이 프로토콜은 야생형 마우스 및 다낭성 간 질환이 있는 마우스에서 고순도 및 고생존율 1차 담관세포를 분리하기 위한 최적화된 2단계 소화 방법을 설명합니다.
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이 프로토콜은 야생형 마우스 및 다낭성 간 질환이 있는 마우스에서 고순도 및 고생존율 1차 담관세포를 분리하기 위한 최적화된 2단계 소화 방법을 설명합니다.
이 프로토콜에서는 야생형 마우스와 다낭성 간 질환(PLD)이 있는 마우스에서 고순도 및 생존율이 높은 1차 담관세포를 분리하기 위해 2단계 소화 방법을 최적화했습니다. 생쥐를 마취시킨 후, 간을 50mL의 용액 A로 하대정맥을 통해 관류한 후, 37°C에서 30mL의 용액 B를 주입하여 간 조직을 효소로 소화시켰습니다. 기계적 해리, 진탕 및 미미해부를 수행하여 부착된 실질 세포를 제거하고 온전한 담도계를 남겼습니다. 그런 다음 담도 나무를 잘게 다지고 37 ° C에서 60 분 동안 흔들면서 소화시켰다. 생성된 단일 세포 현탁액은 70μm 세포 스트레이너를 사용하여 수집되었습니다. 담관세포는 면역자기 분리를 사용하여 정제되었습니다. 세포 현탁액을 4°C에서 45분 동안 항-EpCAM 항체를 회전시켜 배양한 후, 단백질 G 비드를 첨가하고 4°C에서 45분 동안 추가로 회전시켰습니다. PBS로 3회 세척한 후, 자기 분리기를 사용하여 담관세포를 수집했습니다. 정제된 1차 담관세포를 담관세포 배양 배지에 재현탁시키고 1mg/mL I형 쥐꼬리 콜라겐으로 코팅된 세포 배양 접시에 파종했습니다. 담관세포의 순도는 담관세포 특이적 마커인 cytokeratin-19 (CK19)에 대한 면역염색으로 확인되었습니다. 이 연구는 야생형 및 PLD 마우스에서 원발성 담관세포를 분리하는 데 중점을 두었지만 이 프로토콜이 다른 질병 마우스 모델에도 적용될 수 있다고 확신합니다. 이 상세한 2단계 소화 방법은 담관병증의 체외 연구와 표적 치료법의 개발을 용이하게 합니다.
담즙세포(cholangiocyte)는 간내 담도계(intrahepatic biliary tree)를 둘러싸고 있는 상피 세포로, 단층을 형성하며 간 전체 세포 집단의 약 3-5%를 차지한다1. 이 세포들은 간 내에서 상호 연결되어 복잡한 3차원 유관 네트워크를 형성합니다2. 정상적인 조건에서 담관세포는 분비, 흡수, 부상 복구, 면역 장벽 역할을 포함한 중요한 기능을 수행하여 간 생리학 및 병리학에서 중요한 역할을 합니다. 그러나 담관세포 기능 장애는 PLD, 원발성 경화성 담관염, 담관암, 담즙 유발성 간 손상 등 다양한 질병을 유발할 수 있습니다 3,4,5.
담관병증 관련 질환 중 PLD는 담관세포에서 유래하는 수많은 액체로 채워진 낭종의 형성을 특징으로 하는 유전 질환으로 두드러집니다. 이러한 낭종의 점진적인 비대는 환자의 삶의 질을 현저히 떨어뜨린다6. PLD에 대한 현재 치료법은 여....
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모든 마우스 관리 및 실험 프로토콜은 톈진 의과대학 윤리위원회(Doc. No: TMUa-MEC 2022016)의 승인을 받았습니다.
1. 장비 및 솔루션 준비
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담관세포를 분리하는 데 사용되는 2단계 소화 과정에 대한 워크플로우 다이어그램은 그림 1에 나와 있습니다. 전체 절차는 ~ 5 시간이 걸립니다. 먼저, 간이 창백해지는 것으로 알 수 있듯이 혈액을 제거하기 위해 하대정맥을 통해 간에 용액 A를 관류합니다. 그런 다음 간에는 콜라겐 분해 효소 II가 함유 된 용액 B가 관류되어 조직 소화를 시작합니다. 이 초기 소화 단계는 시간에 민감하며, 조직이 눈에 띄게 부드러워지는 것이 성공적인 소화를 입증합니다. 다음으로, 구부러진 집게를 사용한 기계적 해리와 부드러운 흔들림은 간세포를 제거하는 데 도움이 됩니다. 적절한 소화는 많은 수의 간세포가 분리될 때 확인됩니다. 해부 현미경 아래에서 남아 있는 부착 실질 세포는 현미해부를 통해 조심스럽게 제거되어 온전한 담도수를 남깁니다(그림 2).
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이 프로토콜은 2단계 소화 과정을 사용하여 마우스에서 고순도 1차 담관세포를 분리하는 상세한 방법을 제공하여 담관병증의 기저에 있는 분자 메커니즘을 연구할 수 있도록 합니다. 담관세포의 성공적인 분리를 보장하기 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필수적입니다.
첫 번째 중요한 단계는 용액 A와 용액 B를 사용하여 효과적인 관류 및 소화를 보장하는 것입니다. 용액 A를 사용한 성공적인 관류는 간이 창백하게 변하는 것으로 확인되었으며, 용액 B를 사용한 성공적인 소화는 간 조직이 눈에 띄게 부드러워짐에 의해 확인되었습니다. 관류에 실패하면 간 조직의 소화를 방해하고 담도계의 후속 분리를 손상시킬 수 있습니다. 소화 효율을 높이기 위해 용액 A와 용액 B의 부피를 늘리거나, 관류 유속을 줄이거나, 면봉으로 간을 부드럽게 누를 수 있습니다.
두 번째 중요한 단계는 기계적으로 해리하.......
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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
이 작업은 톈진시 교육위원회(2022ZD054 to L.Z.)의 보조금으로 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 &무; m 필터 | PALL | 4612 | |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| 10 mL 주사기 | KONSMED | 10 mL 1.2*30TWLB | |
| 20 mL 주사기 | KONSMED | 20 mL 1.2*30TWLB | |
| 24 G 정맥 카테터 | WEGO | 24GX19 mm/Y-G | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T5516 | 1.7 mg/mL 스톡 |
| 4% 파라포름알데히드 | Solarbio | P1110 | |
| 5mL 주사기 | KONSMED | 5mL 0.7*30TWLB | |
| 6cm 접시 | Thermo Scientific | 150462 | |
| 70 µ m cell strainer | Corning | 352350 | |
| anti-CK19 항체 | DSHB | TROMA-III | |
| anti-EpCAM 항체 | DSHB | G8.8 | |
| BSA | Solarbio | A8020 | |
| CaCl2 | Sangon Biotech | A501330 | 2 M stock |
| 화학적으로 정의된 지질 농축액(100x) | Gibco | 11905-031 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | 3.2 mg/mL 스톡 |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | 10 mg/mL |
| 스톡 해부 현미경 | Leica | EZ4 | |
| DMEM/F12 (1:1) | VivaCell biosciences | C3130-0500 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DNase I | 시그마 | D4513 | 10 U/μ L 재고 |
| 당나귀 anti-rat Alexa Fluor 488 2차 항체 | Invitrogen | A21208 | |
| EGTA | Solarbio | E8050 | 50 mM (PH = 8) 재고 |
| 표피 성장 인자 (1 mg/mL) | Sigma | SRP3196 | |
| 에탄올 아민 | Sigma | E9508 | |
| 소 태아 혈청 | VivaCell biosciences | C04001-500 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 | 20 mM 재고 |
| 겐타마이신/암포테리신 용액(500x) | Gibco | R01510 | |
| 혈구계 | QIUJING | XB. K.25. | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | 10 mg/mL 스톡 |
| 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (100x) | Gibco | 41400045 | |
| 이소플루란 | RWD | R510-22-10 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395 | |
| L-글루타민 (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| 자기 분리기 | Promega | Z5342 | |
| MEM 비필수 아미노산 (100x) | Gibco | 11140050 | |
| MEM 비타민 용액 (100x) | Gibco | 11120052 | |
| MgCl2 | Sangon Biotech | A100288 | 1.5 M 재고 |
| Na Pyruvate (100밀리미터) | Gibco | 11360070 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A600487 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476 | |
| NaOH | Sangon Biotech | A620617 | 1 N 주식 |
| PBS | VivaCell biosciences | C3580-0500 | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| 페니실린-스트렙토마이신(100x) | Gibco | 15140-122 | |
| 연동 펌프 | BaodingRongbai YZ1515PPS | ||
| 단백질 G 비드 | Invitrogen | 10004D | |
| Rotator | Kylin-Bell | QB-528 | |
| RPMI | VivaCell biosciences | C3010-0500 | |
| 대두 트립신 억제제 | Sigma | T6522 | 10 mg/mL 스톡 |
| 스웨이지 바늘 | Jinhuan Medical | HM601 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | |
| Trypan 블루 | 시그마 | T6146 | 10 mg/mL 스톡 |
| Type I 쥐 꼬리 콜라겐 | BD | 354236 |
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