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방법 논문

Real-time PCR을 이용한 SNP 유전형 분석에 의한 Caenorhabditis elegans 감수분열의 교차 빈도 및 분포

1.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68183

⸱

2025년 7월 11일

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 2Department of Genetic Engineering, Faculty of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 3Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 Caenorhabditis elegans에서 감수분열 동안 교차 빈도 및 분포를 측정하는 방법을 제공합니다. 염색체의 기원을 결정하기 위해 Real-time PCR을 사용한 single-nucleotide polymorphism genotyping을 사용했습니다. 4점 매핑을 통해 각 염색체의 왼쪽, 중앙 및 오른쪽 팔 영역의 교차 분포를 결정할 수 있었습니다.

초록

Caenorhabditis elegans 는 감수분열 연구를 위한 훌륭한 모델 유기체입니다. 짧은 생식 주기, 많은 자손, 이미징을 위한 투명한 몸체와 같은 일반적인 이점 외에도 6쌍의 상동 홀로센트릭 염색체가 있습니다. 강력한 크로스오버 간섭과 크로스오버 분포에 대한 규제가 있습니다. 교차 빈도를 측정하기 위해 가시적 마커 매핑, snip-SNP 매핑 및 교차 형성의 전구체로서 세포학적 마커의 정량화가 개발되었습니다. 여기에서는 예쁜꼬마선충의 난자형성(C. elegans oogenesis)에서 교차(crossover) 빈도와 분포를 측정하기 위해 변형된 SNP 유전형 분석법을 소개합니다. 이 방법은 제한 소화 및 겔 전기영동의 힘든 단계를 생략하고 절단되지 않은 DNA 밴드의 모호한 판단을 피할 수 있습니다. 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 유전형 분석은 Bristol/Hawaiian 하이브리드 균주를 사용하여 수행됩니다. 자웅동체와 myo-3p::GFP를 발현하는 수컷을 교배하면 난자 발생에 집중할 수 있습니다. 단일 웜 용해물은 6개의 염색체 모두에 대해 충분한 DNA 템플릿을 생성합니다. 5' 엑소뉴클레아제 기반 TaqMan 화학 및 SNP 특이적 마이너 그루브 바인더(MGB) 프로브를 사용하면 약 97.7%의 유전형 분석률로 SNP를 정밀하게 검출할 수 있습니다. 당사는 SNP의 정확한 검출을 활용하여 예쁜꼬마선충의 교차 빈도를 측정합니다. 이 방법은 또한 수컷 또는 교차 결함 돌연변이의 교차 빈도를 결정하고 보다 구체적인 염색체 간격에 적용할 수 있습니다.

서론

상동 염색체 간의 교차 형성은 염색체의 적절한 분리와 유전적 다양성 생성에 필수적입니다1. 교차 형성의 오류는 이수성을 유발하여 불임, 유산 및 선천적 결함으로 이어질 수 있습니다2. 교차빈도는 염색체 영역, 돌연변이 유형, 연령 및 성별에 따라 다르며, 이러한 각 조건에서 교차빈도를 정확하게 측정해야 할 필요성을 강조합니다 3,4,5. 이 방법의 전반적인 목표는 각 염색체 도메인의 교차 빈도를 정확하게 측정하여 C. elegans 염색체의 전체 길이에 걸친 교차 분포를 정확하게 결정하는 것입니다.

전통적으로 형태학적 마커를 사용한 2점 매핑은 교차 빈도 6,7,8,9,10을 측정하는 데 사용되었습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서는 염색체 지도를 만들기 위해 덤피(dumpy), 짧은, 뚱뚱한 몸체(Dpy) 및 조정되지 않은 운동(Uncoordinated movement, Unc) 표현형이 자주 사용됩니다6. 이 방법의 장점은 비용이 저렴하고 많은 자손을 분석할 수 있다는 것입니다. 이러한 방법의 단점은 관심 유전자 자리를 선택하는 데 제한이 있고 표현형이 보이지 않기 때문에 치명적인 자손을 사용할 수 없다는 것입니다. 부위 선택의 불편함을 극복하기 위해 Tc1 transposons는 다형성 서열 표지 부위(STS)11,12에 대한 마커로 사용되었습니다. Tc1은 PCR 및 전기영동을 사용하여 검출할 수 있습니다. 표준 Bristol N2 균주에는 Tc1 transposon이 30개 있는 반면, 프랑스의 Bergerac에서 분리된 C. elegans(RW7000 및 DP13)에는 Tc1 사본이 500개 있었습니다. 따라서, Tc1 transposons의 수와 분포는 분리물마다 다르며, 이는 PCR에 의해 분리된 웜 사이의 잡종 웜 자손의 염색체를 분석하는 데 사용됩니다. 그 후, SNP는 교차 빈도 및 분포를 측정하기 위해 사용되었다 13,14. Bristol N2와 Hawaiian CB4856 균주 사이의 SNP는 1,000 bp15,16마다 나타났습니다. SNP는 PCR, 제한 분해 및 전기영동을 사용하여 RFLP(restriction fragment length polymorphism)로 검출됩니다. 최근에, Bristol N2와 Hawaiian CB4856 사이의 SNP뿐만 아니라 작은 삽입/삭제(InDel) 부위가 보다 효율적인 마커17로 제안되었다. 그러나 Tc1, RFLP 및 InDel을 사용하여 교차 주파수를 측정하려면 PCR, 제한 효소 처리 및 전기영동과 같은 노동 집약적인 공정이 필요합니다. 대규모 분석에서 각 공정이 최적화되지 않은 경우 PCR의 정확도, 사용된 제한 효소의 유형, DNA 절단의 효율성, 전기영동 중 밴드의 선명도 및 분리와 같은 요인으로 인해 결과가 잘못 해석될 수 있습니다. 반면, 제안된 방법은 Real-Time PCR에 의한 SNP 유전형 분석을 활용하여 정확하고 정밀한 정량화를 용이하게 합니다.

크로스오버는 염색체를 따라 무작위로 분포되지 않습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 경우, 단일 교차는 팔에서 더 자주 형성되는 경향이 있으며 중앙에서 억제됩니다 3,5. 형태학적 2점 매핑은 마커 유전자 외부에서 교차가 발생하는 위치를 식별할 수 없습니다. 반대로, SNP 매핑은 마커의 증가를 허용하고 전체 염색체 5,14,18을 따라 교차의 정확한 영역을 결정하는 데 도움이 되는 것으로 나타났습니다. 이 연구에서는 Rockman과 Kruyglyak5이 제안한 염색체 도메인 경계를 사용하고 분석을 위해 염색체의 양쪽 끝과 중심/팔 경계의 양쪽 끝에 있는 4개의 SNP를 선택했습니다.

기존 방법을 활용하여 각 염색체의 좌완, 중앙, 오른팔 간의 교차를 측정하기 위해 TaqMan, 5' nuclease19를 이용한 Real-time PCR을 통한 정확하고 신속한 SNP 검출 방법을 제안하였습니다. 이전 연구20,21,22와 비교했을 때, 대체 기술에 비해 본 방법의 장점은 정확성과 단순성이다. 이 방법은 예쁜꼬마선충에 대한 qPCR 적용 교차 분석 방법으로, 감수분열을 연구하는 연구자에게 널리 적합합니다.

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프로토콜

1. 첫 번째 유전자 십자가

  1. 35mm 접시에 작은 OP50 반점(직경 ~5mm)이 있는 일반 선충 성장 배지(NGM) 플레이트로 구성된 짝짓기 플레이트를 준비합니다.
  2. Bristol N2 균주(또는 Bristol 배경을 가진 돌연변이)의 L4 자웅동체 3마리와 Hawaiian CB4856 균주의 젊은 성인 수컷 9마리를 짝짓기 플레이트에 추가합니다(그림 1A).
    참고: 배아 치사율이 높은 돌연변이를 분석하려면 이 십자가에서 브리스톨과 하와이 배경을 모두 가진 균형 잡힌 돌연변이를 사용해야 합니다. 하와이 배경을 가진 돌연변이를 얻으려면 브리스톨 돌연변이가 모든 관심 SNP 사이트가 하와이 배경을 가질 때까지 하와이 균주와 최소 6번 교배해야 합니다. 결과적으로, 하와이 돌연변이는 돌연변이 영역과 밸런서 염색체에서만 브리스톨 배경을 포함합니다.
  3. 두 균주를 짝짓기 위해 20 ° C에서 1.5 일 동안 플레이트를 배양합니다. OP50을 사용하여 각 양성동체를 새로운 개별 NGM 플레이트로 옮깁니다.
  4. 플레이트를 20°C 인큐베이터에 1일 동안 넣어 수정란을 낳을 수 있도록 합니다. OP50을 사용하여 각 양성동체를 새로운 개별 NGM 플레이트로 옮깁니다.
  5. 수정란을 다시 낳을 수 있도록 20°C 인큐베이터에 1일 동안 플레이트를 놓습니다. 자웅동체를 제거하십시오. 20 ° C 인큐베이터에서 0.5-1 일 동안 플레이트를 유지하여 자손을 L4로 성장시킵니다.

2. 두 번째 십자가

  1. 6 개의 교차 된 L4- 자웅 동체 (브리스톨 / 하와이 잡종)와 12-15 ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p :: GFP :: LacZ :: NLS + (pSAK4) myo-3p :: 미토콘드리아 GFP + dpy-20 (+)] I (TTS24) 브리스톨 수컷을 새로운 짝짓기 플레이트에 선택합니다 (그림 1B).
    참고: ccIs4251 삽입 균주는 Caenorhabditis Genetics Center에서 얻은 것으로, 야생형 N2 균주와 6회 이상 교배해야 합니다.
  2. 플레이트를 인큐베이터에서 1.5°C에서 20일 동안 보관하여 짝을 이룹니다. OP50을 사용하여 각 자웅동체를 새 NGM 플레이트로 옮깁니다.
  3. 플레이트를 20°C 인큐베이터에 1일 동안 넣어 수정란을 낳을 수 있도록 합니다. OP50을 사용하여 각 양성동체를 새로운 개별 NGM 플레이트로 옮깁니다.
  4. 접시를 20 ° C 인큐베이터에서 1 일 동안 보관하여 수정란을 다시 낳을 수 있도록합니다. 각 부모 자웅동체를 3μL의 용해 완충액이 있는 PCR 튜브로 옮겨 첫 번째 교차가 성공적이었는지 확인합니다.
  5. 염색체 V의 지구에 있는 PCR에 의하여 브리스톨/하와이안 잡종으로 부모의 유전자형을 검사하십시오.2.5% 아가로스 젤 전기 이동법으로 밴드를 분리하십시오.
    1. SNP(WBVar01973670)에서 브리스톨 게놈의 PCR 앰플리콘 길이는 220 bp이고 하와이 게놈의 PCR 앰플리콘 길이는 196 bp입니다. PCR 결과가 부모가 브리스톨 동형접합자인 것으로 나타나면 이는 첫 번째 교배의 자가 수정 때문입니다. 추가 분석을 위해 이러한 벌레의 자손을 사용하지 마십시오.

3. 샘플링

  1. 50mM KCL, 10mM Tris pH 8.2, 2.5mM MgCl2, 0.45% IGEPAL CA-630(NP-40), 0.45% Tween 20 및 0.01% 젤라틴과 같이 웜 용해 완충액을 준비합니다. 여과로 살균하고 실온에서 보관하십시오. 사용 직전에 3 μL의 20 mg/mL proteinase K(H2O 내)를 1 mL의 용해 완충액에 첨가하고 -20 °C의 부분 표본에 보관합니다.
  2. 웜을 개별 PCR 튜브에 추가하기 전에 형광 해부 현미경으로 두 번째 십자가의 자손의 체벽 근육에서 GFP의 발현을 확인하십시오. 배율은 6.1-55x이고 사용 된 파장은 440-460 nm입니다.
  3. GFP 양성 단일 웜을 선택하고 3μL의 웜 용해 완충액이 들어 있는 각 PCR 튜브에 추가합니다(그림 1C). 360개의 PCR 튜브 각각에서 총 360개(90 x 4 생물학적 복제물)의 성인 수컷 교배 자손을 수집합니다.
    참고: 자가 수정 자손을 선택하지 않으려면 GFP 양성 기생충을 샘플링에 선택해야 합니다. L4보다 어린 교미하지 않은 자웅동체도 상염색체 분석에 사용할 수 있지만 X 염색체 수가 다르기 때문에 L4로 성장한 후 수컷과 자웅동체를 식별하고 X 염색체를 분석할 때 샘플링해야 합니다.
  4. 샘플을 -80°C 냉동고에 5분 동안 넣습니다. 용해가 시작될 때까지 샘플을 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
  5. 배아 치사율이 높은 돌연변이를 분석할 때 살아있는 유충 대신 죽은 배아를 수집하여 편향되지 않은 결과를 얻으십시오. 배아를 수집하려면 0.5μL의 키티나제 용액(20mg/mL 키티나제, 50mM NaCl, 70mM KCl, 2.5mM MgCl2, 2.5mM CaCl2)이 든 피펫 팁을 사용합니다. 산란 후 4시간 이내에 배아를 수집합니다.
    참고: 4시간 이상 전에 낳은 죽은 배아는 게놈 DNA의 분해로 인해 PCR 분석에 적합하지 않습니다.

4. 샘플 용해

  1. 열 순환기의 PCR 튜브를 60°C에서 1시간 동안 설정한 다음 95°C에서 15분 동안 설정합니다. 각 튜브에 뉴클레아제가 없는 물 100μL를 넣고 잘 섞습니다.
  2. Real-Time PCR에 의한 SNP 유전형 분석을 시작할 때까지 -20°C에서 시료를 보관하십시오.

5. SNP 유전형 분석

  1. 다음과 같이 혼합물을 만듭니다(그림 2). 1.5mL 튜브에 마스터 믹스 125μL, SNP 유전형 분석 6μL(40x), 증류수(DW) 280μL, 순방향 프라이머(450nM), 역방향 프라이머(450nM), 프로브 1(100nM), 프로브 2(100nM)를 추가합니다.
    참고: 프로브와 프라이머는 표 1에 나열되어 있습니다.
  2. 균일한 농도를 보장하기 위해 여러 번 피펫팅하여 철저히 혼합하십시오. 12채널 마이크로피펫을 사용하여 지지 베이스에 있는 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 혼합물 4μL를 추가합니다.
  3. 각 유전체 DNA를 함유한 용해물 1μL를 각 웰에 첨가하고 여러 번 피펫팅하여 혼합합니다.
  4. 양성 대조군, 즉 브리스톨 동형접합체, 하와이 동형접합체, 브리스톨/하와이 하이브리드와 3개의 무템플릿 대조군을 음성 대조군으로 준비합니다(그림 3A).
  5. 광학 접착 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 애플리케이터를 사용하여 각 웰의 가장자리에 초점을 맞춰 필름을 누릅니다.
  6. 플레이트를 짧게 원심 분리하여 바닥의 액체를 모으고 액체에서 기포를 제거합니다.
  7. 플레이트를 Real-Time PCR 기기에 로드합니다. 소프트웨어에서 Create New Experiment 버튼을 클릭합니다.
  8. Properties 설정에서 Instrument type(기기 유형)을 QuantStudio 1 System으로, Block type(블록 유형)을 96-well 0.2 mL Block(96-well 0.2 mL 블록)으로, Experimental type(실험 유형)을 Genotyping(유전형 분석)으로, Chemistry(화학)를 TaqMan Reagents(TaqMan 시약)로, Run mode(실행 모드)를 Fast(고속)로 설정합니다.
  9. Method 설정에서 Volume을 5 μL로 설정하고(올바른 반응 부피가 설정과 일치하는지 확인), Cycle Count를 40 cycles(기본값)로 설정합니다. 온도 및 시간 설정을 다음과 같이 설정합니다: Pre-Read Stage 25°C에서 30초, Hold Stage (효소 활성화, 핫 스타트) 95°C에서 20초, PCR Stage 95°C에서 1초, 60°C 20초, Post-Read Stage 25°C에서 30초.
  10. Plate 설정에서 샘플과 컨트롤의 위치를 소프트웨어 화면의 각 웰과 일치시킵니다.
  11. 실험을 USB 장치에 저장하고 Real-Time PCR 기기에 로드한 다음 실행 버튼을 클릭합니다.

6. 데이터 분석

  1. 결과를 USB에 저장하고 데이터 분석을 위해 컴퓨터로 전송합니다.
  2. 아래 공식을 사용하여 실시간 델타 Rn(dRn) 데이터를 분석하며, 여기서 Rn(정규화된 리포터)은 리포터 염료 VIC 및 FAM의 형광 신호이며, 수동 참조 염료 ROX의 형광 신호로 나누어 정규화됩니다.
    dRn = Rn - 기준선
  3. 대립유전자 변별 플롯을 검토합니다.
  4. 클러스터 분리를 확인합니다(그림 3B). 대립유전자 변별 플롯에서 브리스톨 동형접합자는 오른쪽 하단 모서리에 그룹화되고, 브리스톨/하와이 하이브리드는 오른쪽 상단 모서리에 그룹화되며, 하와이 동형접합자는 왼쪽 상단 모서리에 그룹화되고, 음성 대조군은 왼쪽 하단 모서리에 그룹화됩니다. 다음 색상 코드를 사용합니다.
    빨간색: 브리스톨 대립유전자
    파란색: 하와이 대립유전자
    녹색: 이형접합적
    블랙: 네거티브 컨트롤
  5. 결과를 스프레드시트 파일로 내보내고 4개의 SNP 위치 모두에서 유전형 분석 데이터를 조합합니다. 4개의 연속된 위치에 결정되지 않은 호출이 있는 경우 N 값에서 데이터를 제외합니다. 분석을 위해 플레이트당 90개의 샘플을 사용합니다.
    1. 다음과 같이 교차를 식별합니다: 위치 #1의 SNP가 브리스톨/하와이 하이브리드이고 위치 #2-#4가 모두 브리스톨 동형접합자 [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/B] 또는 위치 #1이 브리스톨 동형접합체이고 위치 #2-#4가 모두 브리스톨/하와이 하이브리드 [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/H], 이러한 결과는 위치 #1과 #2(염색체의 왼쪽 팔 어딘가) 사이의 단일 교차를 나타냅니다. 마찬가지로, [B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/B] 또는 [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/H]의 경우 #2와 #3(염색체의 중앙 영역 어딘가) 사이에 단일 교차가 발생하고, [B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/B] 또는 [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/H]의 경우 #3과 #4(염색체의 오른쪽 팔 어딘가) 사이에 단일 교차가 발생합니다.
      참고: 더블 크로스오버에는 6가지 패턴이 있습니다. 왼쪽 및 오른쪽: [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/B] 및 [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/H], 왼쪽 및 중앙: [B/B]-[B/H]-[B/B]-[B/B] 및 [B/H]-[B/B]-[B/H], 중앙 및 오른쪽: [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/B] 및 [B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/H].

7. 통계 분석

  1. SPSS Statistics 소프트웨어(IBM)에 값을 삽입하십시오. 염색체의 좌완, 중앙 영역, 오른팔의 교차 분포를 비교하기 위해 왼팔에 교차가 있는 염색체 82개, 중심 영역에 교차가 있는 염색체 20개, 오른팔에 교차가 있는 염색체 68개를 삽입합니다.
  2. ANOVA 및 Bonferroni 보정을 수행하고 양측 p-값을 사용하여 통계적 유의성을 확인합니다. 왼팔 대 중앙 또는 WT 대 돌연변이와 같이 필요한 만큼 비교를 수행합니다.

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결과

우리는 SNP 유전형 분석 분석을 통해 예쁜꼬마선충 의 염색체 II에 있는 4개의 SNP 부위를 검출하여 염색체의 전체 길이, 왼팔, 중앙 영역 및 오른팔의 교차 형성을 정량화했습니다. SNP 검출은 제조업체의 지침에 따라 수행됩니다. 마스터 믹스에는 Taq DNA 중합효소, 열에 불안정한 우라실-N-글리코실라제(UNG), dNTP with dUTP 및 수동 참조 ROX 염료가 포함되어 있습니다. Taq DNA 중합효소는 95°C에서 활성화되어 저온에서 비특이적 증폭을 억제할 수 있습니다. UNG 및 dUTP는 이전에 증폭된 PCR 산물의 분해를 허용하여 캐리오버 오염 및 잠재적인 위양성을 방지합니다23.

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토론

여기에서는 Bristol/Hawaiian 하이브리드 종의 교배된 자손의 SNP 유전형 분석을 기반으로 C. elegans 감수분열의 교차 빈도와 분포를 측정하는 방법을 소개했습니다. 종래의 snip-SNP 방법 (RFLP)는 PCR 후에 젤 전기 이동법을 요구하고, DNA 띠의 탐지는 젤 문서화 체계를 요구하는 반면,14,18, real-time PCR를 사용하여 5' nuclease 분석실험에 의하여 SNP 유전형 분석은 힘든 전기 이동법 절차를 요구하지 않는다.

방법의 중요한 단계
이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 분석할 돌연변이가 브리스톨 균주에서 생성된 경우 SNP를 하와이 배경으로 교체해야 합니다. 일반적으로 브리스톨 돌연변이체를 하와이 ...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

균주는 NIH Office of Research Infrastructure Programs(P40 OD010440)의 자금 지원을 받는 Caenorhabditis Genetics Center(CGC)에서 친절하게 제공했습니다. 이 작업에 대해 유익한 토론을 해주신 Saito Laboratory 구성원들에게 감사드립니다. 이 작업은 일본과학진흥회(JSPS)의 KAKENHI Grant JP23K05868 to TTS의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
101-1000&무; l 피펫 팁QSP111-N-Q
0.5mol/I-EDTA 용액(pH 8.0)나칼라이 테스크14347-21
10mol/I-수산화나트륨 용액나칼라이 테스크94611-45
10X DreamTaq 그린 버퍼써모 피셔 사이언티픽 EP0713
10&무; L, 긴 팁, 그랜듀엣후카카세이, 왓슨110-207C
200&무; L, 표준 팁, 눈금후카카세이, 왓슨110-705C
한천 분말나칼라이 테스크01028-14
아가로스PH 일본PH108
오토클레이브 TOMY 모델 ES-215 고압 증기 살균기토미 세이코ES-215
Bacto Peptone 단백질의 효소 분해써모 피셔 사이언티픽 211677
붕산나칼라이 테스크05215-05
Caenorhabditis elegans 브리스톨 야생형 Caenorhabditis 유전학 센터N2
Caenorhabditis elegans 하와이 야생형Caenorhabditis 유전학 센터CB4856
염화칼슘나칼라이 테스크06729-55
ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::미토콘드리아 GFP + dpy-20(+)] I사이토 연구실TTS24원래 PD4251에서
콜레스테롤나칼라이 테스크08721-62
맞춤형 TaqMan SNP 유전형 분석써모 피셔 사이언티픽 4332077
데옥시뉴클레오티드(dNTP) 용액 혼합물뉴잉글랜드 바이오랩스N04470
DigPrint Doc 태블릿 DP-T130z바이오 도구DP-T130z
인산수소이칼륨나칼라이 테스크28726-05
해부 현미경니콘SMZ-745 C-DS
Dream Taq DNA 중합효소써모 피셔 사이언티픽 EP0713
에티듐 브로마이드 용액나칼라이 테스크14631-94
WBVar01973670용 포워드 프라이머IDT103988736atgtctcacccaaggttgaa
젤라틴나칼라이 테스크166-31
Gilson PIPETMAN 클래식 피펫써모 피셔 사이언티픽 
이지팔 CA-630시그마-알드리치18896
황산마그네슘 칠수화물나칼라이 테스크21003-75
MicroAmp 광학 96웰 반응자 플레이트써모 피셔 사이언티픽 N8010560
MicroAmp 광학 접착 필름써모 피셔 사이언티픽 4311971
미니앰프  열 순환기써모 피셔 사이언티픽 미니앰프
Mini-Sub Cell GT 수평 전기영동 시스템, 7 x 10 cm 트레이바이오 래드 연구소1704466
니치펫 EXII니치료00-NPX2-2
니치펫 EXII MULTI니치료00-NPM-12VP
피펫 메이트 NEO니치료오후 00시네오
염화칼륨나칼라이 테스크285-38
인산이수소칼륨나칼라이 테스크28720-65
프로테이나제 K써모 피셔 사이언티픽 EO0491
QuantStudio 1 Real-Time PCR 시스템, 96-well, 0.2 mL써모 피셔 사이언티픽 A40426
Quick-Load Purple 1kb Plus DNA 사다리뉴잉글랜드 바이오랩스N0550S
WBVar01973670용 리버스 프라이머IDT103988737tggctactcctagtcactga
염화나트륨나칼라이 테스크31319-45
TaqPath ProAmp 마스터 믹스써모 피셔 사이언티픽 A30866
TC 접시 35, 표준사르슈테트83.3900
트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄나칼라이 테스크35406-75
트리즈마 베이스시그마-알드리치  티1503-1KG
트윈 20요네야마 시약03706
웜스터프 웜 픽제네시 사이언티픽59-AWP
웜스터프 웜 픽 팁(90/10% Pt/Ir, 30 게이지)제네시 사이언티픽59-30PI36

참고문헌

  1. Jones, G., Kleckner, N., Zickler, D. Meiosis through three centuries. Chromosoma. 133 (2), 93-115 (2024).
  2. Hassold, T. J., Hunt, P. A. Missed connections: Recombination and human aneuploidy. Prenat Diagn. 41 (5), 584-590 (2021).
  3. Barnes, T. M., Kohara, Y., Coulson, A., Hekimi, S. Meiotic recombination, noncoding DNA and genomic organization in caenorhabditis elegans. Genetics. 141 (1), 159-179 (1995).
  4. Lim, J. G., Stine, R. R., Yanowitz, J. L. Domain-specific regulation of recombination in Caenorhabditis elegans in response to temperature, age, and sex. Genetics. 180 (2), 715-726 (2008).
  5. Rockman, M. V., Kruglyak, L. Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 5 (3), e1000419(2009).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Li, W., Yanowitz, J. L. Atm and atr influence meiotic crossover formation through antagonistic and overlapping functions in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 431-443 (2019).
  8. Rose, A. M., Baillie, D. L. The effect of temperature and parental age on recombination and nondisjunction in Caenorhabditis elegans. Genetics. 92 (2), 409-418 (1979).
  9. Villeneuve, A. M. A cis-acting locus that promotes crossing over between X chromosomes in Caenorhabditis elegans. Genetics. 136 (3), 887-902 (1994).
  10. Youds, J. L., et al. Rtel-1 enforces meiotic crossover interference and homeostasis. Science. 327 (5970), 1254-1258 (2010).
  11. Emmons, S. W., Yesner, L., Ruan, K. S., Katzenberg, D. Evidence for a transposon in Caenorhabditis elegans. Cell. 32 (1), 55-65 (1983).
  12. Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131 (3), 609-624 (1992).
  13. Hillers, K. J., Villeneuve, A. M. Chromosome-wide control of meiotic crossing over in C. elegans. Curr Biol. 13 (18), 1641-1647 (2003).
  14. Wicks, S. R., Yeh, R. T., Gish, W. R., Waterston, R. H., Plasterk, R. H. Rapid gene mapping in Caenorhabditis elegans using a high-density polymorphism map. Nat Genet. 28 (2), 160-164 (2001).
  15. Campos, T. L., Korhonen, P. K., Sternberg, P. W., Gasser, R. B., Young, N. D. Predicting gene essentiality in Caenorhabditis elegans by feature engineering and machine-learning. Comput Struct Biotechnol J. 18, 1093-1102 (2020).
  16. Fay, D., Bender, A. Snps: Introduction and two-point mapping. WormBook. , (2008).
  17. Hwang, H. Y., Wang, J. Fast genetic mapping using insertion-deletion polymorphisms in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 11 (1), 11017(2021).
  18. Davis, M. W., et al. Rapid single nucleotide polymorphism mapping in C. elegans. BMC Genomics. 6, 118(2005).
  19. Livak, K. J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay. Genet Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).
  20. Li, Q., et al. The tumor suppressor BRCA1-BARD1 complex localizes to the synaptonemal complex and regulates recombination under meiotic dysfunction in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 14 (11), e1007701(2018).
  21. Saito, T. T., Lui, D. Y., Kim, H. M., Meyer, K., Colaiacovo, M. P. Interplay between structure-specific endonucleases for crossover control during Caenorhabditis elegans meiosis. PLoS Genet. 9 (7), e1003586(2013).
  22. Saito, T. T., Youds, J. L., Boulton, S. J., Colaiacovo, M. P. Caenorhabditis elegans him-18/slx-4 interacts with slx-1 and xpf-1 and maintains genomic integrity in the germline by processing recombination intermediates. PLoS Genet. 5 (11), e1000735(2009).
  23. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  24. Kutyavin, I. V., et al. 3'-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at pcr extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28 (2), 655-661 (2000).
  25. Hammarlund, M., Davis, M. W., Nguyen, H., Dayton, D., Jorgensen, E. M. Heterozygous insertions alter crossover distribution but allow crossover interference in Caenorhabditis elegans. Genetics. 171 (3), 1047-1056 (2005).
  26. Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
  27. Meneely, P. M., Farago, A. F., Kauffman, T. M. Crossover distribution and high interference for both the X chromosome and an autosome during oogenesis and spermatogenesis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 162 (3), 1169-1177 (2002).
  28. Nabeshima, K., Villeneuve, A. M., Hillers, K. J. Chromosome-wide regulation of meiotic crossover formation in Caenorhabditis elegans requires properly assembled chromosome axes. Genetics. 168 (3), 1275-1292 (2004).
  29. Phillips, C. M., Dernburg, A. F. A family of zinc-finger proteins is required for chromosome-specific pairing and synapsis during meiosis in C. elegans. Dev Cell. 11 (6), 817-829 (2006).
  30. Mancera, E., Bourgon, R., Brozzi, A., Huber, W., Steinmetz, L. M. High-resolution mapping of meiotic crossovers and non-crossovers in yeast. Nature. 454 (7203), 479-485 (2008).
  31. Qi, J., et al. Characterization of meiotic crossovers and gene conversion by whole-genome sequencing in Saccharomyces cerevisiae. BMC Genomics. 10, 475(2009).
  32. Miller, D. E., et al. A whole-chromosome analysis of meiotic recombination in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2 (2), 249-260 (2012).
  33. Carlton, P. M., Farruggio, A. P., Dernburg, A. F. A link between meiotic prophase progression and crossover control. PLoS Genet. 2 (2), e12(2006).
  34. Tsai, C. J., et al. Meiotic crossover number and distribution are regulated by a dosage compensation protein that resembles a condensin subunit. Genes Dev. 22 (2), 194-211 (2008).
  35. Bhalla, N., Wynne, D. J., Jantsch, V., Dernburg, A. F. Zhp-3 acts at crossovers to couple meiotic recombination with synaptonemal complex disassembly and bivalent formation in C. elegans. PLoS Genet. 4 (10), e1000235(2008).
  36. Yokoo, R., et al. Cosa-1 reveals robust homeostasis and separable licensing and reinforcement steps governing meiotic crossovers. Cell. 149 (1), 75-87 (2012).
  37. Almanzar, D. E., et al. Meiotic DNA exchanges in C. elegans are promoted by proximity to the synaptonemal complex. Life Sci Alliance. 6 (4), e202301906(2023).
  38. De Los Santos, T., et al. The mus81/mms4 endonuclease acts independently of double-holliday junction resolution to promote a distinct subset of crossovers during meiosis in budding yeast. Genetics. 164 (1), 81-94 (2003).
  39. Saito, T. T., Colaiacovo, M. P. Regulation of crossover frequency and distribution during meiotic recombination. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 82, 223-234 (2017).
  40. Zalevsky, J., Macqueen, A. J., Duffy, J. B., Kemphues, K. J., Villeneuve, A. M. Crossing over during Caenorhabditis elegans meiosis requires a conserved mutS-based pathway that is partially dispensable in budding yeast. Genetics. 153 (3), 1271-1283 (1999).

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