이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

Solanum nigrum에서 Agrobacterium tumefaciens에 의해 매개되는 유전자 변형

908 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68212

⸱

2025년 6월 24일

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Agriculture and Life Science, Liaocheng University

이 논문에서

요약

이 논문은 형질전환 Solanum nigrum을 생성하기 위해 Agrobacterium tumefaciens에 의해 매개되는 유전자 형질전환 방법의 자세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

Solanum nigrum은 감자와 토마토의 고아 solanaceous 친척이며, 신선한 과일은 영양가가 높고 맛있는 베리입니다. S. nigrum의 전체 식물은 약으로 사용될 수 있습니다. 그러나 야생 S. nigrum은 몇 가지 바람직하지 않은 특성을 가지고 있습니다. 다행히도 유전 공학 기술, 특히 CRISPR/Cas9과 같은 유전자 편집 기술은 이러한 결함을 해결함으로써 S. nigrum을 신속하게 개선할 수 있는 귀중한 기회를 제공합니다. 대부분의 식물에서 유전자 편집 기술을 통한 식물 개선은 Agrobacterium tumefaciens에 의한 유전자 변형을 통해 이루어집니다. 이 기사에서는 S. nigrum에서 A. tumefaciens에 의해 매개되는 유전자 변환 프로토콜에 대해 자세히 설명했습니다. S. nigrum 묘목의 자엽과 hypocotyls는 유전 적 형질전환을 위한 이식으로 사용되었습니다. S. nigrum은 카나마이신에 내성이 있기 때문에 DsRed 유전자는 형질전환 식물을 식별하기 위한 시각적 마커로 사용되었습니다. S. nigrum의 유전자 형질전환은 이러한 작동 프로토콜에 따라 효율적으로 완료될 수 있습니다. T1 형질전환 식물의 검출은 PCR 식별 없이 적색 형광을 방출하는지 여부에 따라 직접 식별할 수 있습니다.

서론

Solanum nigrum (검은 밤나무, 2n = 6x = 72로 알려짐)은 감자와 토마토1의 solanaceous 친척입니다. 열매는 익은 후 검게 변하는 구형 열매입니다. 신선한 과일은 영양가가 높고 맛있는 베리입니다. S. nigrum의 전체 식물은 혈액 정체를 분산시키고, 붓기를 줄이고, 열을 제거하고, 해독하는 효과와 함께 약으로 사용할 수 있습니다. S. nigrum은 일반적인 콜레스테롤 전구체에서 두 가지 종류의 특수 대사 산물, 즉 잎의 스테로이드 사포닌과 열매의 스테로이드 글리코알칼로이드(SGA)를 합성합니다. S. nigrum에서 유래한 스테로이드 사포닌인 Uttroside B는 최근 미국 식품의약국(FDA)에서 간세포 암종2종 치료를 위한 희귀 의약품으로 승인되었습니다. S. nigrum에서 GAME15 유전자의 녹아웃으로 식물은 사포닌과 스테로이드 알칼로이드가 모두 결핍되었으며, 스테로이드 사포닌이 심각한 농업 해충을 통제한다는 사실도 밝혀졌습니다2. S. nigrum의 폴리페놀은 지방세포와 지질 대사에 영향을 미쳐 체중과 체지방을 감소시킨다3. S. nigrum은 카드뮴을 농축할 수 있으며 카드뮴 농축을 연구하기 위한 모델 식물로 사용됩니다 4,5. S. nigrum은 길들여지지 않은 식물이며 연구 기반이 상대적으로 약합니다. 최근 몇 년 동안 S. nigrum에 대한 연구가 점차 증가하고 있다는 것은 고무적입니다. 헥사플로이드 S. nigrum의 게놈이 최근에 조립되었으며, S. nigrum은 이배체 Solanum americanum (2n = 2x = 24)에서 진화했을 수 있습니다 6 , 7 . 따라서 S. nigrum은 약용 및 식용 가치를 모두 가진 식물입니다. S. nigrum에 대한 연구는 인간 질병 치료에 대한 잠재적 응용에 대한 더 깊은 이해에 기여할 뿐만 아니라 농업 생산 향상에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 따라서 S. nigrum에 유전자 변형 시스템을 구축하는 것은 형질전환 및 유전자 편집 기술을 통한 유전자 개선의 기초입니다.

S. nigrum 8,9,10,1 1의 Agrobacterium tumefaciens-매개 유전자 형질전환에 초점을 맞춘 여러 보고서가 있습니다. 이전 연구에서는 S. nigrum에 대한 A. tumefaciens LBA4404 매개 유전자 변형 시스템을 구축하고 AcMYB110을 S. nigrum으로 형질전환시켜 안토시아닌 함량이 증가한 S. nigrum의 새로운 생식질을 얻었습니다1. 형질전환 및 유전자 편집 S. nigrum 식물은 A. tumefaciens EHA105 매개 유전자 형질전환으로 수득하였다10. 서로 다른 형광 단백질은 녹색, 빨간색, 노란색, 주황색 및 파란색 형광 방출을 가지며 세포 생명 활동을 나타내는 데 널리 사용됩니다12. 식물의 유전자 형질전환 과정에서, 적색 형광 유전자는 유전자 변형 사건과 비유전자 변형 사건을 구별하기 위한 리포터 유전자로 자주 사용된다13. DsRed 유전자를 리포터 유전자로 사용하면 형질전환 이벤트를 편리하게 구별할 수 있으며, R2R3-MYB 전사 인자를 리포터 유전자로 사용하면 식물의 유전자형에 영향을 받을 수 있습니다14. 형질전환 자손에서 형질전환 식물은 광학 기기(예: 형광 현미경 또는 이미징 시스템)를 사용하여 비형질전환 식물과 쉽게 구별할 수 있으므로 PCR 기반 식별의 필요성을 제거합니다. 형광 단백질 리포터 유전자를 CRISPR 유전자 편집 기술과 통합함으로써 옥수수의 생식 유전자를 정확하게 삭제하여 핵 멸균 라인과 제어된 핵 멸균 유지 장치라인 15를 생성했습니다. maintainer 식물의 자가 수분과 결실은 maintainer 및 sterile line의 1:1 자손을 생산할 것입니다. 서로 다른 발광 특성에 기초하여, maintainer 및 sterile line seed의 비파괴 분류는 시각적 또는 기계 인식을 통해 달성될 수 있다15. 따라서, 리포터 유전자로서 형광 단백질 유전자를 사용하는 것은 PCR 분석을 위한 필요 없이 형질전환 종자 또는 식물의 동정을 간단하게 한다. 이는 유전자 형질전환 분야에서 상당한 이점을 나타냅니다. 이 방법은 적색 형광 유전자인 DsRed를 리포터 유전자로 사용하여 S. nigrum에서 Agrobacterium tumefaciens에 의한 유전자 형질전환의 프로토콜을 설명하는 것을 목표로 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 무균 묘목 재배

알림: 다음 단계는 매우 깨끗한 벤치에서 수행됩니다.

  1. 중국 랴오청시에서 S. nigrum 의 야생 씨앗을 모아 Snlc1이라고 명명합니다. S. nigrum 의 야생 씨앗 50개를 2mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 1mL의 5% 지베렐린을 30분 동안 담근 후 지베렐린 용액을 버립니다.
  2. 75% 에탄올 1mL를 넣고 1분 동안 흔든 다음 에탄올을 버립니다.
  3. 2% 차아염소산나트륨 용액 1mL를 넣고 씨앗 표면을 10분 동안 소독합니다. 원심분리기 튜브를 철저히 흔들어 씨앗 표면을 살균합니다. 10분 후 차아염소산나트륨을 버리십시오.
  4. 잔류 차아염소산나트륨을 제거하기 위해 멸균수로 씨앗을 5번 씻습니다. 90/1MS 고체 매체를 포함하는 직경 2mm의 페트리 접시에 씨앗을 놓습니다. 25°C에서 16시간 광/8시간 암흑의 광주기로 식물 생장실에서 플레이트를 배양합니다(그림 1A).

2. A. tumefaciens LBA4404의 문화

  1. 적색 형광 유전자인 DsRed2를 가지고 있는 이진 벡터 pRed130516을 전압 1800V, 커패시턴스 25μF, 저항 200 Ω, 큐벳 1mm의 매개변수와 함께 MicroPulser를 사용한 전기천공법으로 LBA4404 A. tumefaciens로 변환합니다. 50 mg/L 카나마이신과 50 mg/L 리팜피신을 함유한 고체 LB 배지에서 28°C에서 48시간 동안 박테리아를 배양합니다.
  2. pRed1305가 함유된 LBA4404 클론 1개를 선택하고 28°C에서 180rpm으로 12시간 동안 테이블 농축기의 15mL 원심분리기 튜브에 50mg/L 카나마이신 및 50mg/L 리팜피신이 포함된 1mL의 액체 LB 배지에서 배양합니다.
  3. 박테리아 용액 1mL에 동일한 항생제가 함유된 액체 LB 50mL를 첨가한 다음 28°C에서 6시간 동안 200rpm으로 테이블 농축기에서 배양합니다.
  4. 박테리아 배양 배지의 OD600 이 0.4가 되면 배양을 중지하고 2200 x g 에서 25°C에서 10분 동안 세균 용액을 원심분리합니다.
  5. 원심분리된 세균을 감염액(IS: M519 4.43 g/L, 수크로오스 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, AS, 100 μmol/L, pH 5.8)으로 재현탁시키고 분광 광도계로 세균 용액 농도를 OD600= 0.6으로 조정합니다.

3. A. tumefaciens에 의한 외식 감염

알림: 다음 단계는 매우 깨끗한 벤치에서 수행됩니다.

  1. 묘목 자엽이 펼쳐질 때까지 7일 동안 씨앗을 성장시킵니다(그림 1B). 세균성 IS를 적신 여과지가 있는 배양접시에 살균하고 날카로운 메스로 묘목에서 약 1cm 길이의 자엽과 하이포코틸 2개를 자르고 1차 뿌리는 버립니다. 메스를 사용할 때는 주의하십시오.
  2. 감염 용액에 외식을 30분 동안 주입합니다. 외식재를 건조 여과지 위에 올려 놓아 외식지 표면의 박테리아 용액이 흡수될 수 있도록 합니다.
  3. 외식을 IS 고체 매체(0.7% 한천; 그림 1C). 19 °C에서 빛이 없는 식물 생장실에 외식을 놓고 3일 동안 배양합니다.

4. 외식의 차별화

알림: 다음 단계는 매우 깨끗한 벤치에서 수행됩니다.

  1. 19 ° C의 식물 성장 챔버에서 외식을 집어 올립니다. 멸균된 물을 사용하여 외식식물을 5x 세척하고 건조하고 살균된 여과지에 외식식물을 놓습니다.
  2. 외식을 싹 분화(SD) 배지(SD: M519 4.43 g/L, 자당 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, ZT 0.5 mg/L, Cef 100 mg/L, 탄수화물 100 mg/L, 0.7 g/L 한천, pH 5.8)에 놓고 25 °C에서 4주 동안 배양합니다(그림 1D, E).
  3. 휴대용 형광등의 녹색 여기등 아래에서 적색 형광을 보이는 외래식물의 굳은살/싹을 메스를 사용하여 잘라낸 다음 새로운 SD 배지로 옮기고 25°C에서 4주 동안 배양을 계속합니다(그림 1F,G).

5. 뿌리 뽑기와 이식

  1. 휴대용 형광등으로 적색 형광을 보이는 새싹을 잘라 발근 매체(RM: M519 4.43 g/L, 자당 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, ZT 0.5mg/L, Cef 100 mg/L, 탄수화물 100 mg/L, 0.7 g/L 한천, pH 5.8)로 옮기고 25 °C에서 2-4주 동안 배양하여 뿌리 생산을 촉진합니다.
  2. 뿌리 길이가 2cm 이상인 적색 형광을 보이는 묘목을 토양에 이식합니다(그림 1H-K). 이식하기 전에 뿌리에서 한천을 손으로 제거하여 뿌리에서 박테리아가 과도하게 증식하는 것을 방지하십시오.

6. PCR 증폭을 통한 유전자 변형 T0 식물 테스트

  1. CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 방법17을 사용하여 독립적인 형질전환 계통의 게놈 DNA를 추출합니다.
  2. 7.5 μL의 2x PCR Master Mix와 0.3 μL의 각 primer (10 μmol/L)를 포함하는 15 μL 반응 부피에서 10 ng genomic DNA를 템플릿으로 사용하여 primer set, RedF(5'-TGGCCTCCTCCGAGAAC-3') 및 RedR(5'-CGGAGGGGAAGTTCACG-3')로 DsRed 유전자를 증폭합니다. 예상되는 DNA 단편은 393bp였습니다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동에 적용하여 형질전환 식물인지 여부를 확인합니다.

7. 형광등을 이용한 T1 세대의 형질전환 식물 식별

  1. 색이 완전히 흑자색으로 변한 S. nigrum 의 T0 형질전환 식물의 열매를 수확한 다음 과일 내부의 씨앗을 손으로 짜냅니다. 씨앗을 실온에서 약 1주일 동안 자연 건조합니다.
  2. 이 프로토콜의 1.1-1.4 단계에 따라 건조 된 종자를 1/2 MS 배지에서 배양하고 1 주일 동안 식물 생장 챔버에 놓습니다. 형질전환 묘목과 비형질전환 묘목을 휴대용 형광등으로 구별합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

형질전환 S. nigrum을 생산하기 위해 Agrobacterium tumefaciens에 의해 매개되는 유전자 변형.
S. nigrum 묘목의 자엽과 hypocotyls를 A. tumefaciens로 감염시킨 후, DsRed가 리포터 유전자로 사용되었기 때문에 Agrobacterium 감염이 성공적이었는지 확인할 수 있었습니다. 감염 3-4주 후 상처 부위에 적색 형광이 나타났으며(그림 1D,E), 이는 아그로박테리움 감염이 성공적이었음을 나타냅니다. 거의 모든 외식에서 적색 형광이 관찰될 수 있었고 Agrobac...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

지금까지 A. tumefaciens에 의해 매개되는 S. nigrum에 대한 유전자 형질전환 방법은 다른 실험실에서 확립되었습니다 8,9,10,11. 이러한 형질전환 방법의 대부분은 카나마이신을 선택 물질 8,9,10,11로 사용합니다. 그러나 S. nigrum은 kanamycin에 민감하지 않습니다. 그러므로, 더 높은 농도의 카나마이신(kanamycin)이 선택에 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 랴오청 대학교(318012028)의 연구 기금과 산둥성 자연과학 재단(ZR2020MC034)의 지원을 받았습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2X SanTaq PCR 마스터 믹스 (파란색 염료 포함)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5320612X SanTaq PCR Mix에는 MgCl?, dNTP, Taq DNA 중합효소, PCR 완충액, 로딩 염료 및 PCR 인핸서가 포함됩니다.
6-BASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (6-BA Sangon Biotech (상하이) Co., Ltd.C14819266인공 사이토키닌
AgarTianjin Damao 화학 시약 파트너십 기업(합자회사)CAS NO:9002-18-0Solids
ASSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.K914BA0002Agrobacterium
CarbSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.의항생제
CefSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.I526BA0010항생제
지베렐린Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.K514BA0009종자 발아
kanamycinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.I614BA0013항생제
LB 배지Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113박테리아 성장
MicroPulser ( Gene Pulser Xcell)Bio-Rad, US617BR1 06783Gene Pulser Xcell
MS 고체 매체phytotech Co., Ltd., USHCA0519228A  무라시게 & 비타민이 함유 된 Skoog 기초 매체, M519
플라스틱 상자LiaoSu, 중국T909H식물 심기 상자
rifampicinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.S180305항생제
자당Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.CAS NO:57-50-1     탄소원으로
Tanon-5200Multi 기계Tanon Co., Ltd., 중국5200Multi가속 분리
야생 Solanum nigrum랴오청시
에서J921BA0014식물 성장 조절제
효율적인 발현 유도 홍보ZT Sangon Biotech(Shanghai) Co., Ltd. 수집

참고문헌

  1. Wang, X., et al. Ectopic overexpression of AcMYB110 causes significantly increased content of anthocyanins in Solanum nigrum. Biologia plant. 67, 200-203 (2023).
  2. Boccia, M., et al. A scaffold protein manages the biosynthesis of steroidal defense metabolites in plants. Science. 386 (6728), 1366-1372 (2024).
  3. Peng, C. H., et al. Solanum nigrum polyphenols reduce body weight and body fat by affecting adipocyte and lipid metabolism. Food Funct. 11 (1), 483-492 (2020).
  4. Wang, J., et al. Influence of Cd toxicity on subcellular distribution, chemical forms, and physiological responses of cell wall components towards short-term Cd stress in Solanum nigrum. Environ Sci Pollution Res. 28 (11), 13955-13969 (2021).
  5. Wang, J., et al. Comparative cytology combined with transcriptomic and metabolomic analyses of Solanum nigrum L. in response to Cd toxicity. J Hazardous Mater. 423, 127168(2022).
  6. Lee, E. S., et al. Engineering homoeologs provide a fine scale for quantitative traits in polyploid. Plant Biotech J. 21 (12), 2458-2472 (2023).
  7. Lin, X., et al. Solanum americanum genome-assisted discovery of immune receptors that detect potato late blight pathogen effectors. Nat Genetics. 55 (9), 1579-1588 (2023).
  8. Bhattacharya, A., et al. Engineering gibberellin metabolism in Solanum nigrum L. by ectopic expression of gibberellin oxidase genes. Plant Cell Rep. 31 (5), 945-953 (2012).
  9. Chhon, S., Jeon, J., Kim, J., Park, S. U. Accumulation of Anthocyanins through Overexpression of AtPAP1 in Solanum nigrum Lin (Black Nightshade). Biomolecules. 10 (2), 277(2020).
  10. Park, S., et al. Rapid generation of transgenic and gene-edited Solanum nigrum plants using Agrobacterium-mediated transformation. Plant Biotech Rep. 14 (4), 497-504 (2020).
  11. Peng, W., et al. A convenient, reliable and directly visual selection marker for identifying transgenic lines of Solanum nigrum. Plant Cell Tiss Organ Cult. 152 (2), 369-375 (2023).
  12. Schlechter, R. O., et al. Chromatic Bacteria - A Broad Host-Range Plasmid and Chromosomal Insertion Toolbox for Fluorescent Protein Expression in Bacteria. Front Microbio. 9, 3052(2018).
  13. Hao, H., et al. High-efficiency Agrobacterium-mediated transformation of Lotus corniculatus using DsRed2 positive selection and vermiculite-based rooting method. Plant Cell Tiss Organ Cult. 156 (2), 58(2024).
  14. Fan, Y., et al. a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Meth. 16 (1), 94(2020).
  15. Qi, X., et al. Genome Editing Enables Next-Generation Hybrid Seed Production Technology. Mol Plant. 13 (9), 1262-1269 (2020).
  16. Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell Tiss Organ Cult. 141 (1), 207-216 (2020).
  17. Schenk, J. J., Becklund, L. E., Carey, S. J., Fabre, P. P. What is the "modified" CTAB protocol? Characterizing modifications to the CTAB DNA extraction protocol. Appl Plant Sci. 11 (3), e11517(2023).
  18. Li, Q., et al. An Improved and Simplified Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation Protocol for Solanum nigrum with a Shorter Growth Time. Plants. 13 (15), 2015(2024).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

CRISPR Cas9DsRed

이 논문이 게재되었습니다

동영상 곧 제공

문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.