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방법 논문

생체 내 Drosophila melanogaster에 TurboID 기반 근접 라벨링 적용

2K 조회수

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DOI:

10.3791/68193

⸱

2025년 6월 13일

 , 
1Soonchunhyang Institute of Medi-bio-Science, Soonchunhyang University, 2Department of Integrated Biomedical Science, Soonchunhyang University

이 논문에서

요약

이 연구에서는 D. melanogaster 난소의 TurboID 기반 근접 표지(PL)에 대한 세부 프로토콜을 수립하여 비오틴 보충 및 난소 절제부터 이식유전자 발현 검증 및 질량 분석을 위한 비오틴화 펩타이드 농축에 이르는 단계를 다룹니다.

초록

근접 라벨링(PL)은 단백질-단백질 상호 작용 네트워크를 매핑하는 강력한 방법입니다. 효소 라벨링, 특히 TurboID의 발전으로 생물학적 시스템 전반에 걸쳐 그 용도가 확대되었습니다. TurboID는 견고성, 무독성 및 사용 편의성으로 인해 in vivo 응용 분야에 특히 유리합니다. 이 효소는 비오틴이 있는 상태에서 약 10nm 범위 내에서 단백질과 핵산을 포함한 근처의 생체 분자를 난잡하게 비오틴화합니다. 우리는 이 방법을 적용하여 Drosophila melanogaster 난소의 생식세포에서 외부 미토콘드리아 막(OMM)에서 piwi 상호 작용 RNA(piRNA) 생물 발생의 핵심 인자인 Zucchini(Zuc)의 상호 작용체를 조사했습니다. 생식 세포에서 Zuc-TurboID를 발현하고 비오틴을 보충함으로써 Zuc-proximal 단백질의 비오틴화를 유도했습니다. 비오틴화 펩타이드의 농축에 따른 질량 분석 분석은 piRNA 생물 발생에서 잘 알려진 상호 작용자를 포함하여 Zuc에 근접한 단백질을 식별했습니다. 흥미롭게도, 우리는 단백질 접힘, 막 조직 및 소포 이동에 관여하는 Zuc의 새로운 상호작용 인자를 발견했습니다.

서론

친화성 정제-질량 분석법(AP-MS) 및 효모-2-하이브리드(Y2H) 시스템과 같은 기존의 단백질-단백질 상호 작용(PPI) 매핑 방법은 종종 저농도, 일시적 발현 또는 막 결합 단백질을 포착하지 못합니다. 이러한 한계는 살아있는 세포의 본래 생리학적 조건을 복제할 수 없기 때문에 발생합니다 1,2,3. 이러한 문제를 극복하기 위해 PL은 in vivo 하위 소기관 수준에서 고해상도 단백질체 매핑을 위한 강력한 기술로 부상했습니다. PL은 난잡한 효소와 미끼 단백질의 융합을 활용하여 효소가 수명이 짧은 반응성 분자1의 형성을 촉매할 수 있도록 합니다. 비오틴(biotin)과 같은 이러한 반응성 분자는 융합 단백질의 수 나노미터 이내에 있는 단백질을 공유 상태로 라벨링합니다4. 그 후, 비오틴화된 단백질을 분리하고 질량 분석법으로 분석하여 대규모 단백질 식별을 용이하게 합니다 5,6.

지난 몇 년 동안 PL 기술을 발전시키기 위해 다양한 난잡 효소가 개발되었습니다. 널리 사용되는 두 가지 효소는 대장균 유래 R118G 돌연변이 비오틴 리가제(BioID)와 완두콩 유래 아스코르브산 과산화효소 2(APEX2)입니다. BioID는 비오틴과 ATP를 비오티닐-5'-아데닐레이트(bioAMP)로 변환합니다1. 이 반응성 분자는 반경 10nm 이내의 인근 단백질의 라이신 잔기에 공유 결합±. BioID 기반 PL의 주요 장점은 비오틴을 사용한다는 것입니다. 이는 살아있는 유기체에서 자연적으로 발생하는 무독성 생체 분자로, 안전한 in vivo 표지를 가능하게 합니다6. 그러나 BioID는 느린 라벨링 역학(18-24시간) 및 최적의 촉매 활성을 위한 고온(37°C) 요구 사항4. 이러한 특성은 역동적인 생물학적 과정을 연구하는 데 적용하는 데 방해가 될 수 있습니다. 한편, APEX2는 비오틴-페놀과 과산화수소(H2O2)의 존재 하에서 비오틴-페녹실 라디칼의 형성을 촉매합니다7. 이러한 라디칼은 주로 티로신과 같은 전자가 풍부한 아미노산의 곁사슬과 반응하며 시스테인, 히스티딘 및 트립토판과도 결합할 수 있습니다8. 과산화효소(peroxidase enzyme)의 신속한 라벨링 기능(< 1분)은 동적 및 일시적 PPI를 포착하는 데 적합합니다9. 또한 비오틴 리가아제보다 검출 범위가 더 넓습니다(최대 20nm). 그러나 APEX2 기반 PL은 독성 산화제인H2O2에 대한 요구 사항과 비오틴-페놀의 낮은 투과성을 포함하여 생체 내 적용을 제한하는 단점이 있습니다 10.

2018년, Branon 등은 BirA( 대장균에서 발견되는 비오틴 리가제)의 35kD 돌연변이 버전인 TurboID라는 새로운 비오틴 리가제를 개발했습니다4. 이 효소는 R118 위치(R118S)에 BirA와 관련된 15개의 다른 돌연변이와 함께 돌연변이를 통합합니다. BioID보다 2배 더 높은 촉매 활성을 나타냅니다. TurboID에 의한 10분 내 비오틴화(biotinylation)는 BioID에 의한 라벨링 18시간에 필적하는 크기와 특이성을 가진 단백질체학 데이터를 생성합니다. 또한, 30 °C4에서 우수한 라벨링 활성을 보여줍니다. 따라서 TurboID는 일반적으로 각각 25°C 및 20°C에서 사육되는 초파리 또는 Caenorhabditis elegans와 같은 유기체에 적용하기에 더 적합합니다.

본 연구에서는 초파리 난소의 상호작용체 연구를 위해 TurboID 기반 PL을 활용하는 것을 목표로 합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 생식세포 세포에서 Zuc의 상호작용체를 매핑하는 데 사용됩니다. Zuc은 외부 미토콘드리아 막(OMM)에 국한된 엔도뉴클레아제로, 게놈 무결성 유지에 중요한 작은 비암호화 RNA인 piRNA의 생물 발생을 매개합니다 11,12,13. Zuc-TurboID 분석에서 확인된 비오틴화 단백질을 두 가지 추가 대조군인 NES-TurboID 및 Tom20-TurboID의 단백질과 비교하여 뚜렷한 Zuc 상호 작용 후보 물질을 정의했습니다.

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프로토콜

1. PL 성인 플라이

  1. 비오틴 식품의 준비
    1. 10M NaOH 스톡을 3중 증류수(TDW)에 희석하여 1M NaOH 용액을 준비합니다. 실온(RT)에서 보관하십시오. 0.0049g의 비오틴 분말을 20mL의 TDW에 용해시켜 1M 비오틴 스톡 용액을 준비합니다. 150-200 μL의 1 M NaOH를 첨가하여 비오틴 용해도를 높입니다. Vortex를 사용하여 용액을 균질화합니다. 비오틴 원액은 4°C에서 보관하십시오.
    2. 바이알에서 파리 음식을 꺼내 녹을 때까지 전자레인지에 2분 동안 돌립니다.
      참고: 표준 플라이 식품에는 옥수수 가루 5%, 효모 3%, 자당 10%, 한천 1%, 프로피온산 0.3%, 메틸 4-하이드록시벤조에이트 0.3%가 포함되어 있습니다13.
    3. 최종 농도 100μM로 용융된 식품에 비오틴 스톡을 첨가한 다음 볼텍싱으로 혼합합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 비오틴이 보충된 식품 4.5mL를 각 빈 바이알에 즉시 분배합니다. 음식을 30분 동안 식히고 바이알에 면 캡을 씌운 다음 비오틴 식품을 4°C에서 보관하십시오.
      알림: 음식이 식고 굳어지기 전에 비오틴을 추가해야 합니다.
  2. 비오틴 공급
    1. 조직 또는 세포 특이적 GAL4 파리로 TurboID 융합 단백질을 과발현하는 형질전환 파리를 교배하십시오 14,15,16. 음성 대조군으로, GAL4 드라이버가 있는 교차 야생형 플라이는 비오틴화 유도가 없음을 보장합니다.
    2. 교배 후 약 10일이 지나면 자손이 부화하기 시작합니다. 건조 효모 분말을 TDW에 녹이고 부드러운 페이스트로 저어줍니다. 실험용 이스트 페이스트 한 숟가락을 새 바이알 벽에 바릅니다. 새로 부화한 파리가 들어 있는 오래된 유리병을 부드럽게 두드려 바닥에 있는 파리를 모읍니다. 효모 페이스트가 들어 있는 새 바이알에 기존 바이알을 뒤집어 파리가 탈출하지 않도록 두 바이알의 테두리가 정렬되었는지 확인합니다.
    3. 이 바이알을 함께 두드려 기존 바이알에서 새 바이알의 바닥 부분으로 파리를 옮깁니다. 파리가 옮겨지면 새 바이알과 기존 바이알 모두에 면 캡을 단단히 다시 놓습니다. 3일 동안 기다립니다. 효모 페이스트는 RT에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다.
      참고: 파리는 일시적으로만 기절하기 때문에 가능한 한 빨리 파리 이동을 수행해야 합니다.
    4. 50mL TDW에 프로피온산 스톡 250μL를 희석하여 0.5% 프로피온산 용액을 준비합니다. RT에 보관하십시오.
    5. 3일째 에는 100M 비오틴 스톡을 TDW에 희석하여 1μM 비오틴 작업 용액을 준비한 다음 500μL의 0.5% 프로피온산을 첨가합니다. 비오틴 작업 용액과 건조 효모 분말을 혼합하고 페이스트가 될 때까지 저어줍니다. 비오틴 효모 페이스트를 한 숟가락 가득 담아 비오틴 식품 바이알 벽에 넣습니다. 비오틴-효모 페이스트는 RT에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다.
    6. 파리를 두 그룹으로 나눕니다. 한 그룹을 일반 식품 바이알에 대조군으로 유지하고 다른 그룹을 비오틴 식품 바이알(비오틴-효모 페이스트 추가)로 옮겨 비오틴화를 시작합니다. 비오틴화(biotinylation) 16시간 후, 이송은 뉴 노멀 푸드 바이알(New Normal Food Vial)로 날아갑니다.
      참고: 이전에 4시간, 8시간 및 16시간 동안 비오틴 공급 테스트를 수행했습니다. 비오틴화(biotinylation) 신호는 16시간 섭식 후 가장 강했기 때문에 후속 실험을 위해 이 시점을 선택했습니다.
  3. 초파리 난소 수집
    1. CO2 플라이 패드에 파리를 넣고 암컷은 유지하고 수컷은 버립니다. 파리가 제대로 마취된 후(더 이상 움직이지 않음) 차가운 Grace의 곤충 배지 1mL를 해부 접시에 피펫팅합니다.
    2. 가는 팁 집게를 사용하여 해부 접시로 파리를 가져가 매체에 담그십시오. 집게로 파리 흉부를 잡고 몸이 부수지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 다른 집게를 사용하여 후복부(생식기 부분이 있는 곳)의 끝을 부드럽게 제거합니다.
    3. 집게를 사용하여 난소를 천천히 짜냅니다(상복부에서 시작하여 아래쪽으로).
    4. 일단 제거되면 난소를 둘러싼 근육 그물과 기타 조직을 제거합니다. 난소가 손상되지 않도록 주의한다.
    5. 겸자를 사용하여 깨끗한 난소를 1.7mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오. 다음 플라이에 대해 1.3.2 - 1.3.4 단계를 반복합니다.
    6. 3,500 x g 에서 4°C에서 30초 동안 튜브를 회전시킨 다음 마이크로피펫 팁을 사용하여 남은 매체를 제거합니다. 난소를 만지지 않도록 주의한다.
    7. 튜브를 액체 질소로 스냅 동결한 다음 난소를 -80°C에서 보관합니다. 난소 샘플은 1년 동안 안정적입니다.

2. 웨스턴 블롯 분석법에 의한 Transgene 발현 및 biotinylated 단백질 검출

참고: 웨스턴 블롯 분석의 경우 샘플당 약 5쌍의 난소를 수집합니다.

  1. 조직 용해
    1. 얼어붙은 난소 조직을 해동합니다. 50μL의 RIPA 용해 완충액(50mM Tris-HCl pH 8, 150mM NaCl, 0.1% 도데실황산나트륨(SDS), 0.5% 데옥시콜산나트륨, 1% 트리톤 X-100)을 추가하고 1x 프로테아제 억제제(PI) 칵테일과 1mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)를 보충합니다. RIPA 용해 완충액(1x PI 칵테일 및 1mM PMSF 제외)을 4°C에서 보관합니다.
      참고: PI 칵테일 및 PMSF는 실험 직전에만 추가해야 합니다.
    2. 플라스틱 유봉과 결합된 휴대용 균질화기를 사용하여 난소를 파괴합니다(튜브당 1분). 완전한 용해를 보장하기 위해 얼음에서 10분 동안 조직 용해 과정이 필요하며 그 후 균질화가 이루어집니다.
    3. 13,500 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기를 사용하여 파편에서 단백질 용해물을 분리합니다.
    4. 피펫 투명 단백질을 새 1.7 mL 튜브에 용해시킨 다음(지질층을 맨 위에 두지 마십시오) 용해물을 -20 °C에서 계속 사용할 때까지 보관합니다.
  2. Bicinchoninic acid (BCA) 분석에 의한 단백질 농도 측정
    1. 시약 A와 시약 B를 50:1 비율로 혼합하여 Bicinchoninic acid(BCA) 작업 시약(WR)을 준비합니다. 96-well 플레이트(중복)에서 1μL의 용해물 또는 희석된 BSA 표준물질을 200μL의 WR과 혼합한 다음 37°C에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
      1. 다음 공식을 사용하여 필요한 WR의 양을 계산합니다.
        (# 표준물질 + # 샘플) × (# 반복) × (샘플당 WR 부피)
        단백질 표준물질 세트를 만들기 위해 최종 농도가 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 및 2000μg/mL인 RIPA 용해 완충액(PI 칵테일 및 PMSF 제외)에 2mg/mL 소 혈청 알부민(BSA)을 여러 번 희석합니다.
    2. 495nm 파장에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도를 측정합니다. BSA 흡광도 값에서 표준 곡선을 생성한 다음 단백질 농도를 측정합니다.
  3. 웨스턴 블롯 분석
    1. 전기영동
      1. 30-50 μg의 단백질 용해물을 2x SDS 로딩 버퍼에 추가합니다. TDW(필요한 경우)를 추가하여 최종 2 μg/μL 단백질 농도와 1x SDS 최종 농도를 만든 다음 샘플을 95°C에서 10분 동안 끓입니다.
      2. 25mL의 20x MOPS 완충액과 500mL의 TDW를 혼합하여 1x 농도의 러닝 버퍼를 만들어 러닝 버퍼를 준비합니다. RT에 보관하십시오.
      3. Bis-Tris 겔의 웰을 러닝 버퍼(3x) 1mL로 헹군 다음 Bis-Tris 겔을 전기영동 챔버에 넣습니다. 모든 웰이 잠길 때까지(± 250mL) 챔버의 전면을 새 러닝 버퍼로 채웁니다. 챔버의 뒷면을 사용한 러닝 버퍼로 채웁니다(사용된 새 러닝 버퍼 부피의 절반이면 충분함).
      4. 샘플을 Bis-Tris 겔에 로드하고 4μL의 사전 염색된 단백질 래더를 마커로 사용합니다. 전기영동(200V, 30분)을 수행합니다. 카세트에서 젤을 제거하고 TDW로 헹굽니다.
    2. 멤브레인 블로팅
      1. 430mL의 TDW에 20mL의 이송 완충액(25x stock)과 50mL의 메탄올을 첨가하여 이송 완충액을 만듭니다.
      2. 블로팅 패드, 여과지, 젤 및 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 구성된 샌드위치를 블롯 모듈에 배열합니다. 새 레이어를 쌓기 전에 롤러를 사용하여 거품을 제거하십시오.
      3. 블롯 모듈을 트랜스퍼 챔버에 설치한 다음 챔버에 500mL의 트랜스퍼 버퍼를 채웁니다. 175mA에서 1시간 동안 단백질을 전달합니다.
        참고: 전송 버퍼는 실험 전에 새로 준비해야 합니다.
    3. 블로킹
      1. 5mL의 Tween20 스톡을 45mL의 TDW에 첨가하여 10% Tween20 스톡 용액을 만듭니다. 인산염 완충 식염수(PBS) 정제 2정을 TDW 400mL에 녹입니다. 용액 4mL를 제거한 다음 10% Tween20(최종 농도 0.1%) 4mL를 추가하여 1x PBST 용액을 만듭니다. RT에 보관하십시오.
      2. 전사 챔버에서 블로트된 멤브레인을 제거한 다음 1x PBST로 헹굽니다.
        참고: 멤브레인을 다른 항체로 배양해야 하는 경우 차단 단계를 수행하기 전에 예상되는 단백질 크기에 따라 깨끗한 스테인리스 스틸 블레이드로 절단합니다.
      3. 유전자 발현을 확인하려면 차단 단계(1시간, RT)에 대해 1x PBST에 2% BSA를 사용합니다. 50mL의 1x PBST에 1g BSA를 첨가하여 2% BSA 용액을 만듭니다. 비오틴화된 단백질 검출의 경우, 1x PBST(하룻밤, 4°C)에서 3% BSA를 사용하여 차단을 수행합니다. 1.5 g의 BSA 분말을 1x PBST 50 mL에 용해시켜 3% BSA 용액을 만듭니다. 차단 용액은 4°C에서 보관하십시오.
        참고: 사용된 BSA는 BCA 분석에 사용된 것과 다릅니다. BCA 분석용 BSA는 BCA 키트의 일부입니다.
    4. 1차 항체 배양
      1. 2% BSA(1: 10,000) 10mL와 하우스키핑 유전자 α-HSP90 10μL에 α-V5 1μL를 2% BSA(1: 1,000)에 희석합니다. 2.7μL의 스트렙타비딘-양고추냉이 과산화효소 접합체(SA-HRP)를 9mL의 1x PBST 용액에 추가하여 0.3μg/mL SA-HRP 용액을 만듭니다.
      2. 유전자 발현을 확인하려면 4°C에서 하룻밤 동안 1차 항체가 있는 멤브레인을 배양합니다. 비오틴화된 단백질을 검출하려면 4°C에서 1시간 동안 멤브레인을 배양합니다. 1차 항체는 4°C에서 다시 보관하십시오. 여러 번 사용할 수 있습니다.
      3. 1x PBST로 멤브레인을 3회 RT에서 각각 15분 동안 세척합니다.
    5. 2차 항체 배양
      1. 2% BSA 10mL(1: 5,000)에 2μL의 염소 항토끼 또는 항마우스 IgG(양고추냉이 과산화효소(HRP) 접합)를 첨가하여 2차 항체 용액을 준비합니다.
        참고: SA-HRP의 경우 2차 항체가 필요하지 않습니다. 시각화 단계로 바로 진행합니다. 2차 항체는 실험 전에 새로 희석해야 합니다.
      2. 2차 항체 용액에서 멤브레인을 RT에서 40분 동안 배양합니다. RT에서 1x PBST로 멤브레인을 3x 세척하여 각각 15분 동안 세척합니다.
    6. 향상된 화학발광(ECL) 방법을 사용한 단백질 검출
      1. 750μL의 루미놀과 750μL의 HRP 용액(1:1 비율)을 혼합합니다. 혼합물을 준비하는 동안 세척 버퍼에서 멤브레인을 촉촉하게 유지하십시오.
        참고 :이 혼합물은 실험 전에 신선하게 준비해야합니다. 화학 물질은 빛에 민감하므로 햇빛이나 기타 강렬한 광원에서 멀리 두십시오(실험실 조명에 단기간 노출되어도 괜찮습니다).
      2. 멤브레인을 용액에 30초 동안 담근 다음 투명 플라스틱 시트 사이에 놓습니다. Chemidoc 기기로 블로팅된 단백질 띠를 관찰합니다.

3. 면역형광 염색에 의한 Transgene 발현 및 국소화 검증

참고: 유전자 발현 및 국소화를 확인하려면 효모 페이스트를 먹인 생후 2일 된 암컷의 샘플당 약 5쌍의 난소를 해부합니다. 어린 난소는 주로 난실의 초기 단계를 포함하고 있으며, 이는 간호사 세포(생식세포 세포)가 풍부하고 상대적으로 투과성이 있는 막으로 인해 면역형광 염색에 이상적입니다17. 난자 챔버의 후기 단계는 9단계에서 시작되는 난자 껍질 복합체의 형성으로 인해 더 단단하고 침투하기 어렵습니다18. 단백질 비오틴화(biotinylation) 검사의 경우, 1.2단계에서 설명한 대로 비오틴을 먹인 생후 4일 된 암컷의 샘플당 약 5쌍의 난소를 해부합니다.

  1. 시료 전처리
    1. 절개된 난소의 뒤쪽 부분을 집게를 사용하여 제자리에 고정합니다. 다른 집게를 사용하여 난소를 개별 난실로 부드럽게 떼어냅니다. 난실이 파열되지 않도록 조심스럽게 작업하십시오. 난자 챔버 분리 프로토콜은19항에 자세히 설명되어 있습니다. 난자를 1.7mL 튜브에 조심스럽게 피펫으로 넣은 다음 1x PBS(RT) 1mL로 세척합니다. 피펫팅하기 전에 피펫 팁의 가장자리를 잘라 계란 챔버가 팁에 끼는 것을 방지하십시오.
      알림: 계란 챔버는 s에서만 사용하십시오.tage ≤ 9(투명한 것). 성숙한 난모세포와 말기 난자실을 버리십시오 10≥. 피펫팅은 난자가 용액에 떠다니게 합니다. 따라서 다음 단계를 진행하기 전에 난자가 바닥에 가라앉도록 (5분 동안) 합니다.
  2. 고정
    1. 16% 포름알데히드(FA) 스톡 3.125mL를 1x PBS 6.875mL에 희석하여 5% FA 용액을 만듭니다. RT에 보관하십시오.
      참고: FA는 빛에 민감하므로 빛을 피하십시오.
    2. 5% 포름알데히드(FA) 1mL를 난모세포가 들어 있는 튜브에 피펫팅합니다. 튜브를 다중 회전기에 놓고 30분 동안 난모세포를 고정합니다.
      참고: 고정부터 핵 염색 단계까지 실험은 완만한 회전으로 다중 회전체에서 수행됩니다.
    3. 1x PBS (1x PBT) 10% Triton X-100 스톡 10mL를 1x PBS 190mL에 첨가하여 세척 용액으로 0.5% Triton X-100을 준비합니다. RT에 보관하십시오.
    4. 고정된 난석을 1번 헹구고 3분 동안 RT에서 10번 씻습니다. 헹굼 및 세척 단계 모두에 1x PBT 1mL를 사용하십시오.
  3. 블로킹
    1. 1x PBT 4.75mL에 250μL의 FBS 스톡을 첨가하여 5% 소 태아 혈청(FBS)을 준비합니다.
      참고: 이 용액은 실험 전에 새로 만들어야 합니다.
    2. 튜브에 5% FBS 1mL를 추가하고 RT에서 1시간 동안 차단 단계를 수행합니다.난모세포를 1번 헹굽니다.
  4. 1차 항체 배양
    1. 전이유전자 발현 및 국소화를 확인하기 위해 2μL의 α-V5와 2μL의 α-ATP5A 또는 α-Tom20(미토콘드리아 마커)을 400μL의 1x PBT(1:200 비율)로 희석합니다.
      참고: 두 개의 항체를 함께 사용하여 하나의 샘플을 염색할 수 있지만 숙주는 달라야 합니다. 이는 후속 2차 항체의 중복 결합을 피하기 위한 것입니다.
    2. 400 μL의 희석된 1차 항체 용액으로 난실을 배양합니다(하룻밤, 4 °C).
      참고: 웨스턴 블롯 분석과 유사하게, 1차 항체는 면역 염색에 여러 번 사용할 수 있습니다. 항체 용액을 다시 보관하기 전에 난자가 없는지 확인하십시오.
    3. 난자를 1회 헹구고 RT에서 3분 동안 10회 세척합니다.
  5. 2차 항체 배양
    1. 염소 α-RB IgG Alexa Fluor 488 2μL와 염소 α-M IgG Alexa Fluor 594 2μL를 1x PBT(1:200 비율) 400μL로 희석합니다. RT에서 2시간 동안 400μL의 희석된 2차 항체 용액으로 난실을 배양합니다. 비오틴화(biotinylation) 검출을 위해 1x PBT(1:200 비율)에 2μL의 스트렙타비딘 접합 Alexa Fluor 594를 첨가하고 2차 항체와 함께 배양합니다.
      알림: 이 단계에서 샘플을 빛으로부터 보호하십시오. 2차 항체는 실험 전에 새로 희석해야 합니다. 여러 개의 2차 항체를 함께 사용할 수 있지만, 각 1차 항체는 중복되는 신호를 피하기 위해 서로 다른 호스트에서 유래한 다른 형광단에 할당되어야 합니다. 예를 들어, 488 염소 α-Rb는 토끼 α-V5에 바인딩됩니다. 마우스 α-ATP5A의 경우, 594 Goat α-M이 상보적인 2차 항체로 사용됩니다. 비오틴화(biotinylation) 검출의 경우, 스트렙타비딘 접합체와 동일한 파장을 가진 다른 염료의 사용은 생략해야 합니다.
    2. 난자를 1회 헹구고 RT에서 3분 동안 10회 세척합니다.
  6. 핵 염색
    1. 1x PBS 1mL(1:1,000 비율)에 1μL의 DAPI를 희석합니다. RT에서 1mL의 희석된 DAPI 용액으로 난실을 5분 동안 배양합니다.
      참고: DAPI는 실험 전에 새로 희석해야 합니다.
    2. 난자를 1회 헹구고 RT에서 3분 동안 10회 세척합니다.
      알림: 계란 챔버는 장착하기 전에 1°C에서 4x PBS 용액에 몇 시간 동안 보관할 수 있지만 가능한 한 빨리 진행하는 것이 좋습니다.
  7. 슬라이드 장착
    1. 보푸라기가 없는 티슈로 유리 슬라이드를 청소한 다음 s를 기록하십시오.amp르 정보. 튜브에서 PBS 1개를 제거하되 건조를 방지하기 위해 소량은 남겨둡니다.
    2. 마이크로피펫 팁의 가장자리를 자른 다음 유리 슬라이드에 난자를 조심스럽게 피펫으로 넣습니다. 집게를 사용하여 유리 슬라이드에 달걀 챔버를 조심스럽게 분배하고 뭉치지 않도록 합니다. 현미경으로 슬라이드를 관찰하여(2배 배율로 충분함) 난자 챔버가 균등하게 분포되어 있는지 확인합니다.
    3. 마이크로피펫을 사용하여 유리 슬라이드에서 나머지 PBS를 제거합니다. 15-30 μL의 퇴색 방지 용액(감광성)을 유리 슬라이드에 피펫팅하고 모든 난실과 접촉하도록 합니다.
    4. 집게를 사용하여 슬라이드 덮개 가장자리를 잡은 다음 유리 슬라이드 위에(한쪽 가장자리에서 다른 쪽 가장자리로) 올려 달걀 챔버를 덮도록 합니다. 거품이 생기지 않도록 천천히 하십시오. 보푸라기가 없는 티슈로 여분의 용액을 닦아낸 다음 매니큐어를 사용하여 커버슬립 가장자리를 밀봉합니다. 매니큐어를 제대로 말리십시오(± 5분).
    5. 컨포칼 현미경으로 슬라이드를 이미지화합니다. 슬라이드는 -20°C에서 보관하십시오.

4. 질량 분석법을 위한 Biotinylated 펩타이드 농축

참고: 질량 분석 샘플에는 약 3mg의 단백질이 필요합니다. 따라서 약 100쌍의 난소를 절개하여 그 양을 얻어야 합니다.

  1. 조직 용해
    1. 얼어붙은 난소 조직을 해동합니다. 한편, 1TBS 정제를 500mL의 TDW에 용해시켜 1x Tris-buffered saline(TBS) 용액을 준비합니다. RT에 보관합니다. 10% SDS 스톡 4mL를 1x TBS 16mL에 희석하여 1x TBS에 2% SDS를 용해 완충액으로 준비합니다. RT에 보관합니다.
    2. 1x TBS에 포함된 2% SDS 500μL(1x PI 칵테일 보충)를 난소가 포함된 튜브에 추가합니다. 세포가 용해되고 용액이 끈적해질 때까지 몇 분 동안 기다립니다.
    3. 피펫은 AFA(Adaptive Focused Acoustics) 섬유를 포함하는 1mL 크기의 militube로 용해됩니다. 사용하기 전에 피펫 팁을 자르십시오. 효율적인 초음파 처리를 위해 튜브당 최대 500μL의 용해물을 이송하십시오.
    4. 피크 입사 전력 75W, 듀티 팩터 10%, 버스트당 사이클 200, 시간 180초, 온도 6°C 조건에서 초음파 처리를 수행합니다.
      참고 : 샘플이 여러 번 초음파 처리를 받아야하는 경우 과도한 열이 발생하지 않도록 중간에 몇 가지 간격을 설정하십시오.
  2. 아세톤 침전
    1. 용해물을 5mL low-binding tube로 옮긴 다음 sample volume의 6배로 차가운 아세톤을 튜브에 추가합니다. 예를 들어, 500μL의 용해물에 3mL의 아세톤을 추가합니다.
      알림: 아세톤은 사용하기 전에 -20 °C에서 사전 냉각해야 합니다.
    2. Vortex 튜브를 다중 회전기에 넣고 -20 ° C에서 밤새 (± 16 시간) 배양합니다.
      참고: 이것은 정지 지점이며, 이는 이 단계 후에 실험이 일시적으로 중지될 수 있음을 의미합니다.
    3. 펠렛은 4 ° C에서 15 분 동안 15,000 x g 에서 단백질을 침전시켰다. 상층액을 버리고 튜브를 4°C에서 회전시킵니다.
    4. 90% 저온 아세톤과 10% 1x TBS로 구성된 혼합 용액 2mL를 추가합니다. 펠릿과 용액을 혼합하기 위해 위아래로 피펫팅합니다. 사용하기 전에 피펫 팁을 자르십시오.
    5. Vortex tube를 사용하여 다중 회전기에 넣고 -20 °C에서 2 시간 동안 배양합니다.
    6. 펠렛 단백질을 15,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 가열합니다. 상층액을 버리고 튜브를 4°C에서 스핀다운합니다. 튜브를 열고 펠릿을 10분 동안 자연 건조합니다.
      알림: 펠릿은 나중에 다시 부유하기 어렵기 때문에 과도하게 건조하지 마십시오.
    7. 0.7906g의 ABC를 20mL의 TDW에 용해시켜 500mM 중탄산암모늄(ABC) 원액을 준비합니다. 500mM ABC 원액 3mL를 TDW 27mL에 희석하여 50mM ABC 작동 용액을 만듭니다.
    8. 50mM ABC 1mL에 0.4805g 요소를 첨가하여 8M 요소 용액을 준비합니다.
      참고: 요소 용액은 실험 전에 새로 준비해야 합니다.
    9. 단백질 펠릿을 500μL의 8M 요소에 재현탁합니다. 8M 요소의 부피를 줄여 단백질 농도를 높일 수 있습니다.
    10. 재현탁 단백질을 AFA 섬유를 포함하는 1mL 크기의 militube로 옮긴 다음 4.1.4 단계에서 설명한 것과 동일한 조건으로 초음파 처리를 수행합니다.
    11. 단백질 농도를 측정하기 위해 BCA 분석을 수행합니다. 이 단계는 중지 지점입니다. 단백질 샘플을 나중에 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
  3. 트립신 소화
    1. 5mL 저결합 튜브에 3mg 단백질과 TDW(필요한 경우)를 혼합하여 총 500μL의 용액을 만듭니다.
    2. 37°C에서 1시간 동안 450rpm에서 Thermoblock을 사용하여 단백질을 변성시킵니다.
    3. 튜브에 5μL의 1M DTT(TDW에 용해됨)를 추가하여 최종 농도를 10mM DTT로 만든 다음 37°C에서 1시간 동안 450rpm에서 열차단을 사용하여 단백질을 환원시킵니다.
    4. 0.0111g의 요오드아세트아미드를 150μL의 ABC에 용해시켜 400mM 요오드아세트아미드를 준비합니다. 튜브에 55μL의 400mM 요오드아세트아미드(최종 농도 40mM)를 추가한 다음 37°C에서 1시간 동안 450rpm에서 열차단을 사용하여 단백질을 알킬화합니다.
      참고: 요오도아세트아미드는 빛에 민감하며 모든 요오드아세트아미드 용액은 실험 전에 새로 준비해야 합니다.
    5. 총 부피가 4mL에 도달할 때까지 50mM ABC 용액을 첨가하여 샘플을 희석합니다. 희석 후 용액의 요소 농도는 약 1M입니다.
    6. 1.1098 g CaCl2를 10 mL의 TDW에 용해시켜 1 M CaCl2 원액을 만듭니다. 4μL의 1M CaCl2 스톡을 튜브에 추가하여 1mM 최종 농도를 만든 다음 위아래로 피펫팅하여 용액을 균질화합니다.
    7. ABC 1mL에 0.001g의 트립신을 첨가하여 1mg/mL 트립신 원액을 준비합니다. 튜브에 150μL의 트립신을 추가합니다(트립신: 샘플 = 1:20 비율). 37°C에서 16시간 동안 450rpm에서 Thermoblock을 사용하여 단백질을 분해합니다.
      참고: 트립신은 실험 전에 새로 용해되어야 합니다. 이 단계는 중지 지점입니다. 분해된 펩타이드는 나중에 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
  4. 비오틴화 펩타이드 농축
    참고: 세척 및 용출 완충액은 실험 전에 새로 준비해야 합니다.
    1. 1x TBS 10mL에 1.2012g 요소를 첨가하여 1x TBS 용액에 2M 요소를 준비합니다.
    2. 3mg 샘플당 150μL의 스트렙타비딘 복합 마그네틱 비드를 사용합니다. 스트렙타비딘 비드를 1x TBS에 2M 요소 1mL로 세척합니다. 이 단계를 4회 반복합니다. 각 세척 후 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 세척 버퍼를 버리십시오.
      참고: Pierce Streptavidin Magnetic Beads는 질량 분석 결과에서 PEG와 같은 배경 신호를 최소화하므로 권장됩니다.
    3. 분해된 펩타이드 1mL를 비드 함유 튜브에 피펫팅하고 부드럽게 혼합한 다음 혼합물을 5mL 저결합 튜브에 나머지 샘플과 결합합니다. 튜브를 멀티 로테이터에 놓고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
    4. 혼합물 1mL를 1.5mL 튜브에 옮기고 마그네틱 랙에 1분 동안 놓습니다. 상등액을 버리십시오. 모든 구슬이 수집될 때까지 이 단계를 반복합니다.
    5. 0.7207g의 요소를 50mM ABC 6mL에 용해시켜 50mM ABC에 2M 요소를 준비합니다. 2M 요소 1mL를 50mM 2x에 넣고 1mL의 TDW를 사용하여 비드를 한 번 세척합니다. 각 세척 후 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 세척 버퍼를 버리십시오.
    6. 10mL의 포름산 원액을 포름산 1mL를 TDW 9mL에 용해시켜 준비합니다. TDW에서 80% 아세토니트릴과 0.1% 포름산으로 구성된 용출 완충액을 준비합니다. 예를 들어, 1.2mL의 아세토니트릴, 15μL의 10% 포름산 스톡, 285μL의 TDW를 혼합하여 1.5mL 용출 완충액을 만듭니다.
      주의: 아세토니트릴과 포름산은 휘발성 특성으로 인해 유해하므로 마스크를 착용하고 취급 시 주의하십시오.
    7. 100 μL의 용리 완충액을 튜브에 피펫팅하고 부드럽게 균질화한 다음 300 rpm에서 60 °C에서 5분 동안 열차단 펩타이드를 사용하여 펩타이드를 용리합니다. 용리 후 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 용리액을 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 용리액을 옮길 때 비드를 복용하지 마십시오. 이 단계를 5회 반복합니다.
    8. 500μL의 용리액이 들어 있는 튜브를 마그네틱 랙에 5분 동안 놓은 다음 새 1.5mL 튜브로 옮겨 비드를 완전히 제거합니다. 그런 다음 용출된 샘플을 건조시켜 질량 분석 분석에 사용할 수 있습니다.
    9. 농축 펩타이드 샘플의 LC-MS/MS 분석 및 MS 데이터 처리에 대한 자세한 내용은 Nguyen et al.20을 참조하십시오.

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결과

예시 출력은 그림 1, 그림 2, 그림 3, 그림 4에 나와 있으며, 이는 이전에 Nguyen et al.20에 의해 발표되었습니다. 그림 1은 초파리 난소에서 TurboID 기반 PL의 실험 절차를 보여줍니다. 먼저 Zuc와 TurboID를 결합한 구문(Zuc-V5-TurboID)이 생성되었습니다. 잘 알려져 있고 뚜렷한 하위 소기관 거주자, 즉 핵 수출 신호(NES) 및 트랜스로케이스 외부 미토콘드리아 막(Tom20)도 TurboID(NES-V5-TurboID 및 Tom20-V5-TurboID)와 융합되었습니다. NES-V5-TurboID는 세포...

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토론

여기에서는 다양한 문제를 극복하기 위해 광범위한 문제 해결을 통해 개발된 초파리 난소의 TurboID 기반 근접 라벨링(PL)에 대한 포괄적인 절차를 제공합니다. 한 가지 주요 문제는 유전자 구조와 관련이 있었는데, 다양한 융합 레이아웃이 단백질 발현과 비오틴화(biotinylation) 효율에 큰 영향을 미쳤기 때문입니다. 예를 들어, NES-V5-TurboID는 다른 전이유전자에 비해 발현과 비오틴화가 약하여 다운스트림 분석의 해석을 복잡하게 만드는 경우가 있었습니다. 그러나 TurboID(V5-TurboID-NES)의 C-말단에 융합된 NES를 사용한 개정된 구조체는 상당히 더 강력한 발현과 비오틴화 효율을 보여주었습니다. 이러한 결과는 효과적인 세포 발현을 달성하기 위해 연구 프로세스 초기에 관심 유전자(GOI) 배열을 최적화하는 것이 중요하다는 점을 강조합니다. 사용 가능한 생물정보학 도구를 구현하여 표적 단백질과 TurboID 구조 호환성을 ...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

연구실 구성원들의 토론과 도움에 감사드립니다. 이 연구는 한국 정부(과기정통부)의 자금 지원을 받은 국립연구재단(NRF)의 지원을 받았습니다(RS-2024-00345327 to M.L.; RS-2023-00219563 to M.L.)로 변경합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
항체
Goat 항마우스 IgG(H+L) 2차 항체, HRPInvitrogen31430분석 등급, 감광성
염소 항토끼 IgG(H+L) 고교차 흡착 2차 항체, alexa fluor plus 488InvitrogenA32731분석 등급, 감광성
염소 항토끼 IgG(H+L) 2차 항체, HRPInvitrogen31460분석 등급, 감광
HSP90 항체 (토끼)세포 신호 전달 기술4874다클론 항체
Pierce Streptavidin 단백질, HRPThermo Fisher Scientific21126분석 등급
Streptavidin, Alexa Fluor 594 접합체InvitrogenS11227감광성, 분석 등급
V5 태그 항체(마우스)InvitrogenR960-25단클론 항체
V5 태그 항체(토끼)(D3H8Q)세포 신호 전달 기술13202단클론 항체
플라이 라인회사<strong>카탈로그 번호Comments/Description
pUASp Tom20 V5-TurboID/ TM3한국 초파리 스톡 센터2373-2플라이 스톡
pUASp 호박 V5-TurboID/Cyo한국 초파리 스톡 센터2188플라이 스톡
pUASP_attB_V5-TurboID-NES/Cyo한국 초파리 스톡 센터2635-4플라이 스톡
w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2HBloomington Drosophila Stock Center7062플라이 스톡
장비 및 소모품회사카탈로그 번호Comments/Description
분석 저울Mettler ToledoME2040.1 mg 가독성
Amersham Protran 0.45 NC 니트로셀룰로오스 웨스턴 블로팅 멤브레인(300 mm &x; 4 m)Cytiva
10600002-Axygen 1.7 mL MaxyClear Snaplock 미세 원심분리기 튜브CorningMCT-175-C공중합체
BRAND  커버 유리(22mm x 22mm)Sigma-AldrichBR470055붕규산 유리
벌크 피펫 팁(10 & micro; L)Vertex4110N00프로필렌
벌크 피펫 팁(1000 & micro; L)Vertex4330N00프로필렌
벌크 피펫 팁(200 & micro; L)Vertex4230N00프로필렌
세포 배양 플레이트(96웰)SPL300096폴리스티렌, 평바닥형
원심분리기(1.5-2mL 튜브 크기 로터 포함)Eppendorf5424 R고정각, 냉장
원심분리기(5mL 튜브 크기 로터 포함)Eppendorf5425 R고정각, 냉장
화학 숟가락-- 스테인레스 스틸
ChemiDoc 이미징 시스템Biorad12003153웨스턴 블롯 이미징 시스템
CO2 플라이 패드-마취 보드
CO2 탱크 및 조절기--고압 가스 및 현기증 주의
인큐베이터JSR JSGI-10T높은 주의 온도
공초점 레이저 주사 현미경ZeissLSM 710강렬한 레이저 빔에 대한 주의
원뿔형 튜브(15mL)SPL50015폴리프로필렌/고밀도 폴리에틸렌 
원추형 튜브(50mL)SPL50050폴리프로필렌/고밀도 폴리에틸렌 
디지털 저울--
디지털 타이머--해
부 접시--실리콘
듀몽 #5SF 겸자 Fine Science Tools11252-00초미세 팁, 날카로운 물체에 대한 주의
DynaMag-2 자석Invitrogen12321D1.5-2 mL 크기의 미세 원심분리기 튜브용
Fisherbrand  Superfrost Plus 현미경 슬라이드 (25mm x 75mm)Fisher Scientific12-550-15날카로운 물체에 대한 주의
리는 음식 병 (종이 플러그 포함)Hansol TechFFB-21010-Fly
식품 유리병 (면 캡 포함)Hansol TechFFV-11010-
집중 초음파 발생기CovarisM220
나이프InvitrogenEI9010플라스틱 손잡이가 있는 스테인리스 스틸
3MM Chr 압지(46cm & 57cm)Cytiva3030-917Whatmann 종이
휴대용 균질화기 및 플라스틱 유봉Kimble749540-0000무선 모터
히트 블록미세 PCRALB6400고온
보푸라기 없는 티슈Yuhan-Kimberly41112-
액체 질소--상 및 화상 주의
플레이트 분광 광도계Agilent TechnologiesEpochMonochromator 기반 광학 마이크로
파--고온
주의 milliTUBE 1 mL AFA 섬유Covaris PN520135유리
미니 젤 탱크Thermo Fisher ScientificA25977고온
NuPAGE Bis-tris 미니 단백질 젤, 4– 12%, 1.0– 1.5mm, 10웰InvitrogenNP0323BOX폴리아크릴아미드 함유, 독성 주의
NuPAGE Bis-tris 미니 단백질 젤, 4– 12%, 1.0– 1.5 mm, 15-wellInvitrogenNP0321BOX폴리아크릴아미드 함유, 독성 주의
페인트 브러시(Ø 1.8 mm)Hwa hong791240-Pipetman
L (P1000L)GilsonFA10006M금속 이젝터가 있는 단일 채널 마이크로피펫
Pipetman L (P200L)GilsonFA10005M금속 이젝터가 있는 단일 채널 마이크로피펫
Pipetman L ( P20L)GilsonFA10003M금속 이젝터가 있는 단일 채널 마이크로피펫
Pipetman L (P2L)GilsonFA10001M금속 이젝터가 있는 단일 채널 마이크로피펫
전원 공급 장치주요 과학MP-310고전압 전기 주의
프로그래밍 가능한 회전자BiosanRS-24-Protein
LoBind  튜브Eppendorf30108302-
면도날Dorco304020스테인레스 스틸, 날카로운 물체에 대한 주의
롤러---
혈청학적 피펫(10mL)SPL91010폴리스티렌
혈청학적 피펫(25mL)SPL91025폴리스티렌
혈청학적 피펫(5mL)SPL91005폴리스티렌
혈청학적 피펫(50mL)SPL91050폴리스티렌
스냅 캡 저보유 미세 원심분리기 튜브(1.5mL)Thermo Scientific3451PK폴리프로필렌
스폰지 패드InvitrogenEI9052-
실체 현미경ZeissStemi 508-
실체 현미경 라이카
써모믹서  CEppendorf53820000151.5 및 5 mL 크기 블록 포함
핀셋Aven Tools18526플라스틱, 플랫 팁
와류 믹서Scientific IndustriesSI-0236-XCell
II 블롯 모듈InvitrogenEI9051고온 주의
XCell  SureLock 미니 셀InvitrogenEI0001고온 주의
화학물질>Company카탈로그 번호Comments/Description
AcetoneSigma-Aldrich650501분석 등급
AcetonitrileSupelco1.00029.1000LC-MS 등급, 흡입 독성 및 가연성
알부민 표준 앰플(0.9% 식염수 및 0.05% 아지드화나트륨에 2mg/mL의 소 혈청 알부민(BSA) 함유)ThermoScientific23209Pierce BCA 단백질 분석 키트의 일부(Thermo Scientific, 23225)
알부민, 소 혈청BioshopALB001분석 등급
중탄산암모늄Sigma-Aldrich09830분석 등급
비오틴 Sigma-AldrichB4639세포 및 조직 배양 등급
염화칼슘(CaCl2)Sigma-AldrichC5670세포 배양 등급
선명도 웨스턴 ECL 기질Biorad1705060분석 등급
DAPISigma-AldrichMBD0015감광성 분석 등급
Dithiothreitol(DTT)Thermo Fisher ScientificR0861분석 등급
아 소 혈청Corning35-015-CV세포 배양 등급
포름산Sigma-AldrichF0507시약 등급, 흡입 독성 주의
Grace's 곤충 배지Gibco11595030세포 배양 등급
인스턴트 건조 효모브랜드 없음N1019-
IodoacetamideSigma-AldrichI1149감광성, 분석 등급
메탄올Carlo Erba41484분석 등급
매니큐어--투명형
Novex Tris-글리신 SDS 샘플 완충액(2X)InvitrogenLC2676분석 등급
NuPAGE MOPS SDS 러닝 버퍼(20X)InvitrogenNP0001분석 등급
PageRuler 사전 염색 단백질 사다리Thermo Fisher Scientific26616분석 등급
페닐메탄설포닐 플루오라이드 Thermo Fisher Scientific36978분석 등급
인산염 완충 식염수Sigma-AldrichP4417분석 등급
Pierce 16% 포름알데히드(w/v)ThermoFisher Scientific28908분석 등급, 감광성
Pierce BCA 단백질 분석 키트Thermo Scientific23225분석 등급
Pierce BCA 시약 A(탄산나트륨, 중탄산나트륨, 비신코닌산 및 주석산나트륨을 0.1M 수산화나트륨에 함유)Thermo Scientific23228Pierce BCA 단백질 분석 키트의 일부(Thermo Scientific, 23225)
Pierce BCA 시약 B(4% 황산구리 함유)Thermo Scientific1859078Pierce BCA 단백질 분석 키트의 일부(Thermo Scientific, 23225)
프로피온산Sigma-Aldrich402907ACS 등급
프로테아제 억제제 칵테일 세트 IIICalbiochem539134세포 및 조직 배양 등급
SlowFade Gold 퇴색 방지 마운트 제인 InvitrogenS36936감광
성 염화나트륨(NaCl)BioneerC-9025분석 등급
트륨 데옥시콜레이트Sigma-AldrichD6750분석 등급
데실 황산나트륨Sigma-Aldrich71736분자 등급
수산화나트륨(NaOH)BiosesangSR2018-100-00분석 등급
삼중 증류수--초순수(유형 1)
트리스 완충 식염수Sigma-Aldrich94158분석 등급
트리스-글리신 전달 완충액Koma BiotechK0341001분석 등급
Tris-HCl, pH 8BioneerC-9006분석 등급
Triton x-100Sigma-Aldrich93443분자 등급
트립신Thermo Fisher Scientific20233세포 배양 등급
Tween 20Sigma-AldrichP9416분자 등급
요소Sigma-AldrichU5378분자 & 세포 배양 등급
성 - 소형 날 초음파 젤 주의 주의 동 마이크로 태 나도

참고문헌

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