방법 논문

An Adoptive Transfer Model of Rheumatoid Arthritis in Mice

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DOI:

10.3791/68196

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2025년 6월 6일

 ,  ,  , 
1Department of Rheumatology, Fujian Institute of Clinical Immunology, Fujian Medical University Union Hospital, 2Department of Rheumatology and Immunology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 3Key Laboratory of Vascular Aging (HUST), Ministry of Education

이 논문에서

요약

본 연구에서는 SKG 마우스에서 CD4+ T 세포를 이식하여 류마티스 관절염(RA) 마우스 모델을 확립하는 프로토콜을 보고하며, 이를 통해 RA에 대한 면역학적 기전, 병리학적 진행 및 새로운 치료법 개발을 조사하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 실험 도구를 제공합니다.

초록

류마티스 관절염(RA)은 관절 손상, 기형, 장애 및 사망을 초래할 수 있는 만성 전신 자가면역 염증성 질환입니다. 복잡한 병인과 이질적인 임상 양상으로 인해 현재의 치료 전략은 질병 진행을 효과적으로 통제하는 데 부적절하며, 특히 조기 진단을 달성하고 개인화된 치료를 제공하는 데 적합하지 않습니다. 따라서 새로운 치료법을 개발하는 것이 중요합니다. 이를 위해서는 RA의 발병 기전을 조사하기 위해 신뢰할 수 있는 동물 모델이 필수적입니다. 현재 콜라겐 유발 관절염 모델(collagen-induced arthritis model, CIA), K/BxN 모델, SKG 마우스 등 여러 RA 동물 모델이 사용되고 있습니다. 이러한 모델은 RA의 면역 메커니즘과 임상 증상을 성공적으로 모방할 수 있지만, 각각 주목할 만한 한계가 있습니다.

이 프로토콜에서는 SKG 마우스에서 CD4+ T 세포의 채택 전달을 통해 RA 마우스 모델을 확립하는 과정을 설명합니다. 기존 모델에 비해 이 모델은 C57BL/6 마우스에서 확립 시간이 짧고 발생률(100%)이 더 높습니다. 상대적으로 비용 효율적이고, 절차가 간단하며, T 세포 매개 면역 반응을 안정적으로 복제하여 우수한 실험 제어 및 재현성을 보장합니다. 우리는 관절 증상과 같은 임상적 표현형을 평가하여 모델에 대한 포괄적인 평가를 수행했습니다. 임상적 표현형 평가를 통해 유의미한 관절 부종과 염증 반응을 관찰했습니다. 또한 PCR 기술을 사용하여 주요 전사 인자의 발현 수준을 측정한 결과, 이 모델이 T 세포 매개 면역 반응과 RA의 주요 병리학적 특징을 효과적으로 시뮬레이션한다는 것을 발견했습니다. 이 모델을 통해 연구자들은 T 세포 매개 면역 반응과 RA의 주요 병리학적 특징을 더 잘 시뮬레이션할 수 있으므로 면역 메커니즘 및 병리학적 진행을 연구하고 RA에 대한 새로운 치료법을 개발하기 위한 신뢰할 수 있고 효과적인 실험 도구를 제공할 수 있습니다.

서론

RA는 전 세계 인구의 약 1%에 영향을 미치는 만성 전신 자가면역 염증성 질환으로, 높은 이환율과 높은 사회경제적 부담을 유발합니다 1,2. 이 질병은 지속적인 활막 염증, 연골 파괴 및 뼈 침식을 특징으로 하며 궁극적으로 관절 기형, 장애 및 심한 경우 조기 사망으로 이어집니다 3,4,5. RA의 발병 기전은 유전적, 환경적, 면역적 요인의 상호작용을 포함하며, 주요 특징으로는 세포 면역의 비정상적인 활성화, 전염증성 사이토카인의 과도한 방출, 면역 관용의 붕괴 등이 있습니다 6,7. 이 과정에서 면역 조절의 핵심 동인인 자가반응성 T세포, 특히 CD4+ T세포는 여러 메커니즘을 통해 RA의 병리학적 진행을 직접적으로 촉진합니다.

T 보조 세포(Th)1 세포는 인터페론 감마(IFN-γ)를 생성하여 대식세포와 활막 섬유아세포를 활성화하여 종양괴사인자(TNF)-α와 인터루킨(IL)-6을 방출하고 활액염을 유발합니다. Th17 세포는 활액 세포와 파골세포의 활성화를 촉진하는 IL-17을 분비하여 연골 파괴와 뼈 침식을 악화시킵니다 8,9. 또한 CD4+ T 세포는 공동 자극 신호를 통해 B 세포를 활성화하여 염증 반응을 증폭시켜 항시트룰린 단백질 항체(ACPA) 및 류마티스 인자(RF)의 생성을 유도합니다10. 한편, 기능의 결함과 Treg 세포 수의 감소는 RA의 면역 불균형의 주요 원인이며, 조절되지 않는 염증을 유발합니다11,12. 복잡한 병인과 이질적인 임상 양상으로 인해 조기 진단이 어렵고 현재 RA 치료는 불만족스럽습니다. 따라서 새로운 치료법을 개발하는 것이 중요합니다. 신뢰할 수 있는 동물 모델은 RA의 발병 기전을 조사하여 RA의 잠재적 메커니즘을 더 깊이 이해하고 새로운 치료 전략을 모색하는 데 매우 중요합니다.

CIA 및 K/BxN 마우스 모델13,14,15과 같은 전통적인 RA 모델은 RA에 대한 이해를 향상시키는 데 기여합니다. 그러나 이러한 모델에는 상당한 한계가 있습니다. 예를 들어, C57BL/6 마우스의 CIA 모델은 성공률이 낮고 유도 기간이 길어 특정 실험 환경에서 유용성이 떨어집니다. 마찬가지로, K/BxN 모델은 가치가 있지만 확립하는 데 비용이 많이 들고 인간 RA의 복잡한 병리학, 특히 면역 세포와 사이토카인 간의 상호 작용을 복제하는 데 한계가 있습니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 C57BL/6 배경을 가진 SKG 마우스의 CD4+ T 세포를 면역 능력이 있는 C57BL/6 마우스로 전달하고 만난 유도 면역 활성화와 함께 새로운 RA 마우스 모델을 개발했습니다. 이 모델은 T 세포 매개 면역 반응 및 활막 염증 및 관절 미란과 같은 필수 병리학적 특성을 포함한 RA의 주요 기능을 효과적으로 복제하는 동시에 재현성, 단순성 및 비용 효율성에서 이점을 제공합니다. 우리는 C57BL/6 배경에서 SKG 마우스의 생성, SKG 마우스에서 CD4+ T 세포의 분리, 그들의 채택 전달 및 만나에 의한 후속 유도를 포함하는 이 모델을 확립하기 위한 자세한 방법론을 설명했습니다. 또한 관절염의 중증도를 평가하는 데 사용되는 임상 및 조직학적 기준을 설명하여 신뢰성과 재현성을 보장합니다. T 세포 매개 면역 반응과 RA의 근본적인 병리학적 특징을 일관되게 모방함으로써 이 모델은 면역 메커니즘, 질병 진행 및 RA에 대한 새로운 치료법 개발을 조사하기 위한 강력하고 효율적인 실험 도구 역할을 합니다.

프로토콜

본 연구의 모든 실험 절차는 축산, 실험 운영 및 안락사를 포함하여 "실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 국립 보건원 가이드"에서 제시한 지침을 엄격히 따랐으며 화중과학기술대학교 퉁지의과대학 동물윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 동물

  1. SKG 마우스 세대(C57BL/6 배경)
    1. 유전자 편집 전략
      1. ZAP70 유전자(gRNA 염기서열: 5'-CAGCCCACGAGCGAATGCCCTGG-3')를 표적으로 하는 특이적 가이드 RNA(gRNA)를 설계하고 CRISPR/Cas9 시스템으로 유전자 편집을 수행합니다. 돌연변이의 정확한 incorporatio-n을 보장하기 위해 ZAP70(W163C) 돌연변이가 있는 donor DNA를 설계합니다(여기서는 CAGGCCCCCCACAGGTGGAGAAGCTCATTG
        CTACCACAGCCCACGAGCGAATGCCC안내
        C        TATCACAGCAGCCTGACTCGTAGGAGAG
        GCCGAGCGCAAACTCTATTCCGGCCA)를 참조하십시오.
        참고: gRNA는 정확한 절단을 위해 Cas9 단백질을 ZAP70 유전자의 특정 부위로 유도합니다. 공여체 DNA 염기서열에서 밑줄이 그어진 염기는 돌연변이된 염기를 나타냅니다. 이 돌연변이는 ZAP70 단백질의 W163C 돌연변이(TGG→TGC)에 해당하며, 이 돌연변이는 중요한 기능 영역에 위치합니다.
    2. 마이크로시린지 주입
      1. 미세주입을 사용하여 Cas9 mRNA, gRNA 및 공여체 DNA를 수정된 C57BL/6 마우스 난자에 주입합니다. Cas9 단백질과 gRNA를 함께 주입하여 ZAP70 유전자를 절단하고 상동 재조합을 통해 ZAP70(W163C) 돌연변이를 삽입합니다. 주입된 수정란을 가임신한 암컷 마우스에 이식하고 약 20일을 기다린 후 F0 세대로 태어난 마우스를 지정합니다. PCR 증폭 및 염기서열분석을 통해 유전자형을 식별합니다(1.1.5.3단계 참조).
    3. F0 세대 마우스의 유전형 분석
      1. F0 생성 마우스에서 PCR 및 염기서열분석을 수행하여 ZAP70 (W163C) 돌연변이의 획득을 확인합니다(1.1.5.3단계 참조).
        참고: F0 세대 마우스는 빠른 배아 분열로 인해 키메라입니다. 안정적인 유전자 전달이 부족할 수 있습니다. 안정적인 라인을 구축하기 위해 연속 번식을 구현합니다.
    4. F1 세대 마우스의 획득 및 유전형 식별
      1. F0 양성 마우스를 야생형 C57BL/6J 마우스와 교배하여 F1 생성 마우스를 얻고 PCR 및 염기서열분석을 통해 유전형 분석을 수행하여 SKG 마우스를 얻습니다(C57BL/6 배경, 1.1.5.4단계 참조).
    5. F0 및 F1 세대에 대한 PCR 기반 유전형 분석 방법
      1. 멸균 가위로 꼬리에서 0.5cm 조각을 잘라냅니다.
      2. 동물 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 마우스 DNA를 추출합니다.
      3. F0의 경우, 다음 PCR 반응 시스템을 준비합니다: 13.2 μL의 ddH2O, 2 μL의 PCR 완충액, 2 μL의 2.5 mM dNTP, 0.5 μL의 정방향(5'-GATGCCTAGGTGGGTGGGTGGGGTTCC-3') 및 역방향 (5'-ACTTGCCTACGCTACTGCTACA-3') 프라이머(10 pmol/μL), 0.8 μL의 DNA 중합효소 및 1 μL의 게놈 DNA(50-100 ng/μL)를 마우스 꼬리에서 추출하고, 20 μL의 최종 반응 부피에 대해. 다음 PCR 프로그램을 사용하여 유전자 증폭을 수행합니다 : 94 ° C에서 3 분; 98 ° C에서 15 초, 58 ° C에서 15 초, 68 ° C에서 1 분, 35 사이클; 68 분 동안 5 °C; 12 °C에서 유지하십시오.
      4. F1의 경우, 다음 PCR 반응 시스템을 준비합니다: ddH2O 14.9 μL, 10x Taq PCR 완충액 2 μL, 2.5 mM dNTP 1 μL, 정방향(5'-GATGCCTAGGTGGGTGGGGTTCC-3') 및 역방향 (5'-ACTTGCCTACGCTACTGCTCTACA-3') 프라이머(10 pmol/μL), Taq DNA 중합효소 0.1 μL 및 마우스 꼬리에서 추출한 게놈 DNA(50-100 ng/μL) 1 μL, 20 μL의 최종 반응 부피에 대해. 다음 PCR 프로그램을 사용하여 유전자 증폭을 수행합니다 : 94 ° C에서 5 분; 30초 동안 94°C, 30초 동안 58°C, 1분 동안 72°C, 35주기 동안 반복; 72 ° C 5 분; 12 °C에서 유지하십시오.
      5. 전기영동을 실행하여 예상 크기의 제품을 확인합니다.
      6. 유전자형과 특정 돌연변이를 모두 확인하기 위해 PCR 산물의 염기서열을 분석합니다.
  2. 기증자 및 수혜자 마우스 선택
    1. 생후 6-8주(수컷 또는 암컷)의 SKG 마우스를 기증자 마우스로 선택합니다.
    2. 생후 6-8주령의 C57BL/6 마우스(일관된 실험 결과를 위해 암컷 선호)를 수용 마우스로 선택합니다.
    3. SPF 조건에서 C57BL/6 및 SKG 마우스(6-8주령)를 개별 환기 케이지에 수용합니다. 12시간의 라이트/다크 주기로 SPF 등급 공급 및 멸균수에 대한 무료 접근을 제공합니다. 실험을 시작하기 전에 1주일 동안 생쥐를 적응시킵니다.

2. SKG 마우스에서 CD4+ T 세포의 분리 및 정제

  1. SKG 마우스를 CO2 질식을 사용하여 멸균 층류 후드 아래에서 안락사시킵니다. 소독을 위해 쥐를 75% 알코올에 5분 동안 담그십시오. 복강에서 비장을 찾고 서혜부 및 슬와낭 영역에서 림프절(서혜부 및 슬와물)을 찾습니다. 멸균 집게와 가위를 사용하여 비장과 림프절을 조심스럽게 절개하고 즉시 미리 냉각된 PBS로 옮깁니다.
  2. 비장과 림프절을 별도의 페트리 접시에 놓습니다. 멸균 주사기의 플런저를 이용하여 70μm 세포 여과기를 통해 조직을 누르고, 10-12mL의 예냉된 PBS를 서서히 첨가하여 균일한 세포 현탁액을 형성합니다. 동일한 70μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브에 통과시킨 다음 300×g에서 4°C에서 7 분 동안 원 심분리합니다. 상등액을 버리고 세포 펠렛을 보관하십시오.
  3. 세포 생존력을 평가하기 위해 트리판 블루 염색을 수행합니다. 세포를 세고 생존율이 ≥90%인지 확인합니다.
  4. CD4+ T 세포 분리 키트에 제공된 완충액을 사용하여 세포 농도를 1 × 108 cells/mL로 조정합니다.
  5. 100μL의 세포 현탁액(10,7 개 세포)을 새 튜브로 옮깁니다. 10μL의 비오틴-항체-칵테일을 넣고 완전히 섞은 다음 얼음에서 15분 동안 배양합니다.
  6. 최대 속도로 볼텍싱하여 비드를 다시 매달아 놓습니다. Streptavidin 비드 현탁액 10μL를 넣고 잘 섞은 후 얼음에서 15분 동안 배양합니다.
  7. CD4+ T cell isolation kit에 제공된 buffer를 2.5mL 넣고 튜브를 자석에 5분 동안 넣습니다.
  8. 튜브의 액체(표적 세포)를 새 멸균 튜브에 조심스럽게 붓고 4°C, 300×g에서 5 분 동안 원 심분리합니다. 상등액을 버리고 세포 펠렛을 보관하십시오.
  9. 충분한 양의 멸균 PBS 용액을 추가하여 세포 농도를 2 × 106 cells/mL로 조정하고 나중에 사용할 수 있도록 현탁액을 얼음에 보관합니다.
  10. 유세포 분석을 사용하여 분류된 세포의 순도를 평가합니다(보충 그림 S1). 세포 순도를 다음과 같이 계산합니다 : (CD4 + T 세포 수 / 총 세포 수) × 100 %. 순도가 ≥90%16인지 확인합니다.

3. CD4+ T 세포의 양적 전달

  1. C57BL/6 마우스에 2%-3% 이소플루란을 마취하여 마우스가 모든 이동성을 잃지만 정상적인 자발적 호흡을 유지하는 마취 깊이에 도달합니다.
  2. 멸균 면봉으로 마우스의 안각(눈꼬리)을 부드럽게 청소하여 분비물과 머리카락을 제거하고 정맥을 노출시킵니다.
  3. 마우스를 손으로 고정합니다. 200 μL의 CD4+ T 세포 현탁액(마우스당 2 ×10 5-5 × 105 세포)을 1 mL 주사기에 주입합니다. 바늘을 내부 안당 정맥에 10-15° 각도로 삽입하여 정확한 배치를 보장합니다. 세포 현탁액을 10-15초에 걸쳐 천천히 균일하게 주입합니다.
  4. 바늘을 빼낸 후 출혈을 방지하기 위해 멸균 면봉으로 안암 안쪽을 3-5초 동안 부드럽게 누릅니다.
  5. 쥐를 조용하고 건조하며 깨끗한 케이지에 넣어 호흡이 안정되고 비정상적인 행동(예: 경련이나 갑작스런 죽음)이 없이 완전히 의식을 회복할 때까지 모니터링합니다. 수술 후 안정적인 상태를 확인한 후 마우스를 표준 하우징 케이지로 이동합니다.
    참고: 내부 안당 정맥이 작기 때문에 과도한 속도로 인한 정맥 파열이나 세포 막힘을 방지하기 위해 부드러운 취급과 조절된 주입 속도가 중요합니다.
  6. 주입 세부 사항을 기록하고 모델 및 대조군 마우스(그룹당 4마리)에 레이블을 지정하여 후속 실험에서 혼동을 방지합니다. CD4+ T 세포를 투여하여 마우스를 모델링하고 대조군 마우스는 치료하지 않은 상태로 둡니다. 모든 마우스가 수용 마우스인지 확인합니다.

4. 만나의 자극 그리고 유도

  1. 4일차에 만나 유도를 수행합니다(CD4+ T 세포 주입 후 72시간). 모든 실험 마우스와 대조 마우스에 동일한 유도 조건을 적용합니다.
    1. 만난 분말의 무게를 측정하고 멸균 PBS에 100mg/mL의 농도로 용해합니다.
    2. 마우스를 올바르게 잡고 복부를 노출시킵니다. 75% 알코올로 피부를 소독하고 주사 부위(복부 정중선 측면에서 ~1cm)를 확인합니다.
    3. 만나 용액을 잘 섞고 적절한 양(마우스당 20-30mg)을 1mL 주사기에 넣습니다. 바늘을 복강에 45° 각도로 삽입하고 용액을 천천히 주입하여 균일하게 분포되도록 합니다. 바늘을 천천히 빼내고 멸균 면봉으로 주입 부위를 몇 초 동안 부드럽게 눌러 누출이나 감염을 방지합니다.
  2. 주입된 마우스를 조용하고 깨끗한 케이지에 놓고 5-10분 동안 면밀히 모니터링하여 주입 부위에 누출, 복부 팽창 또는 비정상적인 호흡이 없는지 확인합니다.
  3. 각 마우스의 주입 세부 정보를 자세히 기록합니다.

5. 측정

  1. 임상 표현형의 관찰
    1. 관절염 증상 점수 매기기
      1. 만나 유도 후 3일마다 공동 평가를 실시합니다. 앞다리와 뒷다리의 모든 관절을 검사하고 무릎, 발목, 손목 및 손가락/발가락 관절에 특히 주의하십시오. 표준 기준에 따라 관절염 중증도를 평가합니다(표 1)17. 관절염의 진행을 평가하기 위해 각 시점에서 총 점수를 기록하고 비교합니다.
  2. 조직 병리학적 특징의 기록
    1. 한 달 동안 만나를 주입한 후, CO2 질식을 사용하여 멸균 층류 후드 아래에서 마우스를 안락사시키고(윤리 위원회 지침에 따라), 마우스는 폼 보드에 고정하고 뒷다리를 노출시킵니다. 발목부터 피부를 절개하고 위로 벗겨 근육과 관절을 노출시킵니다. 발목 관절(경골/비골과 거골 사이)과 중족골 관절(중족골과 근위 지골 사이)을 확인하고 조직학적 분석을 위해 이러한 관절을 절개하고 파라핀 절편을 준비합니다.
    2. 절제된 조직을 4% 포르말린에 72시간 동안 고정한 다음 10% 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, pH 7.4)으로 옮겨 4주 동안 석회질을 제거하여 완전한 석회질을 보장합니다.
    3. 석회질 제거 후 PBS로 조직을 세척하여 잔류 고정액을 제거한 다음 등급이 매겨진 에탄올 시리즈(75%, 80%, 95%, 100%)를 통해 조직을 탈수합니다.
      참고: 포르말린은 눈, 피부 및 호흡기를 자극할 수 있습니다. 흄 후드에서 처리해야 합니다.
    4. 파라핀 임베딩 기계를 사용하여 조직을 파라핀에 삽입합니다. 마이크로톰을 사용하여 내장된 조직을 4μm 두께의 슬라이스로 절단합니다. 증류수가 포함된 40°C 수조에 섹션을 띄웁니다.
    5. 섹션을 옮기고 말리십시오. 유리 슬라이드에 섹션을 놓습니다. 실온(RT)에서 밤새 건조시키십시오. 염색을 위해 슬라이드를 RT에 보관하십시오.
    6. Hematoxylin 및 Eosin (H&E) 염색
      1. 슬라이드를 60°C 오븐에 2시간 동안 넣어 파라핀을 제거합니다.
      2. 실온에서 크실렌 → 크실렌 → 100% 에탄올 → 100% 에탄올 → 95% 에탄올 → 80% 에탄올 → 75% 에탄올 순서로 슬라이드를 각각 5분 동안 담그십시오. 증류수로 2분 동안 헹굽니다.
      3. 5 분 동안 hematoxylin 해결책에 있는 활주를 연속적으로 얼룩이 지게 하고, 2 분 동안 탈이온수로 헹구고, 그 후에 1 분 동안 0.1% 암모니아로 대우하고, 탈 이온수에서 3 x 2 분 동안 헹구고, 1 분 동안 eosin로 얼룩이 지고, 마지막으로 2 분 동안 탈 이온수로 헹굽니다.
      4. 슬라이드를 80% 에탄올→ 95% 에탄올 → 100% 에탄올→ 크실렌 → 자일렌에 각각 5분 동안 담그십시오.
      5. 슬라이드를 자연 건조하고 중성 수지로 장착합니다.
    7. Safranin O-Fast 녹색 염색
      1. 파라핀 단면을 파라핀화하여 물을 주고 Van Gieson의 염색 키트를 사용하여 염색합니다. 염색 후 중성 수지로 슬라이드를 장착하고 현미경으로 이미지를 캡처합니다(5.2.5단계에서 준비).
  3. T세포와 사이토카인의 변화
    1. 멸균 수술 도구를 사용하여 마우스에서 비장을 제거합니다.
      1. 제조업체의 지침에 따라 RNA 추출 키트를 사용하여 비장 조직에서 총 RNA를 추출합니다. 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도와 순도를 정량화하고 A260/A280 비율이 1.8에서 2.0 사이인지 확인합니다.
      2. 역전사 키트를 사용하여 추출된 RNA에서 cDNA를 합성합니다. 반응 설정 및 사이클링 조건에 대한 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. 후속 qPCR 분석을 위해 cDNA를 -20°C에 보관합니다.
      3. qPCR 수행: 비장 조직에서 Tbx21, Gata3, Il-17 및 Foxp3의 상대적 mRNA 발현 수준을 측정하고, 다음을 포함하는 10 μL 반응에서 SYBR Green 기반 qPCR을 사용하여 측정하였다: 5 μL의 2x SYBR Green 마스터 믹스, 각 0.2 μL의 정방향 및 역방향 프라이머(10 μM; 표 2의 서열), 0.5-1 μL cDNA의 (50-100 ng/μL), 및 뉴클레아제가 없는 물을 부피로 공급합니다. 다음과 같은 열 순환 조건을 사용하십시오: 95°C에서 30초 동안 초기 변성, 이후 10초 동안 95°C, 30초 동안 60°C의 40회 사이클, 용융 곡선 분석(65-95°C)을 사용합니다. 2(-ΔΔCt) 방법을 사용하여 표현식 수준을 Gapdh로 정규화합니다.
    2. 혈청 분리 및 세포 분석 비드 어레이(CBA) 분석
      1. 적출 방법을 이용한 안와 혈액 채취법을 이용하여 마우스로부터 혈액을 채취하고, 항응고제로 코팅된 채취 튜브에 혈액을 옮기고, 실온에서 30분 동안 방치합니다. 응고된 혈액을 4°C, 1,000× g 에서 15분 동안 원심분리하고 상등액(혈청)을 조심스럽게 채취하여 분석까지 -80°C에서 보관합니다.
      2. 제조업체의 지침에 따라 CBA 키트를 사용하여 혈청 내 IL-6, IL-10, IL-17, TNF-α 및 IFN-γ의 발현 수준을 측정합니다.

결과

마우스의 관절 팽창 및 발생률에 대한 임상적 점수 매기기
그림 1은 모델 마우스의 관절 부종과 발생률의 임상적 점수를 보여줍니다. 결과는 모델 그룹의 모든 마우스가 질병(n = 4)에 걸렸으며 발생률이 100%임을 나타냅니다. 모델 그룹의 점수는 크게 증가하여 두 번째 주에 잠시 완화된 모습을 보였으며 이후 6주 동안 상승했습니다.

마우스의 관절 부종 징후
모델 그룹 마우스의 관절은 현저한 두꺼움과 부종을 보이며, 앞다리와 뒷다리에서도 눈에 띄는 부기와 두꺼워짐이 관찰됩니다(그림 2).

마우스 발목 관절의 병리학적 결과
병리학적 결과는 대조군과 비교하여 모델 그룹 마우스가 발목 관절의 활막이 현저히 두꺼워지고 뼈가 불연속성이며 염증 세포의 현저한 응집을 보이는 것을 나타냅니다(그림 3, 그림 4 및 그림 5).

혈청 T세포 관련 염증 인자
대조군과 비교했을 때, 모델 그룹 마우스는 IL-10(7.51 vs 2.15 pg/mL), TNF(78.83 vs 13.11 pg/mL), IL-17(101.6 vs 12.64 pg/mL), IFN-γ(5.15 vs 1.90 pg/mL)의 혈청 수치가 유의하게 증가했다(p < 0.05). IL-6도 대조군에 비해 유의하게 증가했다(15.59 대 6.27pg/mL)(p=0.05, 그림 6).

비장의 T 세포 부분 집합 Th1/2/17 및 Tregs의 변화
비장에서 T 세포 subset의 변화를 평가하기 위해 Tbx21(Th1), Gata3(Th2), Il-17(Th17) 및 Foxp3(Tregs)의 mRNA 발현 수준을 측정했습니다. 이러한 유전자는 각각의 T 세포 하위 집합의 분화와 기능을 정의하는 주요 전사 인자와 사이토카인을 암호화합니다. 대조군에 비해 모델군 마우스는 참조 유전자 Gapdh에 비해 비장(p < 0.05)에서 Tbx21(1.68 대 0.61) 및 Il-17(26.30 대 0.75)의 mRNA 발현이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다.

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그림 1: 관절 부종의 임상적 점수. (A) 모델 그룹 마우스; (B) 모델 그룹 마우스의 누적 발생률. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 대조군 및 모델 마우스의 관절 부종 징후(n = 4). (A-C) 마우스의 대조군 및 모델 그룹에서 발 및 관절 부종 점수(0,2,4)의 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 헤마톡실린-에오신 염색으로 관찰된 대조군 마우스와 모델 그룹 마우스의 발목 관절의 조직학적 변화. (A) 대조군 마우스 발목 관절; (B) 모델 그룹 마우스 발목 관절의 뼈 불연속성; (C) 모델 그룹 마우스 발목 관절의 활액 증식. 스케일 바 = 50μm(첫 번째 열), 100μm(두 번째 및 세 번째 열). 그림 3B와 3C의 이미지는 동일한 마우스에서 가져온 것으로, 서로 다른 병리학적 표현형을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 대조군과 모델군 마우스 간 발목 관절의 활막 두께 차이(p < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: Safranin O-Fast Green 염색으로 관찰된 대조군 마우스와 모델 그룹 마우스의 발목 관절의 조직학적 변화. (A) 대조군 마우스의 발목 관절; (B) 모델 그룹 마우스의 발목 관절에서 활액 증식. 스케일 바 = 50μm(첫 번째 열), 100μm(두 번째 및 세 번째 열). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: 대조군 마우스와 모델 그룹 마우스에서 T 세포 관련 염증 인자 및 하위 집합의 변화. (A) 대조군 및 모델군 마우스의 혈청에서 T 세포 관련 염증 인자의 발현 및 (B) 비장에서 T 세포 부분 집합 Th1/2/17 및 Tregs의 변화. *p < 0.05, **p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

점수부기 (범위 0-4)홍반(범위 0-2)
0없음없음
1임의의 숫자약간의
2발극도
3손목/발목
4사지 전체

표 1: 관절염 채점 기준. 관절염에 점수를 매기려면 부기와 홍반에 따라 각 팔다리에 점수를 매기고 각 팔다리에 0-6의 점수를 할당합니다. 네 팔다리 모두에 대한 점수를 합산하여 각 마우스의 총 관절염 점수를 생성합니다.

프라이머 염기서열
올리고 이름시퀀스 5' - 3'
TBX21-포워드아그카가그가트그트
Tbx21-리버스GGGTGGACATATAAGCGGTTC
Gata3-포워드CTCGGCCATTCGTA캣그가아
가타3-리버스GGATACCTCTGCACCGTAGC
IL-17A-포워드TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA
IL-17A-리버스CTTTCCCTCCGCATTGACAC
Foxp3-포워드CCCTTGACCTCAAAACCAAG
Foxp3-리버스GTGTGACTGCATGACTA액트가캣가트가캣가트가캣트가트가캣
갭디-포워드GGTTGTCTCCTGCGACTTCA
갭디-리버스TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC

표 2: 프라이머 염기서열 목록.

보충 그림 S1: 유세포 분석에 의한 CD4+ T 세포 분류를 위한 게이팅 전략. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

RA의 발병은 활액 조직에서의 비정상적인 면역 세포 침투와 밀접한 관련이 있으며, 이러한 면역 세포의 조절 장애 활성화는 다양한 전염증성 사이토카인의 방출로 이어지며, 이는 활막 및 관절 구조의 손상에 더욱 기여합니다18,19. CIA 모델, K/BxN 모델 및 SKG 마우스 13,20,21을 포함한 여러 RA 동물 모델이 널리 평가되었습니다. 이러한 모델은 RA의 면역 메커니즘과 임상 증상을 성공적으로 복제하지만 모두 상당한 한계가 있습니다. 예를 들어, C57BL/6 마우스의 CIA 모델은 성공률이 낮고 발병 기간이 길며 환경 및 실험 조건의 영향을 크게 받기 때문에 특정 실험 환경에서는 실용적이지 않습니다. SKG 마우스는 T세포 수용체(T-cell receptor, TCR) 신호전달에서 갑작스러운 이상을 일으키고 자가면역 관절염을 유발하는 ZAP-70 유전자 돌연변이를 기반으로 하는 RA 마우스 모델을 나타냅니다22. 그러나 이 모델은 비용이 많이 들고 실험 결과의 재현성은 유도 조건의 영향을 쉽게 받습니다. K/BxN은 T 세포와 B 세포의 협력 활동에 의해 유발되는 유전성 관절염 모델로, 뚜렷한 면역 반응을 보인다23. 그러나 이 모델을 구축하는 것은 비용이 많이 들고 특이성이 제한되어 면역 반응이 제한되어 인간 RA의 다면적인 병리학적 과정을 완전히 포착할 수 없습니다. 따라서 RA의 주요 병리학적 특징을 복제할 수 있고, 다양한 실험 요구 사항을 충족하며, 높은 재현성을 보장할 수 있는 동물 모델을 개발하는 것이 매우 중요합니다.

본 연구에서는 SKG 마우스에서 adaptive CD4+ T cell의 adoptive transfer를 통해 RA model을 확립하는 방법을 제시한다. 이 모델의 구축은 C57/BL6 배경을 가진 SKG 마우스에서 CD4+ T 세포를 선택하고 모델의 성공을 보장하는 프로세스인 만난의 유도에 의존합니다. BALB/c 배경에 있는 SKG 마우스는 자발적인 ZAP70 유전자 돌연변이(W163C)를 가지고 있으며, 이는 비정상적인 TCR 신호 선택을 유발하여 높은 자기 반응성 T 세포를 유발하는 것으로 널리 알려져 있습니다24. 이로 인해 T 세포가 과도하게 활성화되고 활액막염 및 관절 파괴가 시작되어 활막 복구 및 면역 세포 활성화와 같은 RA의 주요 병리학적 과정을 모방하게 됩니다25,26. SKG 마우스의 임상적 특징은 인간 RA 환자의 임상적 특징과 매우 유사합니다.

이 돌연변이를 C57BL/6 background에 도입하기 위해 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 ZAP70 (W163C) 돌연변이를 가진 C57BL/6 background SKG 마우스 모델을 성공적으로 생성했습니다. CRISPR/Cas9는 높은 정밀도와 효율성을 제공하여 기존의 무작위 유도 방법과 관련된 낮은 off-target 삽입 또는 원치 않는 유전자 변형을 유지하면서 원하는 돌연변이의 표적 도입을 가능하게 하여 모델의 안정성과 고유성을 보장합니다27,28. 더 중요한 것은 이 기술이 모델 구성에 필요한 시간을 크게 줄여 모델 개발의 제어 가능성과 효율성을 모두 향상시킨다는 것입니다. 이 모델을 사용하여 C57BL/6 배경에 대해 T 세포 매개 활막염 및 RA의 관절 파괴를 정확하게 복제할 수 있습니다. 기존 SKG 마우스의 BALB/C 배경과 비교했을 때, C57BL/6 배경의 모델 마우스는 면역학 연구에 더 광범위하게 적용할 수 있으며 다른 형질전환 모델(예: Rag1-/- 또는 IL17-/-)과 더 쉽게 결합할 수 있습니다. 따라서 RA 및 전신성 홍반성 루푸스 또는 다발성 경화증과 같은 기타 자가면역 질환에서 ZAP70 돌연변이의 역할을 조사하는 데 적합합니다.

RA 활성화에서 CD4+ T 세포의 중추적인 역할29,30을 기반으로 이들을 주요 매개체로 선택했습니다. T 세포는 RA에서 면역 반응의 주요 동인이며 IL-6, IL-17 및 TNF-α와 같은 염증 인자에 따라 Th1/Th17 효과기 하위 집합31을 활성화하여 활막 손상을 직접 유도할 수 있습니다32,33. 면역 조절의 중추적인 매개체인 CD4+ T 세포는 전염증성 사이토카인을 분비하여 염증성 연쇄 반응을 유발하고 유지하며, 이는 활막 증식과 관절 손상을 유발하여 RA의 병리학적 진행을 직접적으로 촉진합니다. 이들은 B 세포가 특정 항체(예: ACPA)를 생성하도록 돕는 데 중요한 역할을 합니다34. 한편, RA 활막의 전형적인 조직병리학적 특징은 CD4+ T 세포의 응집입니다. 특정 클래스 II 주요 조직적합성 복합체(MHC) 유전자, 특히 인간 백혈구 항원-DR 동형(HLA-DR)과 관련된 "공유 에피토프"는 RA35의 발병기전과 밀접한 관련이 있는 것으로 간주됩니다. 또한, 세포독성 T-림프구 관련 항원 4(CTLA4)-Ig를 이용한 T세포 공동 자극을 차단하는 전략은 RA에서 유의미한 임상적 효능을 입증했다36. 또한, 만난 유도는 모델의 강력한 활성제 역할을 하여 수지상 세포 및 대식세포와 같은 선천성 면역 성분의 활성화를 촉진합니다37. 이 단계는 CD4+ T 세포 활성화 및 면역 반응을 더욱 촉진하여 자가 조직에 대한 면역 체계의 공격을 크게 증가시켜 RA에서 면역 조절 장애 및 활막 손상의 병리학적 특징을 시뮬레이션합니다.

모델 유도를 완료한 후 관절 부종의 임상 점수 매기기, 병리학적 검증(활막염 조직 병리학 및 관절 파괴 특징 관찰) 및 면역학적 검증(혈청 및 비장에서 Th1/2/17 및 Treg 세포 발현)을 포함한 여러 매개변수를 사용하여 모델 그룹에 대한 체계적인 검증을 수행했습니다. 그 결과, 본 연구는 RA에서 T세포 매개 활막염 및 관절 파괴를 성공적으로 복제하여 RA의 주요 병태생리학적 기전과 일치하는 특징적인 면역 활성화 및 활막 병리학적 변화를 100% 유병률로 유도하는 것으로 나타났습니다. 본 모델에서 마우스의 임상적 부종-관절 점수는 1주에 최고조에 달하고, 두 번째 주에 현저한 감소를 보인 다음 후반기에 점차적으로 다시 상승하는데, 이는 기존 관절염 동물 모델에서 관찰된 전형적인 질병 경과와 완전히 일치하지 않는다는 점에 주목할 만합니다38. 이는 유도 후 1주일이 지나면 모델 마우스의 면역 체계가 만나 주입에 의해 강렬하게 활성화된 초기 단계에 있어 관절 염증이 최고조에 이르기 때문일 수 있습니다. 두 번째 주에는 면역 조절과 자가 회복 메커니즘으로 인해 임상 증상이 일시적으로 완화됩니다. 병이 진행됨에 따라 면역 관용은 점차 약해지고 면역 반응이 다시 강화되어 말기에 상태가 점진적으로 악화되는 것으로 나타납니다.

이 모델은 다른 모델에 비해 비교적 간단하지만 모델링 프로세스 중에 해결해야 할 몇 가지 핵심 사항이 여전히 있습니다. 첫째, SKG 마우스의 CD4+ T 세포의 활성과 순도는 모델 성공의 기초를 형성합니다. 실험 결과의 일관성과 신뢰성을 보장하기 위해 세포의 순도는 90%를 초과해야 합니다. 둘째, 내측 안당 정맥으로의 주입 속도는 너무 빨리 주입하여 정맥 파열이 발생하거나 너무 느리게 주입하여 세포 누출이 발생하지 않도록 신중하게 조절해야 합니다. 또한 세포 용량의 선택은 매우 중요합니다. 너무 낮은 용량은 모델 실패로 이어질 수 있으며, 너무 높은 용량은 비특이적 염증 반응을 유발할 수 있습니다. 따라서 모델링 과정에서 생쥐의 전반적인 상태를 면밀히 모니터링해야 하며, 실험의 원활한 진행과 데이터의 과학적 타당성을 보장하기 위해 비정상적인 증상이 있을 경우 즉시 기록해야 합니다.

이 모델은 기존 모델에 비해 확립 기간이 짧고 C57BL/6 마우스에서 더 높은 발생률을 달성하며 상대적으로 비용 효율적이고 작동이 용이합니다. 자가반응성 CD4+ T 세포의 전달을 채택하면 T 세포 매개 면역 반응을 정확하게 재생하고 관절 부종 및 손상과 같은 RA의 주요 병리학적 특징을 포착할 수 있습니다. 또한, 그 임상적 소견은 인간 RA의 소견과 잘 일치하여 RA의 임상적, 병리학적 과정을 보다 확실하게 반영합니다. 또한, 내측 안당 정맥 주입과 만나 유도의 조합은 모델의 제어 가능성과 실험 안정성을 더욱 향상시켜 재현성이 높고 우수한 실험 제어를 제공합니다. 물론 이 모델에는 여전히 한계가 있습니다. 주로 T 세포 주도 면역 반응에 중점을 둡니다. B 세포 매개 항체 반응 및 기타 면역 세포(예: 자연살해(NK) 세포 및 Treg 세포)의 협력 역할에 대한 시뮬레이션은 불충분하여 RA의 다세포 병리학적 메커니즘을 완전히 표현하는 것이 어렵습니다. 그럼에도 불구하고 이 RA 마우스 모델은 안정적이고 신뢰할 수 있는 동물 모델로 남아 있으며, 연구자들에게 T 세포 매개 면역 반응과 RA의 주요 병리학적 특징을 시뮬레이션할 수 있는 더 나은 플랫폼을 제공합니다. 이 모델을 통해 연구자들은 RA의 면역 메커니즘과 병리학적 진행을 심층적으로 탐구할 수 있으며, 특히 T 세포 주도 면역 조절 장애를 이해하고 치료 표적을 식별하는 데 있어 새로운 치료법 개발을 위한 중요한 실험적 증거와 도구를 제공할 수 있습니다.

공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립자연과학재단(82270903, 82401588, 81974254)과 중국 박사후 과학재단(2024M751019)의 보조금으로 지원되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AgaroseYeasen10208ES60DNA 전기영동 실험에 사용하기 위한 아가로스 겔 준비
무수 에탄올Shanghai HuShi Laboratory Instruments Co., Ltd.100009218탈수 및 고정제
ZAP 70 프라이머Tsingke전자 발현을 검출하는 데 사용되는 Tsingke 프라이머, 마우스 유전형 분석을 위한 PCR 실험에 일반적으로 사용됩니다
1.5 mL 효소가 없는 ep 튜브LABSELECTMCT-001-150-S시료 보관, 원심 분리 등과 같은 다양한 실험에 사용
2x Q3 SYBR qPCR 마스터 믹스 (범용)ToloBio22204매우 특이적이고 고감도의 qPCR 반응을 수행하는 데 사용됩니다.
2x Magic Green Taq SuperMixTOLOBIO21502-04전기 영동 전 완충액
4% 포름알데히드(파라포름알데히드) 용액BiosharpBL539A조직 구조 및 세포 형태를 보존하기 위한 고정제로 사용되어 후속 염색 단계를 위해 안정적이고 잘 보존된 샘플을 제공합니다
. 동물 조직/세포 총 RNA 분리 키트ServicebioMPC2409122동물 조직/세포에서 총 RNA 추출
BD 세포 측정 비드 어레이(CBA) 마우스 Th1/Th2/Th17 사이토카인 키트BD Biosciences560485마우스 혈청에서 Th1/2/17 사이토카인의 발현을 측정합니다.
세포 배양 접시LABSELECT12211비장 및 림프절의 세포액 용기
디메틸벤젠China National Pharmaceutical Group Chemical Reagents Co., Ltd.10023418탈파핀화 및 투명제로 사용
Easyfive 6포트 세포 계수 챔버CytoEasyN3EF110계수에 사용됩니다
SolarbioG1371관절 부위의 병리학적 변화를 관찰하기 위해 연골 및 뼈 조직을 염색합니다.
유리 슬라이드CITOTEST188105조직 슬라이싱 헤
마트실린 염색 용액ServicebioG1005-1죽어가는
헤마톡실린 염색 용액ServicebioG1001죽어가는
저속 냉동 원심분리기CenceF14300021010004원심분리 및 침전에 사용됩니다
난시그마모델용 m7504액티베이터. 멸균 PBS에 2 mg/mL로 용해하고 완전히 혼합한 다음 0.22 & M 멤브레인을 사용하여 입자 또는 가능한 오염원을 제거합니다.
MojoSort MagnetBiolengend480019쥐의 비장, 림프절에서 CD4+ T 세포를 분리 및 정제하는 데 사용됩니다.
MojoSort Mouse CD4 T 세포 분리 키트Biolengend480033쥐의 비장, 림프절에서 CD4+ T 세포를 분리 및 정제하는 데 사용됩니다. CD4 분자에 직접 결합하여 CD4+ T 세포를 분리하는 음성 선택 방법을 사용하여 CD4 분자 기능에 영향을 주지 않고 표면 항원의 무결성을 보존하여 CD4+ T 세포 주입 실험에 적합합니다.
Nano-300ALLSHENGAS-11020-00핵산, 단백질 및 세포 용액의 정확한 검출
중성 수지 마운팅제BiosharpBL704A염색된 조직 절편 고정 및 보존
파라핀 미크로톰KEDEE KEDEEKD-3389파라핀 절편에 사용
산염 완충 식염수(PBS)PricellaWHB824P281완충액으로 사용 용매 또는 세척제,
멸균 셀 필터(70 & micro; m)BiosharpBS-70-CS세포 현탁액에서 큰 불순물 또는 응집된 세포 클러스터를 제거하여 샘플 순도 및 세포 균일성 보장
멸균 주사기(1mL)Lingyang Medical Apparatus20241020내안각 정맥에 주입
탁상용 고속 미세 냉장 원심분리기SCILOGEXS1010E원심분리 및 침전에 사용
TEA 완충액(50x)Yeasen60116ES76pH를 안정화하고 DNA 및 RNA와 같은 분자를 보호 및 보존하는 데 도움이 되며 전기영동 실험에 사용됩니다
ToloScript qPCR용 올인원 RT EasyMixToloBio22107RNA 주형을 cDNA로 변환하는 데 사용되어 후속 유전자 발현 분석, qPCR 및 기타 분자 생물학 실험을 용이하게 합니다.
트랜스퍼 피펫BIOFIL240515-133-A용액 이송에 사용
판 블루 염료 용액Biosharp7009529일반적으로 세포 생존율 분석에 사용되며 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하는 데 도움이 됩니다
유. 0.5M EDTA 용액(pH = 7.4)Biosharp R00521 조직의 구조적 무결성을 유지하면서 칼슘 함유 조직의 조직 절편 및 염색의 품질을 보장하기 위해 석회질을 제거하는 데 사용됩니다. 연골용 세포 .에 대한 기본 지원 만 인. 트리.

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류마티스 관절염 모델CD4 T 세포SKG 마우스C57BL/6 마우스관절 염증T 세포 면역만난 유도활막 병리학사이토카인 분석
An Adoptive Transfer Model of Rheumatoid Arthritis in Mice
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