 넣고 1.1.8단계와 같이 얼음처럼 차가운 균질화 완충액을 추가한 다음 튜브를 얼음 위에 둡니다.
    11. 액체 질소에 담근 후 균질화에 사용되지 않은 나머지 모든 신장 및 수질 조각을 스냅 동결하고 -80 °C에서 보관합니다.
  2. 또는 분리된 모든 전체 신장 및 수질 구획을 동결하고 1.1.11단계에 설명된 대로 보관하십시오. 1.1.8단계와 같이 균질화 완충액을 추가하기 위해 나중에 저장소에서 제거합니다.
  3. 피질 세뇨관 분리
    1. 절개된 피질을 유리판이나 페트리 접시에 면도날로 1-3mm 조각으로 다져 페이스트를 만듭니다.
    2. 다진 피질을 1mL의 IA 콜라겐 분해 효소 (1 mg/mL)에 30 °C, 37 °C, 흔들 수조에서 소화합니다.
    3. 얼음 위의 50mL 원뿔형 튜브 위에 100μm 세포 여과기를 놓습니다.
    4. 분해된 피질 현탁액을 100μm 세포 스트레이너에 놓고 10mL 주사기의 플런저를 사용하여 스트레이너를 통해 부드럽게 누릅니다. 스트레이너 상단을 PBS 1mL로 세척하고 스트레이너 아래쪽을 PBS 1mL로 세척합니다.
    5. 50mL 튜브의 여과액을 추가로 100μm 여과기에 통과시킨 다음 여과기 상단을 1mL의 PBS로 세척합니다.
    6. 얼음 위의 50mL 원뿔형 튜브 위에 놓인 70μm 세포 여과기에 여과액을 통과시킵니다. 세뇨관은 이 여과기를 통해 여과액으로 들어갑니다(사구체는 70μm 여과기에 유지됩니다). PBS 1mL로 스트레이너를 세척합니다.
    7. 최종 여과액을 120 × g 에서 4 °C에서 2 분 동안 회전시킵니다. 세뇨관 펠릿에서 과도한 PBS를 폐기합니다.
    8. 10x 대물렌즈를 사용하여 현미경으로 시각화하여 피질 세뇨관 펠릿의 순도를 확인합니다. 분획의 10% 이상이 사구체를 함유하고 있는 경우, PBS 1mL로 여과액을 다시 현탁시키고 여과기를 추가로 세척하지 않고 깨끗한 70μm 세포 여과기를 통과시킵니다.
    9. 농축 세뇨관 분획을 1.5 mL 원심분리 튜브에 분배하고 2000 × g 에서 4 °C에서 2분 동안 회전합니다. 상등액을 버리십시오.
    10. 전체 신장 및 수질과 마찬가지로 세뇨관 펠릿에 균질화 완충액을 추가합니다(단계 1.1.8 및 1.1.10).
  4. 조직 균질화/단백질 추출
    1. 1.5mL 튜브 전용 플라스틱 유봉을 사용하여 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브의 각 샘플 유형을 균질화합니다. 균질화된 현탁액이 너무 두꺼우면 필요에 따라 추가 균질화 완충액을 추가합니다.
    2. 균질화된 현탁액을 얼음 위에 15분 동안 그대로 둔 다음 25°C의 수조에 물을 넣은 상태에서 수조 초음파 처리기(켜기/끄기 스위치만 해당, 장치의 조정 가능한 설정 없음)에서 5분 동안 초음파 처리하십시오. 샘플을 얼음 위에 10분 동안 그대로 둡니다.
    3. 간단히 와류(1000-1500 RPM)를 균질화한 다음 피펫으로 20회 분쇄하고 얼음 위에 15분 더 둡니다.
    4. 13,000 × g 에서 4 °C에서 20분 동안 원심분리 전에 샘플을 여러 번 분쇄합니다.
    5. 세척된 단백질 추출물을 깨끗한 튜브로 옮깁니다.
    6. 단백질 추정 및 질량 분석 분석을 위한 시료 전처리를 위해 30μL의 투명화 추출물을 분취합니다. 나머지 샘플은 -80 °C에서 보관하십시오.

2. Suspension-Trap 미니 스핀 컬럼 소화 프로토콜

  1. 단백질체학 분석을 위해 단백질을 트립틱 단편으로 단백질 분해
  2. 샘플 용해 완충액(100mM 트리에틸암모늄 바이카보네이트(TEA-BC) pH 8.5, 40mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀[TCEP]에서 10% w/v 도데실황산나트륨[SDS])에 ~40-50μg의 샘플(~2μg/μL)을 46μL의 최종 부피로 희석합니다.
  3. 단백질의 환원 및 알킬화
    1. 65°C에서 30분 동안 배양합니다(TCEP의 최종 농도는 20mM).
    2. 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 등급의 물에 0.5M 요오드아세트아미드 4μL를 첨가하고 실온(RT)에서 암흑 속에서 30분 동안 배양합니다(요오드아세트아미드의 최종 농도는 40mM).
  4. LC-MS 등급의 물에 12% w/w 인산 5μL를 추가합니다(12% 용액을 위해 859μL의 물에 859μL의 인산 141μL를 희석).
    1. 인산 대신 인산펩티드 농축을 수행하는 경우 트리플루오로아세트산 또는 포름산을 사용하십시오18.
  5. 350μL의 현탁액 트랩 결합 완충액(90% v/v 메탄올/10% v/v 물, pH 7.55에서 100mM TEA-BC)을 추가합니다.
  6. 현탁액 트랩 컬럼에 샘플을 추가합니다. 4,000 × g 의 원심분리기를 고정각 로터에서 RT에서 30초 동안 가열하여 각 부피가 컬럼을 통과하도록 합니다.
  7. 4x 400 μL의 서스펜션 트랩 바인딩 버퍼로 세척합니다. 4,000 x g 의 원심분리기, 고정각 로터에서 RT에서 30초 동안 세척하여 세척할 때마다 컬럼을 통과시킵니다.
    알림: SDS 제거를 돕기 위해 세척할 때마다 로터의 컬럼을 180° 회전하십시오.
  8. 4,000g에서 RT에서 1 분 동안 원심분리기를 사용하여 결합 완충액을 완전히 제거합니다(분해 중 물방울 방지).
  9. 서스펜션 트랩 컬럼을 깨끗한 수집 튜브로 옮깁니다.
  10. LC-MS 등급의 물(트립신 프로테아제, MS 등급)에 125μL의 50mM TEA-BC pH 8.5에 2.5-5μg의 트립신을 추가합니다. 샘플에 대한 트립신의 최종 비율은 1:20에서 최대 1:10입니다.
  11. 47 ° C에서 2 시간 동안 배양하십시오 (캡을 조이지 마십시오. 0 RPM으로 설정된 열 혼합기가 선호됨). 바늘로 캡에 구멍을 뚫으면 서스펜션 트랩의 상부 챔버에 압력이 형성되는 것을 방지할 수 있습니다(압력이 증가하면 트립신 용액이 컬럼을 통해 떨어집니다).
  12. LC-MS 등급의 물에 80μL의 50mM TEA-BC pH 8.5를 추가합니다. 고정각 로터에서 1분 동안 상온에서 4,000g의 원심분리기를 사용하여 각 분해물을 컬럼을 통과시킵니다.
  13. LC-MS 등급의 물에 0.2% v/v 포름산 80μL를 첨가합니다. 고정각 로터에서 RT에서 1분 동안 4,000g의 원심분리기를 2.11단계의 다이제스트와 함께 수집합니다.
  14. LC-MS 등급의 물에 80μL의 50% v/v 아세토니트릴을 첨가합니다. 고정각 로터에서 1분 동안 상온에서 4,000g의 원심분리기를 2.11단계의 다이제스트와 함께 수집합니다.
  15. 서스펜션 트랩 용리액을 -80 °C에서 보관하십시오.
  16. 진공 농축기에서 샘플을 건조시킵니다.
  17. 건조된 시료는 -80°C에서 보관하십시오.

3. 친수성-친유성 균형(HLB) 컬럼으로 정리

  1. 용액 A(2% v/v 아세토니트릴/0.1% v/v 포름산) 및 B(80% v/v 아세토니트릴/0.1% v/v 포름산)를 만듭니다.
  2. 샘플을 500μL의 용액 A에 용해시킵니다.
  3. 컬럼을 진공 매니폴드에 놓고 ~1-2mL/분의 가스 압력을 가합니다.
  4. HLB 컬럼에 500μL의 용액 B를 추가하고 1-2mL/분의 속도로 배출합니다. 두 번 반복합니다.
  5. HLB 컬럼에 용액 A 750μL를 추가하고 1-2mL/분의 속도로 배출합니다. 두 번 반복합니다.
  6. 깨끗한 2mL 마이크로튜브를 HLB 컬럼 아래의 랙에 놓고 500μL의 용액 A에 샘플을 로드하고 위와 같은 가스 압력을 가합니다. 플로우 스루를 컬럼으로 두 번째로 전달합니다.
  7. HLB 컬럼을 폐기물 튜브 위에 놓고 용액 A 500μL를 첨가한 후 위와 같이 배출합니다. 두 번 반복합니다.
  8. 깨끗한 2mL 마이크로튜브 위에 컬럼을 놓고 용액 B 500μL를 추가한 후 위와 같이 배출합니다. 두 번 반복합니다.
  9. 용리액을 -80°C에서 동결한 다음 진공 농축기에서 건조시킵니다. 건조된 잔류물은 -80°C에서 보관하십시오.
  10. MS 분석 전에 잔류물을 2% v/v 아세토니트릴/0.1% v/v 포름산 20μL에 용해시킵니다. 분광 광도계를 사용하여 205nm의 흡광도에서 펩타이드 농도를 추정합니다.

4. 질량 분석 분석

  1. 1차원 역상 액체 크로마토그래피(LC)-MS/MS
    1. 동일한 질량의 펩타이드(~600ng)를 1차원 나노 LC에 주입하고 역상 C18 컬럼에서 분획합니다.
    2. 이온 전달 튜브를 250°C로 유지한 상태에서 1.8kV의 스프레이 전압으로 펩타이드를 MS로 직접 용리합니다.
    3. 가장 강렬한 MS/MS 단편이 분석 대기열에서 제거되는 데이터 종속 상위 20개 이온 모드에서 스펙트럼을 획득하여 저농도 이온에 대한 이온 매핑 깊이를 개선합니다.

5. 데이터 분석 및 생물 정보학

  1. 데이터 처리 절차
    1. PEAKS 12.0(LC-MS/MS 데이터 분석 소프트웨어)에서 스펙트럼 할당과 펩타이드 및 단백질 식별에 이어 https://www.metaboanalyst.ca/(Single-Factor Statistical Analysis Approach)을 사용하여 MetaboAnalyst 6.0(대사체학 데이터 분석 플랫폼)에서 분석할 단백질 목록을 제출합니다.
    2. LC-MS/MS 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 Mouse Reviewed FASTA 데이터베이스에 대해 엄격한 거짓 발견 비율(FDR) 기준(1% 단백질 및 펩타이드)을 사용하여 스펙트럼을 검색하고 필터링합니다.
      참고: 쉽게 사용할 수 있는 대체 검색 프로그램으로는 널리 사용되는 다른 옵션 중에서 Maxquant, Proteome Discoverer가 있습니다.
    3. 시스테인의 카바미도메틸화(carbamidomethylation)를 고정 변형(fixed modification)으로 명시한다. 메티오닌의 산화를 변수 수정으로 지정합니다.
    4. 목록을 CSV(쉼표로 구분된 값) 형식으로 변환하고 각 열과 행에 할당된 그룹/샘플 레이블을 변환합니다. 이 형식은 대사체학 데이터 분석 플랫폼에서 유연합니다.
    5. 누락된 변수에 대해 1/5 최소값 규칙을 사용하여 누락된 값을 대치합니다.
    6. 데이터를 필터링하여 교차분위수 범위를 사용하여 변동성이 높은 값을 제외하며, 여기서 40% 분산이 컷오프에 사용됩니다.
    7. 값을 중앙값 강도로 정규화하고, 변환된로그 10 을 보고, 스케일링을 위해 평균 중심을 지정합니다. 다른 정규화 방법을 사용하되 결과가 달라질 수 있다는 점을 염두에 두십시오.
    8. p-값 컷오프가 0.05< 쌍을 이루지 않는 방식으로 T-검정을 수행합니다. 이 단계에서 여러 테스트 수정을 수행합니다.
      참고: 이 연구는 데이터 표시 목적으로 대표 데이터 세트에 대해 이러한 수정을 수행하지 않았습니다.
    9. 1.5배 변화(FC) 및 p < 0.05에 대한 화산 플롯을 나타냅니다.
    10. 히트맵을 생성하고 표본 그룹에 대한 PLSDA(Partial Least Squares Discriminant Analysis) 및 VIP(Variable of Importance of Projection) 분석을 수행합니다.
    11. 후속 조치의 잠재적 후보는 PLSDA 분석에서 나타난 바와 같이 1.5FC 및 p-val < 0.05 또는 VIP > 1.0을 능가할 만큼 충분히 강력합니다.
    12. OVE26 마우스에서 전체 신장, 세뇨관 및 수질의 단백질체의 차이를 설명하기 위해 벤 다이어그램을 생성합니다.

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결과

전체적으로 각 샘플 유형에서 확인된 총 단백질은 1) 전체 신장(1438), 2) 수질(2145) 및 피질 세뇨관(1859)이었습니다. MetaboAnalyst 6.0의 데이터 처리, 데이터 필터링 및 대치에 따라 최종적으로 분석된 각 신장 구획에 대한 단백질 식별은 전체 신장(455), 수질(997) 및 피질 세뇨관(896)이었습니다. 그림 4 는 OVE26 당뇨병성 마우스 신장의 전반적인 단백질체 변화를 보여줍니다. LFQ(Label-Free Quantitative) 분석을 통해 고도의 단백질체 커버리지를 허용하는 동시에 리포터 이온 라벨링(TMT, iTRAQ 등)에 비해 전체 데이터 세트에 더 많은 변동성을 도입할 수 있습니다. LFQ 변동성을 극복하기 위한 한 가지 방법은 각 조건에 대해 분석되는 샘플의 수를 늘리는 것입니다. 여기에서는 펩타이드 및 단백질 할당 수준에서 1%의 거짓 발견 비율(FDR)을 가진 PEAKS 검색 알고리즘의 강도 기반 정량화 접근 방식을 활...

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토론

이 기술적 접근 방식에서 제시된 방법은 신장의 여러 영역에 대한 비교 단백질체 분석을 설명하기 위해 고안되었습니다. 여기에서는 당뇨병(OVE26) 및 대조군(FVB) 마우스에서 수질 및 피질 세뇨관을 분리하는 방법을 활용하고 1차원 LC-MS/MS 및 생물정보학 분석을 수행하여 전체 신장의 단백체 외에도 신장의 각 부분에 있는 단백체의 기본적인 차이를 설명했습니다.

신장 구획을 분리하려면 수질에서 멀리 떨어진 피질을 조심스럽게 해부해야 합니다. 신장을 초기에 가로로 절개할 때, 얇은 절편은 피질을 보다 신뢰할 수 있게 해부할 수 있게 해줄 것이다. 체질 접근법을 사용하여 피질 세뇨관을 준비하면 70 μm 체를 통해 사구체를 여과할 수 있습니다. 현미경으로 세뇨관의 순도를 확인하여 농축을 보장하되 연속적인 세척 단계마다 세뇨관 질량의 손실을 방지하는 것이 중요합니다. 초기 체질 단계를 통해 소화된 피질의 과도한 압박을 피...

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공개 사항

저자는 공개하지 않습니다.

감사의 글

이 프로젝트를 위한 작업은 MTB(NIH K01DK080951) 및 TDC(NephCure-Pediatric Nephrology Research Consortium NKI-2023-04), 루이빌 대학교 신장 질환 프로그램 및 단백질체학 기술 센터(TDC, MTB)에 대한 자금으로 부분적으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
콜라게나제 유형 1A 밀리포어 신호C9891
Exploris 480 Orbitrap Thermofisherhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539MS
Falcon 세포 스트레이너, 100 및 마이크로; mVWR21008-950
팔콘 셀 스트레이너, 70 및 마이크로; mVWR21008-952
Gibco PBS pH 7.4 Thermo1001023
Halt 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일VWRPI78440
요오도아세트아미드시그마 알드리치I1149
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참고문헌

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