방법 논문

세포의 표적 밀링을 위한 극저온 일치 형광, 전자 및 이온빔 현미경을 사용한 워크플로

DOI:

10.3791/68238

⸱

2025년 10월 17일

 ,  ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2SLAC National Accelerator Laboratory, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University, 4Department of Photon Science and Structural Biology, Stanford University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 워크플로우는 극저온 삼중 일치 이미징 플랫폼을 사용하여 작고(축 범위 <1μm) 희귀한(세포당 1개 사본) 형광 표지된 생물학적 구조를 표적으로 하는 라멜라 생산을 가능하게 합니다. 이 플랫폼은 형광 현미경, 집중 이온 빔 밀링 및 스캐닝 전자 현미경을 단일 초점 위치에 통합하고 밀링 중 동시 형광 현미경을 가능하게합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

주사 전자 현미경을 사용한 극저온 집속 이온빔 밀링(CryoFIB-SEM)은 극저온 전자 단층 촬영(CryoET)을 위한 200nm 두께 미만의 세포 라멜라를 준비하는 지배적인 접근 방식이 되었습니다. 최근에는 형광 현미경이 CryoFIB-SEM 시스템에 통합되어 형광 표지된 표적으로 라멜라 생산을 안내했습니다. 그러나 대부분의 구현에서 광학 및 이온 빔 이미징 시스템은 진공 챔버의 서로 다른 영역에 뚜렷한 초점면을 가지며 두 개의 개별 현미경으로 효과적으로 작동합니다. 이 구성에는 양식 간의 이미지 등록이 필요하며, 이는 종종 그 자리에서 작고 희귀한 구조를 안정적으로 표적으로 삼는 데 필요한 정확도가 부족합니다. 우리는 동시 형광 이미징과 집속 이온 빔 밀링을 가능하게 하는 맞춤형 삼중 일치 이미징 플랫폼을 기반으로 하는 워크플로를 제시합니다. 이를 통해 최종 라멜라에서 관심 있는 형광 표지 구조를 보존하기 위해 밀링을 종료할 시기를 결정하는 데 사용할 수있는 실시간 형광 피드백 (fluorescence feedback) 이 가능합니다. 이 접근법을 사용하여 유리화된 대식세포의 미세소관 조직 센터(MTOC)를 표적으로 삼았고 후속 극저온 전자 단층 촬영과 상관 광학 및 전자 현미경으로 확인된 >60%의 성공률을 달성했습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

극저온 전자 단층 촬영(CryoET)을 사용하면 고분자 분해능 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11에서 거의 천연 상태의 생물학적 표본을 시각화할 수 있습니다.. 그러나 진핵 세포의 두께(종종 수 미크론)는 300kV 전자의 평균 자유 경로(~300nm)를 초과하여 산란되지 않은 전자의 침투 깊이를 제한하여 사용 가능한 샘플 두께를 제한합니다. 이 문제를 해결하기 위해 집속 이온 빔(FIB)을 사용하여 CryoFIB 밀링으로 알려진 공정에서 극저온으로 보존된 대부분의 세포를 제거하여 CryoET 이미징 12,13,14,15,16에 충분히 얇은 라멜라를 생성할 수 있습니다.

이전에 보고된 워크플로에서 샘플은 먼저 플런지 냉동 17,18,19를 통해 유리화된 얼음에 보존된 다음 CryoFIB와 주사 전자 현미경(SEM)이 모두 장착된 이중 빔 기기에 로드됩니다. SEM 이미징은 소기관 및 일부 단백질 구조와 같은 관심 있는 세포 내 특징을 식별하는 데 사용될 수 있습니다20,21. 이 정보는 CryoET 13,14,22에 적합한 200nm 미만 두께의 라멜라를 생성하는 것을 목표로 샘플을 단계적으로 제거하는 CryoFIB 밀링 공정을 지시하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 이 접근 방식은 현재 프로토콜이 해결하는 두 가지 주요 과제를 제시합니다. 첫째, 특정 단백질 구조의 CryoET를 얻어야 하는 경우가 많지만 SEM은 손상될 수 있으며 대부분의 단백질 구조는 염색되지 않은 생물학적 물질을 이미징할 때 SEM으로 식별할 수 없습니다. 밀링을 손상 없는 방식으로 특정 세포 내 영역 또는 특정 생체 분자를 포함하는 영역으로 정확하게 안내할 수 있는 방법은 무엇입니까? 둘째, 얇은 라멜라와 후속 CryoET를 생산한 후에도 명확한 식별에 필요한 해상도, 신호 대 잡음비 및/또는 대비가 불충분하기 때문에 최종 재구성에서 특정 생체 분자를 식별하는 것이 어려울 수 있습니다. cryo-ET 재구성 내에서 이러한 생체 분자의 공간적 위치를 어떻게 결정할 수 있습니까?

두 가지 문제를 모두 해결하기 위해 이 분야는 점점 더 형광 현미경으로 눈을 돌리고 있습니다. 표적 단백질에 결합하는 유전적으로 암호화된 형광 단백질 또는 외인성 염료는 관심 있는 특정 생체 분자를 표지하는 데 일상적으로 사용됩니다 5,23,24. 밀링 후 채취한 유리화 세포의 극저온 형광 현미경은 결과 단층 촬영과 상관 관계가 있을 수 있습니다. 극저온 상관 광 및 전자 현미경(CryoCLEM)으로 알려진 이 접근법은 잘 확립되어 있으며 CryoET 재구성 내에서 특정 단백질을 국소화하는 데 널리 사용되었습니다 5,12,23,24. 최근의 발전에는 보완 정보 및 공간 정밀도를 향상시키기 위한 형광 바이오센서 및 초고해상도 방법의 사용이 포함됩니다25,26,27,28,29.

CryoCLEM은 위에서 확인한 두 번째 문제를 극복하는 한 가지 방법으로, 라멜라 내 특정 단백질의 위치를 결정할 수 있습니다. 그러나 CryoCLEM은 최종 라멜라에 관심 있는 단백질이 포함되어 있지 않은 경우 사용자를 위해 아무 작업도 수행하지 않습니다. 다행히도 형광 현미경을 사용하여 라벨이 지정된 관심 영역으로 밀링을 지시할 수도 있습니다. 형광 유도 FIB 밀링은 약 10년 전에 등장한 초기 워크플로인 CryoCLEM보다 새로운 개발이지만12 빠르고 널리 채택되었습니다. 초기 프로토콜은 외부 광학 현미경을 사용하여 2D 또는 3D 형광 데이터 세트를 획득한 다음 샘플을 CryoFIB-SEM으로 전송한 후 SEM 및 이온 빔 이미지에 등록했습니다. 보다 최근에는 형광 현미경이 CryoFIB-SEM 진공 챔버에 직접 통합되었습니다. 이러한 통합은 이송 중 얼음 오염을 줄이고 최종 라멜라를 보다 쉽게 이미징할 수 있게 해줍니다. 형광 유도 밀링을 위해 형광 현미경과 CryoFIB-SEM을 결합하기 위해 여러 플랫폼이 개발되었습니다. 이들은 소기관과 큰 단백질 복합체를 성공적으로 표적으로 삼았습니다 5,23,24. 그러나, 몇 가지 예외(30)를 제외하고, 광학 경로는 FIB-SEM과 진공 챔버의 다른 물리적 영역에서 별도의 초점면을 생성한다. 결과적으로 독립형 광학 현미경을 사용할 때 필요한 것처럼 직접 밀링하려면 형광 이미지와 이온 이미지 사이의 정확한 등록이 여전히 필요합니다.

이 정합 프로세스는 세 가지 주요 요인, 즉 굴절률 불일치(명백한 초점 이동을 유발함)31,32, 밀링 중 샘플 움직임 및 위치 파악 오류로 인해 부정확하기 쉽습니다. 또한, 등록은 일반적으로 이온 및 광학 양식 모두에서 볼 수 있는 미크론 크기의 형광 기준에 의해 지원되며 이온과 광학 이미지 간의 변환을 계산하기 위한 정렬 포인트 쌍으로 사용됩니다. 그러나 이러한 비드는 샘플의 형광 신호를 모호하게 하거나 경쟁할 수 있으며, 광학 및 이온 이미지 전반에 걸친 위치 파악 및 정렬은 느리고 사용자 집약적입니다. 이러한 제한으로 인해 작고 희귀한 기능을 일상적으로 타겟팅하는 데 방해가 되었습니다. 현재 얇은 라멜라에서 보존될 수 있는 구조에 대한 정확한 한계를 정의하기는 어렵지만, 등록 기반 접근 방식은 일반적으로 축 치수가 1미크론 미만인 표적을 포착하는 데 효과적이지 않은 것으로 간주됩니다33.

여기서, 우리는 단일 초점 위치(34,35)에서 FIB, SEM 및 형광 현미경을 통합하는 삼중 일치 이미징 시스템의 사용을 보고합니다. 이 구성은 광학 및 이온 이미지를 등록할 필요가 없어 일치하지 않는 통합에 비해 더 간단하고 정확한 형광 유도 밀링을 가능하게 합니다. 낮은 배경과 높은 신호의 이상적인 조건에서 10nm 정도의 유도 정확도를 달성할 수 있습니다36. 또한 최종 얇은 라멜라를 포함하여 밀링 공정 전반에 걸쳐 다색 극저온 형광 현미경 데이터를 획득할 수 있어 회절 제한 대상35의 상관 분석 및 국소화가 가능합니다. 이를 달성하기 위해 맞춤형 이미지 변환 툴킷을 사용하여 이러한 형광 이미지를 저배율 투과 전자 현미경으로 정확하게 정렬하여 CryoET를 수집할 위치를 결정하고 데이터 수집을 간소화하고 최종 단층 촬영 재구성에서 표적 캡처를 보장합니다.

밀링을 안내하기 위해 형광 강도의 변화를 실시간으로 모니터링하는 시스템의 기능을 활용합니다. 타겟을 찾기 위해 광학 및 이온 이미지를 정렬하는 대신 사용자는 샘플의 형광 신호를 관찰하기만 하면 됩니다. 밀링이 진행됨에 따라 형광은 매우 특징적인 방식으로 작동합니다: 현미경 대물렌즈와 형광 표지 샘플 사이의 탄소 지지막이 제거됨에 따라 먼저 밝아지고, 초점이 맞지 않는 자가형광 물질이 밀링되면서 점차 감소하고, 마지막으로 표지된 구조 자체가 부분적으로 제거됨에 따라 급격히 감소합니다. 이 실시간 신호는 밀링 공정의 어디에 있는지, 밀링을 중지할 시기를 정확하게 결정하여 관심 대상이 최종 라멜라(37) 내에 유지되도록 합니다. 자세한 프로토콜에서는 간섭 효과로 인한 형광 밝기의 진동을 사용하여 축 범위가 <300nm인 물체에 밀링을 안내하는 보다 발전된 접근 방식에 대해서도 논의할 것입니다.

우리는 미세소관 조직 센터(MTOC)38을 표적으로 삼아 플랫폼의 유용성을 입증합니다. MTOC는 세포 분열 및 분화에 관여하는 중요한 소기관입니다. 포유류 세포에서 표지된 튜불린의 형광 현미경 검사는 MTOC를 살아있는 세포에서 직경 약 1μm의 단일 형광 점자로 나타냅니다. 이 접근법은 유리화 세포의 얇은 라멜라에 대한 높은 충실도로 MTOC를 성공적으로 국소화하는 데 사용되었습니다. MTOC에서 미세소관의 상세한 조직과 다른 소기관과의 상호 작용은 후속 단층 촬영 재구성에서 밝혀집니다. 이 워크플로우를 사용하면 등록 없이 고정밀 상관 형광 현미경 및 CryoFIB-SEM을 사용할 수 있으므로 사용자 입력을 줄이고 이전에는 일치하지 않는 접근 방식으로 강력하게 캡처할 수 없을 정도로 작았던 세포 구조에 대한 액세스를 확장할 수 있습니다.

정의 및 기기 설명
통합 광학 현미경은 Boltje et al.35에 자세히 설명되어 있으며, 통합 현미경의 사용에 대한 자세한 내용은 최근에 발표된 프로토콜(34)에서 찾을 수 있습니다. 목표는 아래에서 통합되며 x, y 및 z 포지셔닝 기능을 갖추고 있어 FIB-SEM 일치 지점과 정렬할 수 있습니다. 현재 커버슬립 보정기가 있는 100x, 0.85 NA 대물렌즈로 작동합니다. 광학 이미징 (Optical Imaging) 은 커버 글라스 (coverglass) 를 통해 수행되며, 이는 FIB 및 SEM 모두에서 스퍼터링 된 재료 및 조사로부터 목표를 보호합니다. 광시야 조명은 여러 가시 파장에 걸쳐 있는 LED 세트에 의해 제공됩니다. 형광 검출은 sCMOS 검출기를 사용하여 수행됩니다. 세 가지 정의된 스테이지 위치가 있습니다. 로딩: 샘플이 로드되는 스테이지 위치; 코팅: 가스 분사 시스템을 통한 코팅을 위한 스테이지 위치; 3-빔: 세 가지 현미경(FIB, SEM 및 광학) 현미경을 모두 함께 정렬할 수 있는 스테이지 위치입니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고: 여기에 사용된 삼중 일치 시스템은 상업적으로 이용 가능한 이중 빔 FIB-SEM 시스템에 통합된 맞춤형 극저온 형광 이미징 구성 요소입니다. 연산의 원리와 순서는 일반적으로 미래의 삼중 일치 구현에 적용될 수 있습니다.

1. 설정

  1. 시스템을 극저온으로 냉각합니다. 두 개의 센서를 사용하여 온도를 모니터링합니다 : 하나는 샘플 스테이지에, 다른 하나는 챔버 내부에 있습니다. 샘플에 얼음이 쌓이는 것을 최소화하기 위해 샘플 스테이지를 챔버보다 약 20°C 더 따뜻하게 유지합니다(예: 스테이지 ~-170°C, 챔버 ~-190°C). 냉각 과정은 일반적으로 약 1.5시간이 소요됩니다.

2. 샘플 로딩

  1. 시스템 온도가 극저온(약 -167.5°C)에 가까워지면 액체 질소를 사용하여 이송 스테이션을 수동으로 냉각합니다. 시스템 온도는 광학 현미경 소프트웨어의 왼쪽 상단 모서리에 표시됩니다.
  2. 클립된 Autogrid 하나를 극저온 광학 현미경 시스템용으로 설계된 샘플 카세트에 로드합니다. 카세트는 접착된 커버슬립과 스페이서로 구성되며 오토그리드는 그 사이에 위치합니다. 링 나사를 조여 카세트를 닫은 다음 이송 스테이션34의 슬롯에 삽입합니다.
  3. 전송 스테이션을 시스템에 연결하고 내부 챔버 카메라를 사용하여 샘플 카세트를 샘플 스테이지로 안내합니다.

3. 시료 코팅용 가스 주입 시스템(GIS)

  1. 광학 현미경 제어 소프트웨어를 열고 샘플 스테이지를 로딩 위치에서 코팅 위치로 이동합니다.
  2. Snowflake 아이콘을 클릭하여 FIB-SEM 제어 소프트웨어를 사용하여 GIS 바늘을 삽입합니다. GIS 제어에서 GIS 바늘 삽입 옵션을 선택합니다.
  3. 가스 흐름을 열어 30초 동안 GIS 증착을 허용합니다.
    참고: 이것은 샘플 유형에 따라 20초에서 1분까지 다양합니다. 이 단계의 목표는 후속 FIB 밀링 절차 중에 샘플을 충분히 보호하는 것입니다.
  4. GIS 바늘을 후퇴시키고 샘플 스테이지를 미리 정의된 로딩 위치로 다시 이동합니다.

4. 3빔 시스템 정렬

참고: 이 섹션은 Wang39에서 각색되었습니다.

  1. 광학 현미경 소프트웨어에서 샘플 스테이지를 로딩 위치에서 미리 정의된 3빔 위치로 이동합니다.
  2. FIB-SEM 소프트웨어에서 왼쪽 상단 창을 클릭하고 SEM을 100배의 배율로 설정합니다.
  3. 광학 현미경 소프트웨어의 정렬 탭에서 보기 기능을 클릭하여 그리드의 SEM 아틀라스를 획득합니다. 이 아틀라스 이미지는 이전에 설정된 매개변수를 사용합니다.
  4. 탄소막이 깨진 정사각형 영역을 식별하고 이를 두 번 클릭하여 샘플 스테이지를 해당 위치로 이동합니다.
  5. FIB-SEM 제어 소프트웨어로 돌아가서 SEM을 더 높은 배율 로 조정하여 시야 중앙에서 선택한 정사각형 영역에 초점을 맞춥니다.
  6. SEM이 깨진 탄소막의 날카로운 모서리와 같은 구별 가능한 패턴에 초점을 맞출 때까지 필요에 따라 4.4단계와 4.5단계를 반복합니다.
  7. 형광 현미경을 켜고 x, y, z 좌표를 조정하여 SEM 보기와 일치시킵니다.
  8. FIB로 작은 패턴(예: 작은 직사각형 또는 원)을 밀링합니다.
  9. FIB 및 형광 현미경 보기 모두에서 패턴이 표시되는지 확인합니다. 필요한 경우 4.3-4.7단계에 따라 정렬을 조정합니다.
    참고: 광학 현미경과 이온 현미경의 정렬 및 등록이 완료되었습니다.

5. 타겟 현지화 및 밀링

참고: 이 섹션은 Wang39에서 각색되었습니다.

  1. 광학 현미경 소프트웨어의 Localization 탭으로 이동하여 적절한 여기 및 필터링 조건을 활성화하여 형광 채널을 설정합니다. 각 형광단을 별도의 채널로 할당하고 투과광(또는 명시야)을 위한 추가 채널을 포함합니다.
  2. 각 형광 채널의 LED 출력과 노출 시간을 조정하여 관심 대상을 식별합니다. 참고로 SiR-튜불린을 이미징할 때 30mW의 일정한 LED 전력 설정으로 1.2초 노출을 사용합니다.
    참고: 매개변수는 형광단마다 다를 수 있습니다. 광학 강도는 샘플에서 ~25-50 W/cm2 미만으로 유지되어야 합니다. 이보다 더 큰 강도는 샘플37,40의 상당한 가열 및 탈석을 초래할 수 있습니다.
  3. 매개변수에 만족하면 축 방향을 통해 단계적으로 단계적으로 걸린 사전 밀링 형광 z-스택을 획득합니다. 그런 다음 목표를 ROI로 표시합니다.
  4. FIB-SEM 소프트웨어로 전환하여 ROI에서 라멜라를 그립니다.
  5. 황석 밀링을 수행하여 ROI 위와 아래 약 3μm의 재료 대부분을 제거합니다. 한편, 밀링 중에 형광 현미경을 켜두어 형광 신호의 감소를 모니터링하십시오.
  6. 세척 단면 모드를 사용하여 ROI를 ~2μm로 얇게 만듭니다.
  7. 터미널에서 Python 기반 간섭계 툴킷을 열어 라멜라(https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite)36을 얇게 만드는 동안 형광 신호를 모니터링합니다.
  8. 후속 밀링 및 연마의 경우 아래 5.9 또는 5.10단계에서 설명한 두 가지 접근 방식 중 하나에 따라 선택한 타겟의 치수에 따라 직접 밀링합니다.
    1. 표적의 축 범위 > 300nm
      참고: 여기서는 직접 밀링에 반파괴적 접근 방식을 사용합니다.
      1. Python-GUI에서 형광 현미경 사진에서 관심 대상을 선택합니다. 소프트웨어는 각각의 새 프레임에서 시간의 함수로 밝기를 자동으로 그리기 시작합니다.
      2. Python 툴킷을 통해 형광 강도를 모니터링합니다. 샘플을 아래에서 세척 단면 모드로 밀링하여 해당되는 경우 남아 있는 지지 필름 재료를 제거합니다.
        참고: 지지 필름을 제거하면 형광이 향상되는 것을 관찰해야 합니다.
      3. 형광 강도의 급격한 감소(형광 재료의 손실을 나타냄)를 밀링 방향을 전환해야 할 시기에 대한 신호로 사용합니다. 예를 들어, 아래에서 위로 밀링하고 형광이 급격히 감소하는 것이 관찰되면 밀링을 중지하고 위에서 아래로 밀링으로 전환합니다.
        참고: 구조가 너무 빨리 제거되면 FIB-SEM 소프트웨어에서 밀링 전류를 줄여 타겟 제거 속도를 늦추십시오.
    2. 표적의 축 방향 범위 ≤ 300nm
      참고: 여기에서는 간섭계 효과를 사용하여 밀링(36)을 지시할 것입니다.
      1. Python-GUI에서 형광 현미경 사진에서 관심 대상을 선택합니다. 소프트웨어는 각각의 새 프레임에서 시간의 함수로 밝기를 자동으로 그리기 시작합니다.
      2. 테스트 타겟을 통해 위에서 아래로 밀링하는 것으로 시작합니다. 형광 강도를 통해 타겟을 밀링하기 직전에 프린지 대비를 모니터링합니다. 형광 타겟은 2D 가우시안에 지속적으로 적합되며, 적합은 플롯된 통합 강도를 얻는 데 사용됩니다.
      3. 대상이 밀링된 후 Python-GUI를 사용하여 강도 추적의 진동을 다음 모델 함수에 맞춥니다.
        figure-protocol-1
        여기서 A 는 진동의 진폭, λ 는 여기의 파장, k 는 광원의 일관성 길이를 나타내는 감쇠 항, 위상 계수 Φ, d 는 캡처 대상까지의 거리입니다. 테스트 대상에서 모든 항은 거리 d가 밀링에 대한 형광 물체의 상대적 위치를 사용자에게 알려주는 데 사용되는 유일한 자유 변수가 되도록 합리적인 범위 내에서 예측할 수 있습니다. 자세한 내용은 Sica et al.36.
        참고: 후속 대상의 경우 툴킷은 동일한 모델 함수로 강도 추적을 라이브 피팅하고 위에서 아래로 밀링을 중지할 위치를 추정합니다. 모든 피팅은 밀링과 동시에 수행됩니다. 목표는 타겟이 상단 표면 아래 원하는 라멜라 두께의 절반과 같은 깊이에 있을 때 밀링을 중지하는 것입니다.
      4. 하향식 밀링이 완료된 후 원하는 두께에 도달할 때까지 클리닝 단면 모드에서 아래에서 위로 밀링하여 라멜라를 마무리합니다.
  9. 밀링 후 형광 이미지를 촬영합니다.

6. 상관 광학 현미경 및 기울기 시리즈 수집

  1. 샘플을 CryoTEM으로 옮긴 후 전체 그리드를 충분히 커버할 수 있도록 182x에서 그리드의 아틀라스 개요를 수집합니다.
  2. 6,500배에서 11,000배 사이의 적절한 중간 배율에서 0° 기울기에서 최종 라멜라의 일련의 몽타주 이미지를 수집합니다.
  3. 6.2단계의 포스트 밀링 다중 채널 형광 이미지와 프로젝션 이미지를 ROI 등록(https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git)을 위한 맞춤형 투영 변환 소프트웨어로 읽습니다.
  4. 총 8-10쌍의 기준점을 선택하여 투영 이미지 변환을 정확하게 계산합니다.
    참고: 이러한 점은 명시야 광학 현미경과 전자 현미경 모두에 존재하는 명백한 특징(예: 라멜라 가장자리, 눈에 보이는 얼음 오염 또는 열린 그리드 구멍)일 수 있습니다.

7. 고배율 틸트 시리즈 컬렉션

  1. 이 오버레이된 형광 및 투과 전자 현미경 이미지를 참조로 사용하여 사용자가 고배율 틸트 시리즈 수집을 위해 카메라 프레임 크기 제한 내에서 이미징 영역을 선택할 수 있습니다.
  2. 생물학적 질문에 따라 기울기 시리즈의 배율과 매개변수를 선택합니다.
    참고: 데모를 위해 54 Å 3.5의 픽셀 크기에서 2° 단위로 41,42,43°에서 데이터를 수집했습니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 동결하기 전에 튜불린 마커 SiR-튜불린으로 분화된 대식세포 세포를 표지했습니다. 프로토콜에 따라, 우리는 형광 현미경 하에서 MTOC를 단일 ~ 1μm 직경의 형광 누점으로 식별했습니다(그림 1A). 또한, 미세소관 네트워크와 일치하는 MTOC에서 세포 주변을 향해 방사되는 원섬유 유사 형광 구조를 관찰했습니다(그림 1A). 다양한 시편 두께의 단계적 밀링 스냅샷은 그림 1B에 나와 있습니다. 특히, 라멜라가 약 800nm의 두께에 도달함에 따라 단일 MTOC 누점은 각각 직경이 약 700nm인 두 개의 인접한 반점으로 분해되었습니다. 후속 분석을 통해 각 반점이 개별 중심소체에 해당한다는 것이 확인되었습니다.

이미징과 밀링을 동시에 통해 형광 강도의 변화를 실시간으로 모니터링할 수 있었습니다. 특히, 벌크 비형광 물질과 흡수 지지 필름을 제거한 후 형광의 증가를 관찰했습니다(그림 1B-D). 라멜라가 2μm에서 800nm로 얇아짐에 따라 형광 강도가 급격히 감소하여 표지된 구조의 점진적인 제거를 반영했습니다. 이러한 감소는 라멜라가 200nm 이하로 더 얇아지면서 계속되었습니다(그림 1B-D). 상관 형광 이미지와 전자 현미경 아틀라스는 당사의 워크플로우가 밀링을 위한 정확한 타겟팅을 가능하게 함을 보여줍니다(그림 2A). 재구성된 단층 촬영 및 분할 모델은 중심소체가 이전 보고서 42,43,44,45와 일치하는 미세소관 삼중항으로 구성되어 있음을 보여줍니다(그림 2A,B). 최종 라멜라에서 하나의 형광 반점만 보존되는 경우, 해당 단층촬영에서 단일 중심소체를 관찰합니다(그림 2B).

figure-results-1
그림 1: 미세소관 조직 센터의 정확한 국소화를 위한 삼중 일치 CryoFM-FIB-SEM의 워크플로우. (A) (왼쪽) 생세포 현미경 및 (오른쪽) MTOC의 CryoFM. 스케일 바 = 10μm. (B) 표적 밀링을 위한 CryoFM 및 CryoFIB의 단계별 스냅샷. 클로즈업 FM 보기는 노란색 점선 상자로 표시됩니다. 중심소체는 노란색 화살표로 표시됩니다. 스케일 바 = 5 μm. (C) CryoFIB 밀링 중 MTOC의 형광 강도. (D) CryoFIB 밀링 중 여러 단계에서 촬영된 MTOC를 가로지르는 형광 라인 프로파일. 약어: CryoFM-FIB-SEM = 집속 이온 빔 밀링 및 주사 전자 현미경을 사용한 극저온 형광 현미경; MTOC = 미세소관 조직 센터; ROI = 관심 영역. 이 수치는 Wang39에서 채택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 삼중 일치 CryoFM-FIB-SEM 워크플로우에 의해 밝혀진 MTOC의 분자 세부 사항. (A) MTOC의 상관 FM, EM 및 분할 모델. (a) 포스트 밀링 FM 이미지. 이것은 180nm로 표시된 그림 1B 의 마지막 패널과 동일한 이미지이지만 CryoET 재구성 및 분할과 일치하도록 회전되었습니다. 스케일 바 = 5 μm; (b) (a)에서 노란색으로 표시된 점선 영역의 확대 보기. (c) (2)에 표시된 청록색 점선 영역의 상관 FM 및 TEM 투영. 스케일 바 = 1 μm. (d) 관심 영역(노란색, 중심소체, 녹색, 미세소관)에서 단층 촬영 재구성의 분할 모델. 스케일 바 = 100nm. (B) 서로 다른 중심소체 방향을 나타내는 두 개의 서로 다른 라멜라의 대표적인 FM 이미지 및 단층 촬영 슬라이스. FM: 스케일 바 = 5μm. 단층 촬영 슬라이스: 스케일 바 = 200nm. 약어: CryoFM-FIB-SEM = 주사 전자 현미경을 이용한 극저온 집속 이온 빔 밀링; MTOC = 미세소관 조직 센터; FM = 형광 현미경; ET = 전자 전송; TEM = 투과 전자 현미경. 이 수치는 Wang39에서 채택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리의 결과는 동시 형광 이미징과 밀링을 가능하게 하는 삼중 일치 이미징 플랫폼의 유용성을 강조합니다. 이 피드백을 활용하여 밀링 중 굴절률 불일치 및 움직임과 관련된 근본적인 정확도 제한에 직면하는 번거로운 등록 기반 접근 방식의 필요성을 피하는 두 가지 형광 유도 밀링 전략(반파괴 및 간섭계)을 보여줍니다 12,33,46. 또한, 정확한 안내는 SEM이 아닌 형광 현미경에 의존하기 때문에, 강도가 탈석화로 이어지는 임계값 미만으로 유지되는 한 광학 방사선은 검출 가능한 손상을 초래하지 않습니다(37,47). 여기에 시연된 기능은 접근 가능한 생물학적 샘플을 확장하여 희귀하고 작은(축 범위에서 <300nm) 관심 표적을 포함하도록 하는 동시에 워크플로를 간소화합니다.

이 프로토콜의 핵심 단계는 관심 대상의 형광 밝기 변화에 따라 밀링을 중지할 시기를 결정하는 것입니다. 현재 여기에는 원하는 시간에 밀링을 중지하기 위한 신속한 수동 개입이 포함됩니다. 이 방법은 현재 탐색된 대상에 충분한 것으로 입증되었지만 향후 수정을 통해 Python 툴킷을 FIB 시스템에 추가로 통합하여 밀링을 직접 중지할 수 있습니다. 더 빠른 밀링 속도가 필요한 경우 수동 개입 시간이 줄어들기 때문에 이 수정이 필요할 수 있습니다. 또는 느린 밀링 속도를 견딜 수 있는 경우 필요한 경우 수동 개입에 더 많은 시간을 할애할 수 있습니다.

관심 있는 라멜라 함유 생물학적 구조를 생성한 후 당사의 맞춤형 이미지 변환 소프트웨어는 CryoET 데이터 수집을 안내하기 위해 라멜라의 아틀라스 개요를 사용하여 CryoTEM 수준에서 상관 관계를 가능하게 합니다. 전반적으로, 여기에 제시된 프로토콜은 두꺼운 진핵 세포 샘플에서 극저온 전자 단층 촬영에 의해 형광 표지된 작고 희귀한 생물학적 표적을 이미징하는 데 필수적입니다. iFLM이 탑재된 Aquilos 2와 같은 기존의 일치하지 않는 Cryo-FIB 시스템과 비교할 때 당사의 워크플로는 이러한 기능을 대상으로 하는 데 더 높은 성공률을 달성합니다.

이러한 높은 타겟팅 정밀도는 효율성을 희생합니다. 밀링은 자동화가 아닌 수동이기 때문에 라멜라 생성의 처리량이 제한됩니다. 8시간 밀링 세션에서 일반적으로 6-8개의 라멜라를 생산하며 약 5개에는 관심 대상이 포함되어 있습니다. 그러나 우리는 이 워크플로가 향후 처리량을 개선하기 위해 자동화될 수 있다고 믿습니다. 자동화를 위해서는 FIB 이미지의 활성 밀링 영역을 지속적으로 모니터링하고 형광 강도를 실시간으로 추적하여 표적 유지를 보장하는 맞춤형 스크립트가 필요합니다. CryoFIB-SEM과 형광 현미경 모두에 대한 모든 맞춤형 스크립트와 제어 소프트웨어 간의 효과적인 통신을 설정하는 것을 포함하여 주요 과제가 남아 있습니다.

미래를 내다보면 형광 바이오센서, 초고해상도 이미징 및 공초점 현미경을 포함하여 앞서 논의한 다른 고급 형광 현미경 기술을 통합하기 위해 해야 할 일이 많이 있습니다. 그럼에도 불구하고 우리는 삼중 일치 형상이 미래 기기의 표준이 될 것이며 밀링 중 동시 형광 이미징이 일상이 될 것으로 예상합니다. 그렇다면 이 프로토콜은 크기와 풍부함에도 불구하고 세포 생물학의 중심인 작고 희귀한 생물학적 구조의 분자 규모 세부 사항을 포착하려는 연구자에게 귀중한 지침이 될 수 있습니다.

공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이미징 워크플로 개발에 도움을 주신 Delmic 회원들에게 감사의 말씀을 전합니다. PDD는 계약 DE-AC02-76SF00515에 따라 에너지부 연구소 주도 연구 개발 프로그램의 일환으로 SLAC 국립 가속기 연구소의 Panofsky Fellowship과 계약 번호에 따라 에너지부, 과학실, 생물학 및 환경 연구실의 지원을 받았습니다. DE-AC02-76SF00515 FWP 100883. 이 작업은 국립보건원(National Institutes of Health)에서 GJJ에 대한 보조금 AI127401의 지원을 부분적으로 받았습니다. JW는 실리콘 밸리 커뮤니티 재단(Silicon Valley Community Foundation)의 자문 기금인 Chan Zuckerberg Initiative DAF의 보조금 2021-234593의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아퀼로스 2 냉동 FIB서모피셔 사이언티픽https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/dualbeam-fib-sem-microscopes/aquilos-cryo-fib.html?cid=msd_ls_xseg_xmkt_sdb-aquilos_285811_na_pso_gaw_pei90m<브레르/> & gad_source=1& gad_campaignid=12
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오토그리드 호환 크라이오 그리드 박스전자현미경 과학https://www.emsdiasum.com/autogrid<브레르/> -compatible-cryo-grid-box?srsltid=
AfmBOorQAd3esD8fLmnDDO2TvrNk
cj4UINXFnPSMgrpEmkWd0H7ImUq7
오토그리드 링과 C-클립나노소프트https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/100-pack-autogrid-rings-c-clips
CLEM 소프트웨어 스위트스탠포드/SLAC의 달버그 연구 그룹https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git
드래곤플라이 2022.1대상 연구 시스템https://dragonfly.comet.tech/
엔젤델믹 B. V.ENZEL 시스템은 맞춤형 기기이며 현재 상업적으로 제공되지 않습니다
IMOD 4.12콜로라도 대학교https://bio3d.colorado.edu/imod/
LD4 액체질소 듀어(LD4)나노소프트https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/ld4-liquid-dewar-4-liters
MATLAB 2023수학 작품https://www.mathworks.com/products/matlab.html
핀 뚜껑 조작기 도구나노소프트https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/pin-lid-manipulator-tool
파이썬 툴킷스탠포드/SLAC의 달버그 연구 그룹https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite
Quantifoil R2/2, LF, 200 메쉬, Au EM 그리드전자현미경 과학https://www.emsdiasum.com/quantifoil-r-22-lf-200-mesh-gold
시리얼 EM콜로라도 대학교 볼더 캠퍼스https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
스피어랩 표준 선박 (이송 듀어)나노소프트https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/spearlab-standard-vessel
핀셋전자현미경 과학https://www.emsdiasum.com/style-3sa

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