방법 논문

키토산 나노입자 캡슐화된 아데닌 염기 편집기 플라스미드의 골내 주입을 사용한 유전자 전달 및 발현 향상

DOI:

10.3791/68181

⸱

2025년 5월 16일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anhui University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 골내 주사를 통해 ABE로 코팅된 키토산을 골수에 직접 전달하는 유전자 치료 방법을 제시합니다.

초록

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외인성 플라스미드를 실험 동물에 전달하는 것은 유전자 기능 조사, 질병 메커니즘 해명, 약물 효능 평가 등 생물 의학 연구에서 매우 중요합니다. 그러나, 현재 방법의 transfection 효율은 상대적으로 낮으며, 장기 유전자 발현을 위한 plasmids의 도입은 면역 체계에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 키토산을 활용하여 아데닌 염기 편집기(ABE) 플라스미드를 캡슐화한 다음 골내 주사를 통해 복합체를 마우스의 골수에 직접 전달하는 새로운 방법을 개발하고 조사했습니다. 본 연구에서는 파골세포 분화와 밀접한 관련이 있는 CaMK II δ 유전자를 표적으로 하기 위해 키토산을 활용하여 ABE CaMK II δ 플라스미드를 캡슐화하였습니다. 골내 주사를 통해 플라스미드 화물을 골수강에 직접 주입했습니다. 그 결과, 수용 마우스의 A1 유전자 자리에서 14.27%, A2 유전자 자리에서 10.69%의 높은 생체 내 편집 효율을 보여주었습니다. 이 새로운 전략은 비정상적인 파골세포 기능으로 인한 질병에 특히 적합할 뿐만 아니라 유전자 치료 분야를 발전시킬 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다.

서론

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유전자 치료는 생물의학 연구 분야에서 유망한 접근법으로 부상하고 있습니다 1,2. 특정 유전자의 발현을 조절하고 치료 효과를 연구하기 위해 실험 동물에 외부 플라스미드를 도입하여 다양한 질환을 치료할 수 있는 가능성을 제공합니다. 그러나 기존의 전달 방법은 효과와 안전성을 제한하는 몇 가지 문제에 직면했습니다3. 우려 사항으로는 낮은 transfection efficiency, 높은 생물학적 손상 및 낮은 gene expression efficiency가 있습니다. 따라서 이러한 한계를 극복할 수 있는 유전자 치료제를 위한 새로운 전달 방법을 확립할 필요가 있습니다.

키토산은 생분해성과 생체 적합성이 우수한 천연 다당류 4,5,6으로 심각한 생물학적 독성을 일으키지 않고 동물의 몸에서 쉽게 분해됩니다. 높은 약물 포매율 7,8, 향상된 전달 효율 및 동물에 대한 피해 감소로 인해 약물 전달에 널리 사용되었습니다.

A-T를 G-C로 직접 염기쌍을 변환할 수 있는 ABE 유전자 편집 기술은 유전 및 의학 연구에서 유망합니다. 현재의 주류 유전자 편집 기술과 비교하여, ABE 기술은 정확한 단일 염기 돌연변이를 달성할 수 있으며, 따라서 비표적 DNA 염기서열의 편집을 감소시키고, off-target효과를 감소시키며9,10, DNA 이중 가닥 절단을 0으로 유도하며11, 이는 유전자 편집의 위험을 크게 감소시킨다12. ABE 기술은 또한 생체 적합성이 높으며 질병 치료 연구에 더 적합합니다.

꼬리 정맥 주사는 특히 유전자 치료에서 플라스미드의 생체 내 전달에 사용되는 일반적인 방법입니다. 이 연구의 표적 유전자는 CaMK II δ이며, 이는 파골세포 분화13,14와 밀접한 관련이 있습니다. 꼬리 정맥 대신 골내 주사를 사용하면 편집된 플라스미드가 파골세포로 직접 들어갈 수 있습니다. 이와 같이 골수로의 직접 전달은 유전자 발현의 효율성과 안정성을 증가시켜 파골세포 기능 장애와 관련된 질병의 치료에 유리합니다.

여기에서는 ABE 플라스미드를 키토산으로 캡슐화한 다음 골내 주사를 통해 복합체를 마우스에 직접 도입하는 새로운 방법을 제시합니다. 이 방법을 통해 유기체에 유입되는 외부 플라스미드, 특히 파골세포 기능 장애와 관련된 질병에 대한 보다 효과적인 유전자 치료 방법을 위한 길을 닦을 수 있기를 바랍니다.

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프로토콜

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설명된 모든 동물 실험은 동물의 사용 및 관리에 관한 안후이대학교 동물보건위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구에서 ABE는 Tian Chi 교수(중국 상하이 과학기술대학교; 그림 1D).

1. ABE 플라스미드 구조

  1. GAC에 의해 PAM이 제시되는 TCCATGATGCACAGACAGGA 염기서열로 gRNA를 설계합니다.
  2. 회사의 프라이머 목록 가이드에 따르면 해당 부피의 ddH2O에 프라이머를 첨가하여 100μM의 농도를 달성합니다. 그런 다음 흔들어서 잘 섞어 고르게 분포되도록 합니다. 어닐링 반응을 위해 새로운 마이크로 원심분리 튜브에 10μL의 스톡 프라이머 용액을 첨가하고 90μL의 ddH2O를 첨가하여 10μM 용액을 준비하고 잘 혼합합니다.
  3. 마이크로 원심분리기 튜브에 5μL의 업스트림 프라이머, 5μL의 다운스트림 프라이머, 40μL의 ddH2O를 추가합니다. 어닐링 반응을 촉진하려면 끓는 물이 채워진 용기에 튜브를 5분 동안 담그십시오. 물이 프라이머에 들어가 오염되는 것을 방지하기 위해 수위가 튜브 입구에 도달하지 않도록 하십시오. 어닐링 반응을 완료하기 위해 실온으로 식힙니다.
  4. 마이크로 원심분리기 튜브에 pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP 2μg(그림 1D), ESP3I 1μL, 완충액 4μL, ddH2O33μL를 추가하고 37°C의 항온 수조에서 45분 동안 반응시킵니다.
  5. 아가로스 젤 전기영동을 수행합니다. 아가로스 0.5g의 무게를 달아 1% 아가로스 젤을 준비하고 유리병에 붓습니다. 유리병에 1x TAE 완충액 50mL를 넣고 흔들어 아가로스 분말을 녹입니다. 전자레인지에서 완전히 녹을 때까지 2분 동안 가열합니다. YeaRed Nucleic Acid Gel Stain 5μL를 넣고 철저히 섞은 다음 겔 몰드에 붓습니다. 겔이 응고된 후 샘플을 추가하기 시작합니다.
    알림: 1xTAE를 준비하려면 표 1에 나열된 시약을 사용하십시오.
  6. 전기영동 탱크에 1x TAE를 추가하고 TAE에 담가야 하는 구성된 아가로스 겔 블록을 넣습니다. 1.4단계에서 5μL의 1x loading buffer를 분해 산물에 추가하고 혼합합니다. 샘플을 젤에 추가합니다. 또한 겔에 6μL의 마커를 추가합니다.
  7. 110V의 정전압에서 35분 동안 전기영동 프로그램을 실행합니다. 전기영동 후 마커에 따라 샘플에서 밴드의 위치를 결정하고 겔 회수를 위해 깨끗한 칼날로 겔 스트립을 자릅니다.
  8. gel maxi purification kit 지침에 따라 gel recovery 작업을 수행합니다. 수조를 50°C로 설정합니다. 키트에 따라 절단 젤이 들어 있는 튜브에 해당 부피의 PN 용액을 추가합니다. 피펫 팁으로 젤을 찔러 용해를 용이하게 한 다음 수조에 넣습니다. 가끔씩 튜브를 흔들고 겔 블록이 완전히 용해될 때까지 용해 과정을 관찰하십시오.
  9. 키트에서 스핀 열 CA3을 가져옵니다. 키트에서 500μL의 BL 용액을 스핀 컬럼에 추가하고 2,000 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 컬럼을 평형화합니다. 원심분리 후 수집 튜브 바닥의 폐액을 제거하고 흡착 컬럼을 수집 튜브에 다시 넣습니다.
  10. 2,000 x g 에서 1분 동안 원심분리를 계속합니다. 원심분리기 튜브 바닥에 있는 폐액을 버리고 PN 용액 600μL를 넣고 2,000 x g 를 30초 동안 원심분리합니다. 폐액을 다시 버리십시오. 작업을 반복하고 폐액을 다시 버리십시오.
  11. 원심분리 후 2mL 수집 튜브를 새 1.5mL 튜브로 교체합니다. 커버를 열고 통풍이 잘되는 곳에서 30분 동안 건조시켜 에탄올을 완전히 제거합니다. 그런 다음 예열된 40μL의 ddH2O를 추가하고 원심분리기를 추가한 다음 필요한 DNA를 용리합니다.
    참고: PN은 지침에 따라 무수 에탄올과 함께 첨가해야 합니다. 예열된 물을 사용하면 수확량을 늘릴 수 있습니다.
  12. 마이크로 원심분리기 튜브에 1.3단계의 어닐링 생성물 7μL, 1.11단계의 겔 회수 생성물 3μL, T4 DNA 리가제 1μL, 10x T4 리가아제 완충액 2μL, ddH2O7μL를 첨가하고 16°C에서 하룻밤 유지하여 결찰 생성물을 얻습니다.
  13. 얼음 위의 마이크로 원심분리기 튜브에 10μL의 결찰 산물과 70μL의 DH5α를 30분 동안 추가합니다. 수조를 42°C로 설정합니다. 얼음 목욕 후 튜브를 수조에 90초 동안 넣은 다음 다시 얼음 위에 2분 동안 넣습니다.
  14. 600μL의 Luria-Bertani(LB) 액체 배지를 튜브에 넣고 셰이커에서 30분 동안 흔듭니다. 동시에 층류 캐비닛 내부에 LB 솔리드 매체 플레이트를 30분 동안 조사합니다. 배양 후 용액 100μL를 플레이트에 고르게 분포시킵니다. 코팅 후 배양을 위해 37°C 박테리아 인큐베이터에 플레이트를 거꾸로 놓습니다.
    참고: DH5α는 일반적으로 -80°C에서 보관됩니다. LB 고체 매체는 표 2에 나열된 시약을 사용하여 제조됩니다. LB 액체 매체는 표 3에 열거된 시약을 사용하여 제조한다.
  15. 단일 콜로니를 선택하고 새 플레이트에서 박테리아 콜로니를 14시간 동안 확장합니다. 50mL 원심분리 튜브에 LB 액체 배지 50mL를 넣고 1:1000 비율로 암피실린 50μL를 넣고 잘 섞습니다. 이를 튜브당 15mL의 새 튜브로 나눕니다.
  16. 성장이 좋은 둥근 흰색 군체가 있는지 배양 플레이트를 확인하십시오. 10 μL 피펫으로 이를 선택하고 LB 배지로 옮깁니다. 셰이커에서 12시간 동안 배양한 다음 염기서열분석을 위해 이 샘플을 보냅니다.
  17. 염기서열분석 결과를 타겟 gRNA와 비교하여 일치하는 염기서열인 Camk II δ-sgRNA를 타겟 균주로 사용하여 균주를 식별한 다음 플라스미드를 추출합니다.
  18. 미니 플라스미드 키트의 지침에 따라 플라스미드 추출을 수행합니다. 흡착 컬럼 CP3에 BL 500μL를 첨가하고 2,000 x g에서 1분 동안 원심분리한 후 폐액을 버립니다. 흡착 컬럼을 수집 튜브에 다시 넣습니다. 500μL의 박테리아 용액과 4,000 x g 의 원심분리를 10분 동안 추가합니다.
  19. 흐름을 수집합니다. 다시 원심분리기를 하고 상등액을 제거한 후 세균 침전이 있는 원심분리기 튜브에 P1 250μL를 첨가한 후 마이크로 원심분리기 튜브와 와류로 옮깁니다. 250μL의 P2를 추가하고 6x-8x에 대해 부드럽게 반전시킵니다. 350μL의 P3를 추가하고 다시 6x-8x를 위해 부드럽게 반전시킵니다. 흰색 응집 침전물이 나타납니다.
  20. 2,000 x g에서 10분간 원심분리기. 상층액을 새 흡착 컬럼 CP3로 옮기고 2,000 x g 에서 30초 동안 원심분리한 다음 폐액을 제거합니다. PW 600μL를 넣고 2,000 x g 에서 30초 동안 다시 원심분리한 후 폐액을 제거합니다. PW 600μL를 다시 넣고 2,000 x g 에서 30초 동안 원심분리한 후 폐액을 제거합니다.
  21. 흡착 컬럼을 채취 튜브에 놓고 2,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 잔류 PW를 제거합니다. 그런 다음 흡착 컬럼을 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브에 놓고 30분 동안 건조시킨 다음 예열된 ddH2O35μL를 흡착 필름 중간에 추가한 다음 후속 테스트를 위해 결과 생성물을 -20°C에 보관합니다.
    알림: PW는 지침에 따라 무수 에탄올을 첨가해야 합니다. 예열된 물을 사용하면 수확량을 늘릴 수 있습니다.

2. 골수 세포 추출

  1. 8-9 주령, 수컷, 체중 약 30g의 KM 마우스를 선택하십시오. 머리를 아래로 향하게 하여 왼손에 쥐를 고정하고 오른손을 사용하여 주사기로 복부 측면에서 150μL의 1% 펜토바르비탈 나트륨을 주입합니다. 발가락 꼬집음으로 마취를 확인합니다.
  2. 생쥐의 경추 탈구를 수행하고, 수술용 가위와 핀셋으로 경골을 제거하고, 주변의 과도한 근육 조직을 제거합니다. 제거된 경골을 PBS에 담그고 깨끗한 뼈만 남기고 씻습니다.
  3. 주사기에 PBS 1mL를 넣어 경골의 한쪽 끝에서 뼈가 하얗게 될 때까지 골수 세포를 씻어냅니다.
  4. 세포 현탁액을 수집하고, 800 x g , 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후 적혈구를 500μL의 적혈구 용해물로 용해합니다. 1분 후 1mL의 분리 완충액을 첨가하여 적혈구 용해물을 종결합니다. 800 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고 나중에 사용할 수 있도록 세포를 얼음 위에 놓습니다.
    참고: 적혈구가 완전히 용해되면 세포가 침전되고 적혈구가 보이지 않습니다. 적혈구가 여전히 보이면 다시 용해할 수 있지만 다른 세포의 손상을 방지하기 위해 배양 시간이 너무 길어서는 안 됩니다.

3. 키토산 형질주입

  1. 키토산 제제: 키토산 4mg의 무게를 측정하고 0.2mg/mL 아세트산 용액 20mL에 용해시킵니다. 10M NaOH로 pH를 5.5로 조정합니다. 이 용액 500μL를 개별 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다.
  2. 2 μg, 3 μg, 4 μg 및 5 μg ABE 플라스미드를 개별 튜브에 첨가하고 500 μL의 30 mM Na2SO 4 에 용해시킵니다. 500 μL의 키토산 용액과 500 μL의 플라스미드를 혼합합니다.
  3. 50-55 ° C의 수조에서 15 분 동안 배양하십시오. 두 용액을 잘 섞은 후 15-30초 동안 소용돌이치고 30분 동안 그대로 두십시오.
  4. 키토산 특성화: ddH2O에서 키토산의 농도를 0.1mg/mL로 유지하면서 동적 광 산란(DLS)을 사용하여 키토산의 직경과 제타 전위를 분석합니다. 각 샘플을 3회 실행합니다.
  5. 0.1mg/mL 샘플을 실리콘 칩에 주입합니다. 재현탁된 샘플 20μL를 200메시 그리드에 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 2% 포스포텅스텐산으로 그리드를 3분 동안 염색하고 여과지로 남은 액체를 제거합니다. 투과 전자 현미경으로 관찰하십시오.
  6. 나노 입자 캡슐화 효율 : 0.1 μm 필터로 상층액을 여과하여 침전되지 않은 입자를 제거합니다. 플라스미드를 업로드하고 260 nm에서 분광 광도계로 농도를 측정합니다. ABE 플라스미드와 gRNA 플라스미드의 계산된 효율은 각각 84% ± 0.37%와 85% ± 0.53%였습니다.
  7. 플라스미드가 포함된 키토산 100μL를 골수강을 통해 마우스에 주입합니다(5단계). 주사 7일 후 골수 세포를 분리하고 2단계에서 설명한 대로 적혈구를 용해합니다.
  8. 6-well 세포 배양 플레이트에 2mL의 혈청 함유 DMEM 배지를 첨가하고 500μL의 혈청 함유 DMEM 배지에 현탁된 골수 세포(약 1 x 106)를 추가합니다. 형광 현미경에서 형광 강도를 측정합니다. CaMK II δ-sgRNA plasmid는 580 nm에서 여기할 때 TagRFP 적색 형광을 갖습니다(그림 2B).
    참고: 혈청 함유 DMEM 배지는 표 4에 나열된 시약을 사용하여 제조됩니다.

4. 유세포 분석

  1. 2 μg, 3 μg, 4 μg 및 5 μg의 다양한 용량의 ABE 플라스미드를 준비하고 3단계에 설명된 대로 수용 마우스에 전달합니다. 7일 후, 3단계에서 설명한 대로 마우스에서 골수 세포를 분리합니다.
  2. 골수 세포를 채취하고 800 x g , 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 적혈구 용해액 500μL로 적혈구를 용해합니다. 1분 후, 1mL의 분리 버퍼로 반응을 종료하고 세포 계수기로 세포 수를 계산합니다.
  3. 1 x 106 셀을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 800 x g 로 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후 500μL의 PBS로 세포를 재현탁하고 유동관으로 옮깁니다. 유세포 분석으로 효율성을 측정합니다. 2단계에서 설명한 대로 유세포 분석 control group을 준비합니다.
    참고: FSC 신호가 낮고 FSC 대 SSC 산점도(400 미만)의 왼쪽 하단 모서리에 위치한 세포 파편 및 죽은 세포는 제외되었습니다(그림 3). 플라스미드는 TagRFP 적색 형광을 가지고 있기 때문에 분류할 수 있습니다.

5. 골수 주사

  1. 생후 8주에서 9주 사이, 체중 약 30g의 KM 수컷 마우스를 선택하십시오. 150 μL의 1% 펜토바르비탈 나트륨의 복강 내 주사로 마취합니다(단계 2.1). 발가락 꼬집음으로 마취 깊이를 확인합니다.
  2. 마취된 마우스를 수술대에 누운 자세로 고정하고 마우스의 앞다리를 테이프로 고정합니다.
  3. 쥐의 후방 경골을 알코올 면봉으로 소독합니다. 1mL 주사기에 주입할 플라스미드에 26G 바늘을 채웁니다. 기포를 제거하고 주입을 준비합니다.
  4. 마우스의 정강이를 터치하고 손가락으로 마우스의 정강이를 잡습니다. 경골 샤프트가 마우스의 무릎 관절에 있는 경골 고원에서 관통되도록 주사 바늘의 위치를 결정합니다. 주사 바늘을 경골과 평행하게 회전시켜 골수강을 찌르고 천천히 (약 3 초) 주입하여 마우스의 손상을 최소화합니다.
  5. 주사 후 바늘을 천천히 빼고(약 3초) 즉시 알코올 면봉을 사용하여 출혈을 멈추고 천자 부위를 소독합니다.
  6. 쥐를 따뜻한 환경(20-26°C)에 부드럽게 놓고 쥐가 마취에서 회복될 때까지 기다렸다가 회복을 관찰합니다.

6. Sanger 염기서열분석

  1. 주입 7일 후 2단계에서 설명한 대로 마우스 골수 세포를 채취하고 추출 키트를 사용하여 유전체 DNA를 분리합니다. 2,000 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다. 상등액을 버리고 GA 용액 200μL를 첨가한 다음 와류 믹서로 진동합니다. 20μL의 Proteinase K와 200μL의 GB를 넣고 혼합한 다음 70°C 수조에 10분 동안 넣습니다.
  2. 배양 후 무수 에탄올 200μL를 넣고 15초 동안 흔든 후 혼합액을 지지 흡착 컬럼에 넣습니다. 2,500 x g에서 1분 동안 원심분리기를 하고 튜브 바닥의 폐액을 버리고 GD 용액 500μL를 첨가합니다. 원심분리기를 하여 폐액을 버리고 펠릿을 PW로 2회 세척한 후 마지막으로 건조시켜 40μL의 순수로 용출합니다.
    알림: PW는 지침에 따라 무수 에탄올을 첨가해야 합니다.
  3. 순방향 프라이머 서열 gctaaggtgataaatgtggcact 및 ctagtgtgtgcgggccagattc의 역 프라이머 서열을 사용하여 PCR로 타겟 유전자 CaMKIIδ 를 증폭합니다. 2x 완충액 25 μL, dNTP 믹스 1 μL, 순방향 프라이머 2 μL, 역 프라이머 2 μL, DNA 중합효소 1 μL, 템플릿 DNA 2 μL, ddH2O 17 μL를 첨가하여 PCR 반응을 준비합니다. 다음 PCR 프로그램을 실행합니다: 95 °C 3 분, 95 °C 15 초, 30초 동안 53.7°C, 60초 동안 72°C, 보온을 위해 12°C.
  4. PCR 후 1% 아가로스 젤을 준비하고 110V에서 35분 동안 아가로스 젤 전기영동을 수행합니다(1.5단계, 1.6단계). 전기영동 후 타겟 겔 영역을 절단하고 Sanger 염기서열분석을 위해 보냅니다(그림 4).

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결과

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시험관 내 플라스미드는 골내 주사에 의해 마우스에 주입되었습니다 (그림 1A). 나노 입자의 평균 입자 크기는 약 202.9 nm, 전위는 2.77 mV, PDI는 0.22였습니다 (그림 1B). 그림 1C 는 전자 현미경으로 관찰된 나노 입자의 표면 모양을 보여줍니다. 그림 1D 는 ABE 벡터의 plasmid map과 gRNA vector의 plasmid map을 보여줍니다.

플라스미드 형질주입은 형광 현미경으로 관찰하였다. 그림 2A 는 정상적인 골수 세포를 보여줍니다. 플라스미드를 마우스로 이식한 지 7일 후, 마우스의 골수 세포를 ...

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토론

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생물 의학 연구의 경우, 외인성 플라스미드를 동물에게 전달하는 데 있어 과제는 전달 및 유전자 발현의 효율성을 개선하는 동시에 동물에 대한 피해를 최소화하여 원하는 치료 효과를 달성하는 것입니다15,16. 우리는 수용 마우스의 골수 세포에 키토산 매개 ABE 플라스미드 전달의 골내 주입의 새로운 방법을 제시합니다. 이 전략은 플라스미드 전달 효율과 유전자 발현을 개선합니다.

첫째, 본 연구에서는 비바이러스 벡터 시스템으로 제공되는 키토산을 플라스미드 전달 방법으로 사용했습니다. 종래의 방법의 형질주입 효율이 상대적으로 낮다는 것이 입증되었기 때문에, 장기간의 유전자 발현을 위한 플라스미드의 도입은 면역 체계에 의해 영향을 받을 수 있다17,18

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 안후이성 자연과학재단(2208085MC74, 2208085MC51)과 중국 안후이성 교육부 과학연구재단(KJ2021A0055)의 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2 ml PCR 튜브, 플랫 캡랩셀렉트  PT-02-C
1mL 주사기안후이 강남 의료 장비 유한 회사/
1% 펜토바르비탈 나트륨//
1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브랩셀렉트MCT-001-150
10 &회; DNA 로딩 버퍼바지메P022-01
10X T4 DNA 리가아제 완충액 1mlTaKaRa 생명 공학 (다롄) Co., LTD2011년
1250 & 무; l 피펫 팁 102.1mm랩셀렉트티-001-1250
200 & 무; l 피펫 팁 50.55mm랩셀렉트  티-001-200
2x 팬타 맥스 버퍼a바지메P505-d1
4 ? 원심 분리기써모 피셔75002425
50ml 원심분리기 튜브랩셀렉트티-012-50
6웰 세포 배양 플레이트랩셀렉트11110
한천상곤바이오텍A505255-0250
앰프아비오웰/
키토산상곤바이오텍A600614-0500
항온 배양 셰이커상하이 Zhicheng 분석 기기 제조 Co., LTDZWY-200D
Countess 자동 세포 계수기써모 피셔 사이언티픽백작부인 II/II FL
Countess 세포 계수 챔버 슬라이드 및 홀더, 일회용써모 피셔 사이언티픽C10228
CutSmart 버퍼뉴잉글랜드 바이오랩스B7204SVIAL
DH5&알파;일반 바이오시스템CS01010
DMEM깁코C11995500BT
dNTP 믹스바지메P505-d1
Esp3I 효소NE바이오랩스R0734에스
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