마우스의 연수막 전이 연구를 위한 최소 침습적 수조 마그나 주입 모델

전이성 질환은 진행성 암 환자에게 가장 큰 도전으로 남아 있습니다. 연수막 전이(LM)는 암세포가 지주막(pia mater), 지주막(arachnoid mater) 및 지주막하공간(subarachnoid space)으로 퍼져 나가는 것을 말합니다. 고형 종양으로 인한 LM은 폐암(9%-25%), 유방암(5%-20%), 흑색종(6%-18%)에서 점점 더 흔해지고 있으며^1,2 이는 주로 생존 기간이 길어지고 진단 기술이 향상되었기 때문입니다. 암세포는 다음과 같은 여러 경로를 통해 연수막 공간을 침범할 수 있는데, 1) 경막, 뼈 및 신경과 같은 주변 구조를 통한 직접적인 침입; 2) 정맥계를 통한 혈기 퍼짐; 3) 암세포가 창공된 혈관을 통해 맥락막신경총으로 미끄러져 들어가고, 이어서 뇌척수액으로 채워진 심실로 들어가는 동맥 순환을 통한 진입 ^3,4,5. 연수막 공간으로 진입하는 종양 세포는 성장 인자의 결핍, 제한된 대사 중간체 및 저산소 상태를 포함한 여러 가지 문제에 직면합니다⁶. 그러나 적절한 도구와 기술이 없기 때문에 종양 세포가 이러한 경로를 탐색하고 척박한 조건을 극복하여 연수막 공간에 군집화하는 방법은 잘 알려져 있지 않습니다. 방사선 요법, 전신 치료, 척수강수강 내 주사 요법을 포함한 복합 요법의 발전에도 불구하고 LM 환자의 예후는 여전히 좋지 않으며 생존 기간은 일반적으로 2개월에서 4개월 사이입니다 3,7,8,9. 따라서 현재의 치료법을 개선하고 새로운 표적 치료법을 개발하기 위해 연수막 전이의 생물학에 대한 더 깊은 이해가 시급히 필요합니다. 이를 위해서는 LM의 복잡한 기능을 요약한 in vivo 모델을 개발해야 합니다.

간, 뼈, 뇌와 같은 장기의 전이와 달리 LM은 일반적으로 원발성 종양 진단 후 몇 년 후에 발생합니다 10,11,12. 마찬가지로, 자연 전이가 있는 마우스 모델에서는 LM이 발생률이 낮고 일반적으로 마우스가 다른 부위의 전이에 굴복한다는 사실로 인해 드뭅니다. 실험용 쥐 LM 모델은 심장내, 경동맥 또는 수조 마그나 또는 대뇌실에 직접 주입하는 등 다양한 방법을 통해 만들 수 있습니다. 암세포의 심장내 주사가 널리 사용되지만⁹ 이는 종종 두개외 종양에 상당한 부담을 주어 LM과 무관한 사망률을 초래한다. 경동맥^13,14을 통해 종양 세포를 주입하는 것과 같은 대안적 접근법은 광범위한 전문 자원을 필요로 하며 외상을 유발하는 대규모 외과적 절개를 초래합니다. 더욱이, 이 방법은 주로 연토미화(leptomeninges)보다는 뇌 조직 자체 내에서 전이를 유도하며, LM 모델을 확립하는 데 시간이 많이 걸리고 비효율적이다¹⁵. 수조 마그나(cisterna magna)에 주입하면 종양 세포가 연수막 공간(leptomeningeal space)으로 직접 전달될 수 있습니다. 여러 연구에서 LM 메커니즘을 조사하고 새로운 치료법을 평가하기 위해 이 접근법을 사용했습니다 ^6,16,17.

이 원고에서는 LM으로 더 많은 양의 마우스를 빠르고 안정적으로 생성하기 위해 직접 경피적 천자를 포함하는 편리한 trans-cisterna magna 주입 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 뇌-혈액 장벽을 우회하므로 연수체 공간에서 종양 세포의 효율적인 이종 이식을 가능하게 합니다. 또한 수술 외상과 시술 시간을 크게 줄이면서 생쥐에서 LM을 안정적으로 유도합니다. 우리는 이광자 현미경 검사와 조직학적 분석을 통해 확인된 바와 같이 뇌 실질로의 최소한의 침투로 LM의 발생을 확인했습니다. 따라서 결과 모델은 LM의 복잡한 미세환경을 충실하게 복제하여 질병 관련 세포 및 병리학적 메커니즘을 연구하고 잠재적 치료법을 평가하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

이 원고에 있는 모든 동물 절차는 ZJU-Laboratory Animal Welfare and Ethics Review Committee(ZJU20230155)에 의해 검토되고 승인되었습니다. C57BL/6J 및 NSG 마우스는 ZJU 실험실 동물 센터(ZJU Laboratory Animal Center)의 특정 병원체가 없는 조건에서 얻어져 사육되었습니다. 이 프로토콜은 쥐 폐암 세포주, 루이스 폐암종(LLC1) 및 인간 폐암 세포주, A549를 사용하며, 둘 다 GFP 및 반딧불이 루시퍼라아제로 표지됩니다. 두 세포주 모두 Dr. Xiang H. F. Zhang(미국 Baylor College of Medicine)¹⁸에 의해 제공됩니다. 여기서는 LLC1 셀을 예로 사용합니다. A549 세포의 주입 절차는 6 x 10⁴ A549 세포가 NSG 마우스에 주입된 것을 제외하고는 거의 동일합니다.

1. 주사를 위한 암세포의 준비

1. 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 10% 소 태아 혈청(FBS)과 0.1mg/mL 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 1.0 x 10⁶ LLC1 세포를 배양합니다. 세포가 70%-90% 밀도에 도달하면 0.25% 트립신/EDTA 용액 2mL를 사용하여 1분 동안 트립신화합니다. 300 x g에서 3분 동안 세포를 원심분리한 후 얼음처럼 차가운 PBS로 2x 세척한 다음 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 다시 현탁시킵니다.
2. Trypan Blue 용액과 혈구계¹⁹를 사용하여 생존 가능한 세포의 농도를 평가합니다. 세포 생존율이 90% 이상이고 대부분의 세포가 단일인지 확인합니다. 얼음처럼 차가운 PBS에서 세포 농도를 2 x 10⁶ cells/mL로 조정합니다.
3. 세포 현탁액 50μL를 별도의 마이크로 원심분리기 튜브에 분취하여 반복적인 피펫팅을 방지합니다.
4. 주입할 준비가 될 때까지 세포 현탁액을 얼음 위에 두십시오. 이 프로토콜에서 마우스당 10μL의 GFP-Luciferase 표지 LLC1 세포를 주입하며, 이는 마우스당 2 x 10⁴ 세포에 해당합니다.
   참고: 주입된 세포주의 전이성 동역학에 따라 필요에 따라 세포 수를 조정합니다.

2. 마우스 준비

참고: 이 연구에서는 6-8주 된 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용했습니다.

1. 수술용 커튼으로 포장된 모든 수술 기구와 장갑을 오토클레이브합니다. 벤치탑 및 비수술 장비를 75% 에탄올로 소독한 다음 작업 영역을 방수 커튼으로 덮습니다.
2. 시술 후 회복을 위해 깨끗한 동물 사육장과 보온 패드를 준비합니다.
3. 2% 트리브로모에탄올(200mg/kg)을 피하주사하여 마우스를 마취합니다. 진행하기 전에 핀치 테스트를 사용하여 마취 깊이를 확인하십시오. 마우스가 마취된 후 각막 손상으로부터 눈을 보호하기 위해 멸균 안과 연고를 바르십시오.
4. 가위를 사용하여 후두부의 털을 면도한 다음 제모 크림을 바르면 같은 부위의 털이 완전히 제거됩니다.
5. 엎드린 마우스를 15mL 원심분리 튜브 위에 목을 대고 놓습니다. 머리와 허리를 테이프로 고정하고 집게 손가락으로 후두부와 C1 척추 사이의 공간을 촉진합니다(그림 1).
6. 후두부를 75% 에탄올에 적신 멸균 면봉으로 3회 닦아 소독한 후 베타딘 수술용 스크럽을 실시합니다. 동물의 멸균되지 않은 부분을 멸균 드레이프로 덮으십시오.

3. 수조 마그나 주입

알림: 개인 보호 장비 및 멸균 장갑 사용을 포함한 다음 단계에는 무균 기술이 필요합니다.

1. 세포 현탁액을 부드럽게 피펫팅하고 31G, 8mm 인슐린 주사기로 주입하기 위해 10μL를 흡인합니다.
2. 검지 손가락으로 마우스의 후두부와 C1 사이의 영역을 촉진하여 후방 후두 두개골의 아래쪽 중앙 가장자리에서 정확한 천자 부위를 찾습니다. 필요한 경우 이 사이트를 표시합니다.
3. 식별된 천공 부위를 통해 수조 마그나에 45°-50° 각도로 바늘을 삽입하여 4mm 깊이까지 전진시킵니다. 뚜렷한 돌파구는 바늘이 수조 마그나에 성공적으로 들어갔음을 나타냅니다.
   1. 천자 부위를 찾기 어려운 경우 귀 높이에서 3-5mm의 작은 절개를 만들어 후방 정중선이 노출되도록 합니다. 절개가 필요한 경우에는 수술 1시간 전에 멜록시캠(5mg/kg/day)과 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 피하투여합니다.
4. 주사기 플런저를 전진시켜 세포 현탁액을 천천히 주입하고 테이블에 손을 올려 놓고 주사기를 안정적으로 유지합니다.
5. 접종 후 두개내 압력이 평형을 이룰 수 있도록 주사기를 추가로 10초 동안 제자리에 유지합니다. 그런 다음 바늘을 빼내고 멸균 면봉으로 천자 부위를 1-2분 동안 누릅니다.

4. 주입 후 관리

1. 동물을 가열 패드의 깨끗한 케이지로 옮기고 완전히 회복 될 때까지 면밀히 모니터링하십시오.
   1. 절개한 경우 조직 접착제와 클립을 사용하여 상처를 봉합합니다. 통증을 조절하고 회복을 돕기 위해 수술 후 2-3일 동안 추가 진통제를 투여합니다.
2. 시술 후 7일 동안 생쥐를 면밀히 모니터링하고 동물의 신체 활동과 주사 부위 주변의 모습을 매일 확인합니다.

5. 연수막 종양 성장의 평가

1. 생물 발광 이미징
   1. 마우스를 마취하고 후안와 정맥에 D-루시페린(150μg/g)을 투여합니다. 마우스를 이미징 챔버에 넣고 마취 매니폴드의 지정된 노즈콘에 배치합니다. 신호 간섭을 최소화하기 위해 동물 사이에 가벼운 배플을 사용하십시오.
   2. 노출 시간이 0.5초에서 2분⁶ 사이인 IVIS 시스템을 사용하여 즉시 동물을 이미지화합니다. 머리와 척수를 가로지르는 분산 생물 발광 신호에 의해 연수막 공간에서 성공적인 종양 세포 접종을 확인합니다(그림 2A).
   3. 4일마다 생물발광 이미징으로 LM의 진행 상황을 모니터링합니다. 종양 성장 역학에 따라 이미징 간격을 조정합니다.
2. 조직학적 분석
   1. 생쥐가 현저히 활동량이 적거나 체중이 20% 감소했을 때 마취하고 피부와 갈비뼈를 잘라 흉강을 노출시킵니다. 끝이 뭉툭한 캐뉼라를 좌심실에 조심스럽게 삽입하고 캐뉼라를 상행 대동맥으로 전진시킵니다. 캐뉼러를 통해 20mL의 PBS를 동물에게 천천히 관류시킵니다.
   2. 가위를 사용하여 머리를 제거하고 두피 정중선을 절개하여 두개골을 노출시킵니다. 주변 연조직을 절제합니다. 안와 융기를 따라 자른 다음 구멍에 가위를 삽입하고 조직 손상을 방지하기 위해 위쪽 압력으로 두개골 내부 표면을 따라 조심스럽게 전진합니다.
   3. 두개골 뼈를 제거한 다음 뇌를 부드럽게 추출합니다. 4 ° C에서 24 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 뇌를 고정 한 다음 24 시간 동안 15 % 자당 PBS 용액으로 평형 화 한 다음 4 ° C에서 24 시간 동안 30 % 자당 PBS 용액으로 평형을 이룹니다.
   4. OCT(Optimal Cutting Temperature) 화합물로 채워진 극저온 몰드에 조직을 넣은 다음 드라이아이스에 30분²⁰초 동안 보관합니다.
   5. OCT가 삽입된 뇌를 저온 유지 장치를 사용하여 10μm 두께의 절편으로 자릅니다. 추가 적용이 있을 때까지 섹션을 -80 °C 냉동고에 보관하십시오.
   6. 뇌 슬라이드에서 Hematoxylin/Eosin(H&E) 염색 수행²¹. 뇌 가장자리에 종양 세포가 존재한다는 것은 전이가 연수막 공간에서만 독점적으로 발생한다는 것을 나타냅니다(그림 3 및 표 1).
3. 이광자 현미경 검사
   1. LM으로 마우스를 마취합니다. 등쪽 두개골 표면을 덮고 있는 두피를 집게와 가위로 제거합니다. 메스 날을 사용하여 두개골 표면에서 얇은 골막을 제거합니다.
   2. 얇아진 두개골을 통해 pial 혈관이 보일 때까지 연마 드릴로 두개골을 얇게 만듭니다. 조직 접착제^22,23으로 고정된 삼각형 헤드피스로 마우스 머리의 관찰 영역을 안정화합니다.
   3. 혈관 표지를 위해 안와하정맥에 0.025mL의 5%(w/v) TRITC-덱스트란을 투여합니다²².
   4. 이미징 창을 통해 이광자 현미경을 수행하고 연수막 공간을 재구성합니다(그림 4). 900nm 여기(excitation)로 450nm 방출에서 2차 고조파 형광으로 뼈를 검출²⁴. GFP 표지 종양 세포와 덱스트란 표지 혈관을 각각 900nm 및 1000nm 여기와 함께 507nm 및 572nm 방출에서 형광 신호를 수집하여 시각화합니다.
4. 입체 형광 현미경
   1. 마우스 뇌를 제거하고 실체 현미경 아래에 놓습니다. GFP 특정 필터 세트를 사용하여 GFP 표지 세포를 시각화합니다(그림 5).

그림 1은 주사를 위한 마우스의 배치와 측면 및 정면에서 본 천공 부위를 보여줍니다. 그림 2 는 다양한 접근 방식을 통해 LM을 생성하도록 테스트된 동물의 대표적인 생체 내 생물 발광 이미지를 보여줍니다. GFP-루시페라아제 표지된 LLC1 세포를 다양한 경로를 통해 동물에 주입한 후 생물 발광 이미징을 수행했습니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이, 수조 내 마그나 주입 10일 후, 생물 발광 신호는 마우스의 뇌에 존재하고 척수를 따라 분포되어 연수막 공간에서 종양 세포의 성공적인 생착을 나타냅니다. 대조적으로, 종양 세포의 경동맥 내 주사는 주사 후 21일 동안 연감절에 큰 관여 없이 주로 뇌 실질 전이를 생성했습니다(그림 2B). 심장 내 주사 방법의 경우, 누운 자세에서 생물 발광 영상은 대부분의 전이가 두개외 장기에서 자라는 것을 보여주고(왼쪽), 엎드린 자세에서 촬영한 이미지에서는 3마리의 마우스 중 어느 누구도 LM을 발병하지 않았음을 확인했습니다(오른쪽; 그림 2C). NSG 마우스에서 6 x 104 (10μL) GFP-Luciferase 표지 A549 세포의 수조 마그나 주입 10일 후 종양 세포의 동일한 분포가 관찰되었으며(그림 2D), 이러한 접근 방식이 서로 다른 세포주를 가진 다른 마우스 균주에서 LM을 강력하게 생성함을 시사합니다.

그림 3은 수조 마그나를 통해 종양 세포를 주입한 지 14일 후 뇌 조직의 조직학적 및 면역형광 염색의 대표적인 이미지를 보여줍니다. Hematoxylin-eosin (H&E) 염색은 연수막 공간에 위치한 대부분의 종양 영역을 보여줍니다(그림 3A). 그림 3B 는 대부분의 GFP 표지 종양 세포가 수막과 심실에 군집되어 있는 반면, 실질 영역의 종양 세포는 대부분 단일 세포임을 보여줍니다. 그림 4 는 LM이 있는 마우스의 연수막 공간의 대표적인 이광자 이미지를 보여줍니다. 두개골(파란색)은 900nm 여기(excitation)24와 함께 450nm 방출에서 2차 고조파 형광을 수집하여 검출되었습니다. 혈관 구조(빨간색)는 TRITC-덱스트란(70kDa)으로 표지되었습니다. GFP 표지된 종양 세포(녹색)는 두개골(파란색)과 뇌 실질 사이, 특히 연수막 영역 내에서 발견되었습니다. 그림 5 는 실체 형광 현미경을 사용하여 시각화된 뇌 표면에 GFP 표지된 종양 세포의 존재를 보여줍니다. 표 1에는 세 가지 방법 간의 비교가 표시되어 있습니다.

그림 1: 수조나 내 마그나 주사를 위한 동물 준비 및 천자 부위. (A) 마우스는 15mL 원심분리 튜브 위에 목을 걸고 엎드린 자세로 놓습니다. 머리와 허리는 테이프로 고정되어 있습니다. 바늘은 중간 하단 가장자리에서 수조 마그나에 45°-50° 각도로 삽입됩니다. (B) 바늘은 후두부 두개골의 중앙 아래쪽 가장자리에 삽입됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 다양한 주입 방법을 받은 마우스의 대표적인 생체 내 생물 발광 이미지. (가)LLC1 세포의 수조나 마그나 내 주입 후 전체 동물의 생체 내 발광 신호. (B) LLC1 세포의 경동맥 내 주사 후 마우스의 생체 내 발광 이미지. (C) LLC1 세포의 심장 내 주입 후 마우스의 생체 내 발광 신호. 왼쪽에는 누운 자세가 표시되고 오른쪽에는 엎드린 자세가 표시됩니다. (D) 수조 마그나를 통해 A549 세포를 주입한 후 NSG 마우스의 생물 발광 이미지.a 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 조직학적 및 면역형광 염색의 대표적인 이미지. (A) 대표적인 H&E 염색은 주로 수막 표면과 심실에 침착된 LLC1 세포를 보여줍니다. 눈금 막대 = 25μm. (B) LLC1 종양 보유 뇌의 면역형광 염색 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: LM이 있는 마우스의 대표적인 이광자 이미지. GFP(녹색)로 표지된 종양 세포는 두개골(파란색)과 뇌 실질(빨간색) 사이에서만 발견됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 실체 형광 현미경의 대표 이미지. (A) 현미경으로 본 마우스 뇌의 전체 시야. (B) GFP 표지된 종양 세포를 녹색 형광을 방출하는 뇌 표면에 제시했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 수술 기간, 연수막 전이의 발생률, 두개외 종양, 큰 뇌 실질 종양의 비율 측면에서 세 가지 다른 주입 방법을 비교합니다.

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.