방법 논문

섬유증을 동반한 대사성 기능 장애 관련 지방성 간 질환의 마우스 모델

DOI:

10.3791/68294

⸱

2025년 7월 18일

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1Brooklyn College, City University of New York

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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대사 기능 장애, 간 유전자 발현 변화 및 진행성 섬유증 3기로 진행되는 섬유증을 포함하여 인간 MASLD와 유사한 간 조직병리학적 변화를 동반한 대사 기능 장애 관련 지방성 간 질환(MASLD)의 마우스 모델. 이 모델은 MASLD 병태생리학 연구 및 새로운 치료법의 전임상 연구에 사용할 수 있습니다.

초록

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간 섬유증은 대사 기능 장애 관련 지방성 간 질환(MASLD)의 부작용을 예측하는 가장 중요한 변수입니다. MASLD의 전임상 연구에서 마우스는 가장 일반적으로 사용되는 질병 모델입니다. 그러나 이러한 모델에서는 간 섬유증을 유발하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 과식성 Ay 마우스에게 미국의 평균 식단과 유사한 지방과 과당이 많은 식단을 먹이는 MASLD의 마우스 모델을 설명합니다. 생쥐는 간 지방증, 부상, 염증 및 섬유증을 일으킵니다. 섬유증은 16주 후 세포 주위 1기 섬유증에서 12개월 후 브리징(bridging), 3기 섬유증으로 진행됩니다. 이 쥐는 또한 비만, 고중성지방혈증, 포도당 과민증 및 고인슐린혈증을 앓고 있습니다. 이 질병 모델은 간 조직 병리학, 간 유전자 발현 변화 및 인간 질병의 대사 기능 장애를 복제합니다. 이 프로토콜에는 섬유증을 정량화하는 두 가지 방법이 포함됩니다: 피크로-시리우스 레드에 의한 콜라겐의 조직학적 염색과 하이드록시프롤린의 간 함량 정량화. 이러한 방법은 MASLD 병태생리학 연구 및 잠재적 치료법의 전임상 연구에 사용할 수 있습니다.

서론

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대사성 지방간질환(MASLD)은 가장 흔한 간 질환으로, 미국에서는 31%에서 40%, 전 세계에서는 42%의 유병률을 보이고 있습니다 1,2,3,4. MASLD 환자는 이전에 비알코올성 지방간염(NASH)으로 명명되었던 대사성 관련 지방간염(MASH), 간경변 및 간세포 암종으로 발전할 수 있습니다 5,6. MASLD는 간세포암의 위험을 증가시키며, 최근 MASLD의 유병률이 증가함에 따라 간세포암이 발병한 환자에서 가장 흔한 간 질환이 되었습니다 7,8. MASLD에서 섬유증은 간경변으로의 진행과 간 관련 이환율(간 보상 부전, 간부전 또는 간암) 및 간 관련 사망률을 포함한 부정적인 임상 결과의 주요 예측 인자입니다 6,9,10,11. 따라서, 미국 식품의약국(Food and Drug Administration)은 섬유증을 동반한 MASH/NASH에 초점을 맞춘 치료제 개발과 적절한 동물 모델의 사용을 장려한다12.

약물의 전임상 연구와 MASLD의 기계론적 연구에서는 마우스 모델이 가장 일반적으로 사용된다13. MASLD에 대한 수천 개의 마우스 모델이 설명되었으며, 이는 최적 모델13,14에 대한 합의가 부족함을 시사합니다. 최적 모델을 수립하는 데는 몇 가지 과제가 있습니다. 지방이 많은 사료를 먹임으로써 생쥐의 비만과 지방증을 유발하는 것은 비교적 쉽지만, 간 섬유증은 유도하기가 더 어렵다 13,14,15,16. 비만을 유발하는 식단에 의한 MASLD 모델에서는 섬유증이 천천히 진행된다17 이러한 느린 진행은 인간 질병을 더 잘 모방할 수 있지만18 동물 연구의 기간과 비용을 증가시킨다. 콜레스테롤 함량이 높은 식단(예: 2%)은 섬유증의 발병을 촉진합니다. 그러나 그들은 또한 인간 질병15,16에 설명 된 증가와 반대되는 콜레스테롤의 내인성 합성을 감소시킵니다. 일부 MASLD 모델은 돌연변이 또는 유전자 변형 마우스를 사용합니다. 그러나 다음과 같은 주의 사항이 있을 수 있습니다: OB/OB 마우스는 비만, 지방증 및 인슐린 저항성을 일으키지만 섬유증의 매개체인 렙틴이 부족합니다. PTEN null 마우스는 지방증을 일으키지만 인슐린 저항성은 발생하지 않습니다15,17. 따라서 MASLD의 마우스 모델은 종종 긴 연구 기간, 콜레스테롤 함량이 높은 식단 또는 심각한 섬유증이 발생하기 위한 유전자 조작을 필요로 한다14. 이러한 문제 중 일부를 해결하기 위해 우리는 동물이 세포주위/정현파(perisinusoidal)(1단계)에서 가교 섬유증(3단계)으로 진행되는 섬유증을 동반한 MASLD를 발병하는 마우스 모델을 개발했습니다19.

이 논문의 목표는 간 섬유증을 동반한 MASLD 모델과 섬유증을 정량화하는 두 가지 방법, 즉 피크로-시리우스 레드에 의한 콜라겐 조직학적 염색 및 간 하이드록시프롤린 함량의 정량화를 설명하는 것입니다.

이 모델을 개발한 이유는 가장 유용한 동물 모델은 질병의 동인과 조직 병리학 및 유전자 발현의 변화 모두에서 인간 질병을 가장 잘 복제하는 모델이라는 것이었습니다. 따라서 우리는 적당히 많은 양의 지방과 과당을 포함하여 미국의 평균 식단과 유사한 식단을 사용했습니다19,20. 우리는 이 식단을 Agouti yellow(Ay) 돌연변이를 가진 쥐에게 먹였는데, 이 돌연변이는 비만의 모델로 광범위하게 사용되어 왔다21. 이 마우스는 MC4R을 포함한 멜라노코르틴 수용체의 길항제인 아구티 단백질을 유비쿼터스하게 발현하여 과식증을 유발하고 인간 비만에서 흔히 발생하는 음식 섭취량 증가를 복제합니다 21,22,23. 이 모델은 지방증, 간세포 손상, 염증, 섬유증 및 대사 기능 장애를 포함하여 MASH를 정의하는 변경 사항을 요약합니다.

이 모델의 주요 장점은 인간 질병과 유사한 특성입니다. 이 모델은 전형적인 미국 식단과 유사하게 설계된 서구식 식단을 사용하며 인간 MASLD14,20의 표현형을 복제하는 데 가장 효과적인 식단인 것으로 나타났습니다. 마우스는 MASH19,24를 가진 인간의 간에서 설명된 것과 유사한 간 조직병리학적 변화를 일으킵니다. 생쥐는 대사 기능 장애를 일으키는데, 이는 MASLD5 진단을 위한 필수 기준입니다. MASH에 감염된 마우스의 간은 MASH/NASH에 감염된 인간의 유전자 발현 변화를 재현하는 유전자 발현의 변화를 보여줍니다19. 최근 연구에서는 MASLD의 39개 마우스 모델을 인간 질병과의 유사성을 비교했습니다. 여기에는 MC4R 녹아웃 마우스가 포함되었는데, 이들은 동일한 식식 과식 기전을 공유하고 우리가 설명하는 모델과 동일한 식단을 받았습니다14. 이 모델은 표현형(phenotype), 간 조직병리학(liver histopathology), 전사체학(transcriptomics)에 의해 평가된 인간 MASLD와의 유사성으로 인해 5위(39개 중)를 차지했다14.

이 모델의 추가 장점은 다음과 같습니다 : Ay 마우스는 Jackson Laboratory에서 상업적으로 이용 가능하며 대사 연구에서 일반적으로 사용되는 C57BL / 6J 균주에서 사용할 수 있습니다21,25; 돌연변이 마우스는 털 색깔로 쉽게 식별할 수 있습니다. 이 모델은 MASLD의 발달에서 특정 유전자의 역할을 연구하기 위해 이득 또는 기능 손실 모델과 결합될 수 있습니다. 마지막으로, 이 모델은 영양 결핍(콜린 또는 메티오닌 결핍), 비정상적인 식품 성분(콜산, 에티오닌), 비정상적으로 높은 함량의 특정 영양소(트랜스 지방) 또는 간독소(사염화탄소)를 사용하지 않으며, 이는 MASLD의 일반적인 원인이 아니며 인간 질병을 복제하지 않을 수 있습니다 13,14,17.

이 방법은 MASLD의 발병 및 진행에 기여하는 메커니즘의 조사와 치료 또는 예방을 위한 중재의 평가에 적합합니다. 이 모델은 동물이 지방간염과 대사 기능 장애를 모두 발병할 뿐만 아니라 3기로 진행되는 섬유증도 발병하기 때문에 특히 유용합니다. 이 모델은 섭식 작용에 영향을 미치는 메커니즘(예: GLP1R 작용제)에 대한 연구에는 적합하지 않을 수 있는데, 이러한 마우스는 과식증이 있기 때문입니다.

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프로토콜

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이 프로토콜은 Brooklyn College의 동물 관리 지침을 따릅니다. IACUC 프로토콜 번호 318.

1. 섬유증이 있는 MASLD의 마우스 모델

  1. Ay 자손을 생산하기 위해 쥐를 번식시킵니다. Ay 마우스(B6. Cg-ay/J)입니다. 새끼의 생년월일을 기록하십시오.
  2. 적절하고 균일한 먹이와 성장을 촉진하기 위해 새끼가 비슷한 수의 새끼를 갖도록 하십시오. C57BL/6J 마우스의 평균 깔짚 크기이므로 한 배에 5-6마리의 새끼를 낳는 것을 목표로 합니다. 여분의 새끼, 우선적으로 필요하지 않은 성별의 새끼는 안락사시키거나 양육할 수 있습니다.
    참고: Ay 수컷과 야생형 암컷(C57BL/6J Jax 0000664)을 사용하면 야생형 C57BL/6J 암컷 마우스는 구하기 쉽고 Ay 암컷 마우스보다 더 나은 육종가가 될 수 있으므로 번식의 효율성을 향상시킬 수 있습니다.
  3. 아래 설명된 대로 실험용 케이지를 설정합니다.
    1. 노란색 털 색깔로 Ay 마우스를 식별합니다. 각 마우스에 고유한 ID를 할당하고 마우스에 태그를 지정하거나 표시합니다.
      참고: agouti 유전자의 agouti yellow (Ay) 대립유전자는 노란색 털 색을 부여합니다. 대립유전자는 이형접합체(heterozygotes)에서 반우성(semidominant)입니다. 동형접합성은 배아 치사를 일으킵니다. 따라서 노란색 털 색깔을 가진 마우스는 Ay 유전자에 대해 이형접합적입니다.
    2. 생후 21일이 되면 쥐를 젖을 뗍니다. 연구 기간 동안 같은 케이지에 수용될 마우스를 함께 그룹화합니다. 케이지당 3-4마리의 Ay 생쥐를 수용할 수 있으며, 예상 체중 및 기관 지침에 따릅니다.
    3. 표준 차우와 물을 먹이십시오. 표준 온도(20-23 °C) 및 상대 습도(40% - 60%)에서 12시간 조명, 12시간 다크 사이클의 하우스 마우스.
  4. Ay 마우스에게 아래와 같이 생후 8주부터 지방과 과당이 많은 식단(High Fat and Fructose Diet, HFFD)을 먹이십시오.
    1. Ay 마우스에게 지방과 자당이 많은 서양식 식단(Adjusted calories Western Diet Inotiv TD.88137)을 자유 분방하게 제공합니다.
    2. 음용수에 과당(23g/L)과 포도당(19g/L)이 포함된 용액을 준비합니다. 0.2μm 필터를 통한 여과로 용액을 멸균하고 멸균 병에 보관합니다. 개봉한 후에는 용액을 냉장 보관하십시오.
    3. 멸균된 음료수 병에 과당과 포도당이 포함된 용액을 생쥐에게 제공합니다. 용액과 병을 적어도 매주 교체하여 미생물의 성장을 확인하십시오.
    4. 영양가가 없는 케이지 침구(예: 나무 조각)를 사용하십시오.
  5. 대조군 마우스에게 아래와 같이 지방과 과당이 적은 식단을 먹이십시오.
    참고: 사용할 대조군 마우스의 유형은 연구 설계에 따라 다릅니다: Ay-HFFD 마우스를 사용하여 약물의 효과를 평가하는 경우 대조군 마우스는 위약으로 처리된 Ay-HFFD 마우스일 수 있습니다. 이 모델을 사용하여 섬유증 발병에 대한 유전자 변형의 영향을 연구하는 경우 유전자 변형이 없는 Ay-HFFD 마우스를 대조군으로 사용할 수 있습니다. MASH가 없는 컨트롤이 필요한 경우 여기에 설명된 단계를 따르십시오.
    1. Ay 마우스의 리터레이트인 야생형 마우스를 사용합니다. 그들은 검은 털 색깔로 식별할 수 있습니다.
    2. 생쥐에게 대조군 식단(저지방 조절 식단 Inotiv TD.08485, 저지방 및 과당 식단, LFFD라고 함)을 같은 나이부터 먹입니다. 생쥐에게 정기적으로 식수를 제공하십시오.
  6. 매주 쥐의 체중을 측정하여 깨어 있는 동물을 용기에 담아 실험실 저울에 올려놓고 체중을 기록하여 비만 발병을 모니터링합니다.
  7. 쥐가 항상 충분한 음식과 마실 수 있는 용액을 가지고 있는지 확인하십시오. 원하는 경우 칼로리 섭취량을 추정하기 위해 음식 및 음주 용액 섭취량을 모니터링하고 기록합니다.
  8. 아래 설명된 대로 조직을 수집합니다.
    1. HFFD 다이어트를 16주 후에 조직 채취를 수행합니다. 이산화탄소 흡입(또는 기관의 IACUC에서 승인한 기타 방법)으로 마우스를 안락사시킵니다.
      참고: 16주 후, HFFD 식단을 먹인 Ay 마우스는 일반적으로 1기 섬유증을 앓습니다. 기간을 연장하면 섬유증이 더 심해져서 9개월에서 12개월 후에 3기로 진행된다.
    2. 마우스의 무게를 측정하고 무게를 기록합니다19.
    3. 필요한 경우 혈액을 채취하십시오. 이를 위해 복부를 연 후 간을 절개하기 전에 1mL 주사기와 27G 바늘로 하대정맥에서 혈액을 채취합니다(또는 IACUC에서 승인한 다른 방법 사용).
    4. 정중선 절개로 복부를 열고 집게로 간을 잡고 간을 횡격막과 후복막에 묶는 인대를 가위로 잘라 간을 절개합니다. 간의 무게를 측정하고 무게를 기록합니다.
    5. 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 간을 헹굽니다. 간 사진을 촬영하고 자 또는 기타 물체를 이미지의 크기 참조로 포함합니다. 얼음 위에 놓인 페트리 접시에 간을 놓습니다.
    6. 정중엽(median lobe), 좌엽(left lobe), 우측엽(right lobe)을 포함한 여러 엽(lobe)의 샘플(샘플당 약 100-150mg)을 해부합니다. 고정을 용이하게 하기 위해 샘플의 두께가 4mm 이하인지 확인하십시오. 24시간 동안 고정액(포르말린 10% 또는 포름알데히드 4%)에 넣고 조직병리학적 분석을 위해 처리합니다(아래 참조).
    7. 여러 엽의 추가 샘플을 해부합니다. 튜브(1.5 또는 2mL)에 넣고 액체 질소에 담가 얼린 다음 -80°C에서 보관하십시오. 이 샘플은 하이드록시프롤린 함량을 측정하는 데 사용됩니다.
    8. 원하는 경우 다른 장기(지방 조직, 근육 등)의 샘플을 수집합니다.

2. 콜라겐 조직화학적 염색 및 형태 측정 정량화

알림: 유해 및/또는 휘발성 화학 물질을 사용해야 하는 단계는 흄 후드에서 수행해야 합니다. 모든 슬라이드는 염색 접시와 슬라이드 홀더를 사용하여 병렬로 처리해야 합니다.

  1. 아래 설명된 대로 간 절개를 준비합니다.
    1. 간 조직을 포르말린(또는 포름알데히드)에 넣어 실온에서 24시간 동안 보관하여 고정합니다. 조직 부피보다 20배 큰 고정액을 사용하십시오. 다음으로, 조직을 70% 에탄올로 옮깁니다. 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
      참고: 조직은 조직학 카세트에 넣은 다음 고정제가 있는 용기에 넣거나 개별 용기 또는 튜브에 넣을 수 있습니다.
    2. 파라핀에 조직을 끼웁니다. 이것은 일반적으로 조직병리학 핵심 시설 또는 서비스에 의해 수행됩니다.
    3. 슬라이드에 장착된 0.5μm 두께의 단면을 얻습니다(전하를 띠지 않은 슬라이드가 적절함). 섹션을 실온의 공기에 노출시켜 건조시킵니다. 조직병리학 핵심 시설 또는 서비스는 일반적으로 이 작업을 수행합니다. 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
  2. 아래 설명된 대로 섹션을 분리하고 재수화합니다.
    1. 단면을 탈파라핀화/세척 용액(자일렌 또는 시트리솔v)의 두 가지 변화에 각각 5-15분 동안 담궈 파라핀화합니다.
    2. 슬라이드를 100% 에탄올, 95% 에탄올, 70% 에탄올, 물에 각각 5분씩 연속적으로 담가 수분을 보충합니다.
  3. 아래에 설명된 대로 picro-sirius red가 있는 얼룩 섹션.
    1. 시리우스 레드 (다이렉트 레드 80) 1g / L, 피크 르산 1.3 %에 1 시간 동안 섹션을 담그십시오. 직접 적색은 콜라겐 이외의 구조(예: 핵)를 염색할 수 있으므로 더 오래 염색하지 마십시오. 카운터 염색이 필요한 경우 염색 용액에 빠른 녹색(1g/L)을 추가합니다26. 또는 Weigert의 hematoxylin27로 핵을 염색합니다.
    2. picro-sirius 빨간색 용액을 밀폐된 어두운 유리 또는 플라스틱 용기에 넣어 보관하십시오. 이 솔루션은 여러 번 재사용 할 수 있습니다 (최소 20 년동안 27).
  4. 탈수를 위해 샘플을 에탄올(100%)에 5분 동안 담그십시오. 에탄올을 두 번 바꾸면서 반복합니다.
  5. 장착을 위해 개별적으로 제거될 때까지 투명 용액(xylene 또는 citrisolv)에 담그십시오.
  6. 투명 용액에서 한 번에 하나의 슬라이드를 제거하고 종이 타월에 얼룩을 만들어 과도한 액체를 제거합니다. 장착 매체(약 50 - 100 μL)를 추가합니다. 커버슬립으로 섹션을 덮고 커버슬립을 부드럽게 눌러 기포를 제거합니다. 공기를 말리십시오.
    참고: 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
  7. 명시야 조명과 대물렌즈 4x에서 20x가 있는 광학 현미경을 사용하여 단면을 관찰합니다 - 콜라겐은 밝은 노란색-주황색 배경 위에 빨간색으로 나타납니다. 카메라 지침에 따라 컬러 카메라로 관심 영역을 이미지화합니다.
  8. 아래 설명된 대로 편광 현미경으로 이미징을 수행합니다.
    1. 편광판과 분석기 필터를 직각으로 연결하고 조정하여 콜라겐이 보이고 배경 신호가 최소화되도록 합니다. 콜라겐은 어두운 배경에서 흰색, 노란색 또는 주황색으로 보입니다. 섬유화가 거의 또는 전혀 없는 섹션에서는 혈관 벽의 콜라겐이 보일 것입니다. 비교할 모든 샘플에 대해 조명 강도를 포함한 설정을 동일하게 유지합니다.
    2. 흑백 카메라 또는 컬러 카메라에서 흑백 모드를 사용한 이미지. 4배 확대 대물렌즈를 사용합니다. 섹션당 여러 이미지를 촬영합니다. 혈관이 큰 경우 hilum 근처 영역을 피하십시오. 비교할 모든 이미지에 대해 동일한 설정을 사용합니다.
  9. 아래 설명된 대로 Photoshop(대안 a)을 사용하여 형태 측정 정량화를 수행합니다.
    1. 콜라겐에 해당하는 이미지의 흰색 영역을 정량화합니다. Photoshop에서 Select > Color range(색상 범위 선택)를 클릭한 다음 Highlights(하이라이트)를 선택하고 매개 변수 Fuzziness(퍼지) 및 Range(범위)를 조정하여 콜라겐에 해당하는 흰색 픽셀을 선택합니다. 그런 다음 Window > Histogram > Expanded View를 선택하고 매개변수 Pixels 옆에 표시된 선택된 픽셀 수를 기록합니다. 비교할 모든 이미지에 대해 동일한 매개 변수를 사용합니다.
    2. 이미지의 전체 영역을 수량화합니다. Photoshop에서 Select > All을 클릭한 다음 이전에 수행한 것처럼 총 픽셀 수를 기록합니다.
    3. 콜라겐에 해당하는 이미지 영역의 백분율을 흰색 픽셀의 수를 총 픽셀의 수로 나누어 계산합니다. 값은 일반적으로 면적 백분율로 표현됩니다.
  10. 아래 설명된 대로 ImageJ(대안 b)를 사용하여 형태 측정 정량화를 수행합니다.
    1. 이미지에서 콜라겐에 해당하는 흰색 영역을 선택합니다. 이미지를 클릭하여 임계값 >도구를 열고 > 임계값을 조정합니다 (또는 Shift + T를 누름). 콜라겐 염색 영역(흰색 영역)만 빨간색으로 강조 표시되도록 임계값 범위를 설정하고(예: 최소 임계값 64, 최대 임계값: 255) 적용을 클릭합니다. 이렇게 하면 이미지가 이진화되어 콜라겐 영역이 검은색으로, 배경이 흰색으로 변환됩니다.
    2. Analyze(분석) > Set Measurements(측정값 설정)를 클릭하여 전체 이미지 영역을 측정합니다. Area and Display Label을 선택합니다. 확인을 클릭합니다. Analyze > Measure를 클릭합니다(또는 키보드에서 M 키를 누름). 결과 창에 전체 이미지 영역이 표시됩니다.
    3. 콜라겐 면적과 백분율을 측정하려면 먼저 Analyze > Set Measurements를 클릭하여 Limit to Threshold를 활성화합니다. Area, Area Fraction (ImageJ는 콜라겐 %를 자동으로 계산함), Limit to Threshold, Display Label을 선택합니다. 확인을 클릭합니다. 그런 다음 Analyze > Measure 를 클릭합니다( 또는 M을 누릅니다). 결과 창에는 Collagen Area (절대 픽셀 수) 및 Area Fraction (전체 이미지의 collagen%)이 표시됩니다.
    4. 다른 이름으로 저장을 선택하여 결과를 저장하거나 클립보드에 복사하여 스프레드시트에 붙여넣습니다.

3. 간 하이드록시프롤린 정량화

알림: 강염기와 산을 사용해야 하는 단계는 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 수행해야 합니다.

  1. 1.8.7단계에서 준비한 간 샘플의 무게를 측정하고 무게를 기록합니다. 균질화에 적합한 튜브에 조직 분취량을 놓습니다. 조직 100mg당 물 900μL의 물 대 조직 비율을 사용하여 탈이온수를 추가합니다.
  2. 육안 관찰로 평가된 바와 같이 조직이 완전히 균질화될 때까지 제조업체의 지침에 따라 비드 박동 또는 기타 방법으로 균질화합니다. 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있으며 균질액은 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
  3. 아래 설명된 대로 단백질 침전을 수행합니다. 다음 단계는 다른 온도가 지정된 경우를 제외하고 실온에서 수행됩니다.
    1. 약 500 μL - 1000 μL의 균질산물을 1.5 mL 원심분리 튜브로 이송합니다. 모든 샘플에 대해 동일한 부피를 옮깁니다.
    2. 12%의 최종 농도를 위해 트리클로로아세트산을 추가합니다(예: 120μL의 트리클로로아세트산을 880μL의 호모게네이트에 추가)28. 소용돌이를 간단히 섞습니다.
    3. 얼음/물 수조에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 6,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기. 단백질을 함유하는 침전물이 형성됩니다. 흡인에 의해 상층액을 제거합니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
    4. 얼음처럼 차가운 에탄올 1mL(100%)를 넣어 펠릿을 세척합니다. 초음파 처리(또는 다른 방법)로 펠릿을 재현탁하고 물질이 재현탁되는지 육안으로 확인합니다. 6,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기를 하고 흡인으로 상층액을 제거합니다. 장비 지침에 따라 초음파 설정을 사용합니다(예: 3.2mm 직경의 마이크로팁이 있는 Branson SFX 150 음파기를 사용하면 대부분의 샘플에 10초 동안 70%의 진폭이 효과적임). 세탁을 2회 반복합니다.
    5. 펠릿을 10분 동안 자연 건조시키거나 필요한 경우 더 오래 건조시킵니다.
  4. 아래 설명된 대로 단백질 가수분해를 수행합니다.
    1. 단백질 침전물을 포함하는 튜브에 800μL의 6N 염산을 추가합니다. 3.3.4 단계와 동일한 설정을 사용하여 초음파 처리 (또는 다른 방법)로 펠릿을 재현 탁엽시킵니다.
    2. 단백질 현탁액을 스크류 캡이 있는 유리관 또는 바이알로 이동; 단단히 닫으십시오. 110°C의 오븐에서 22± 2시간 29분 동안 튜브를 배양합니다.
    3. 16,000 x g 에서 10분 동안 원심분리기 튜브; 미립자는 펠릿을 형성합니다. 이를 위해서는 일반적으로 원심분리 전에 유리 바이알에서 원심분리 튜브로 가수분해물을 이동해야 합니다.
    4. 하이드록시프롤린이 포함된 상등액을 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 가수분해물은 4°C에서 보관할 수 있습니다.
  5. 하이드록시프롤린 농도에 대한 표준 곡선을 준비합니다. 섬유증 1-3기가 있는 간 샘플의 경우 이 프로토콜에 표시된 조직의 양을 사용하여 최대 125μg/mL의 표준 농도가 적절합니다(예: 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.81, 3.91, 1.95 및 0μg/mL의 연속 희석). 하이드록시프롤린을 6N 염산에 희석하여 표준물질을 준비합니다.
  6. 각 시료 및 표준물질 40μL를 1.5mL 표지된 원심분리 튜브로 옮깁니다. 각각에 10 μL의 10 N 수산화나트륨을 넣고 잠시 소용돌이하여 혼합합니다.
  7. 아래와 같이 하이드록시프롤린의 산화를 수행합니다.
    1. 탈이온수에 아세트산 1.2% v/v, 구연산 46g/L, 아세트산나트륨 삼수화물 120g/L, 수산화나트륨 34g/L를 함유한 아세테이트-구연산염 완충액을 준비하고 완충액 pH를 6.5로 조정합니다.
    2. 물에 클로라민 T 12.7g/L의 용액을 준비합니다: n-프로판올: 아세테이트-시트레이트 완충액(1:1:8 v:v:v). 먼저 혼합하여 클로라민 T를 물에 용해시킨 다음 n-프로판올을 첨가하고 혼합한 다음 아세테이트-구연산염 완충액을 첨가하고 혼합합니다.
    3. 450μL의 클로라민 용액을 시료 및 표준물질이 있는 튜브에 추가합니다. 소용돌이에 의하여 섞으십시오. 실온에서 25분30초 동안 배양합니다.
  8. Ehrlich의 시약을 과염소산:프로판올 1:2(v/v)에 1M 4-(디메틸아미노) 벤즈알데히드로 준비합니다. Ehrlich의 시약 500μL를 시료 및 표준물질에 첨가합니다. 소용돌이에 의하여 섞으십시오.
  9. 65 °C에서 가열 블록, 수조 또는 인큐베이터에서 20분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 샘플과 표준물질을 실온으로 식힙니다.
  10. 분광 광도계를 사용하여 550 nm의 파장에서 샘플과 표준물질의 흡광도를 측정합니다.
  11. 표준 양에 대한 흡광도를 플롯하고 선형 회귀를 사용하여 표준 곡선을 만듭니다. 표준 곡선의 매개 변수를 사용하여 샘플의 하이드 록시 프롤린 농도를 계산하십시오.
  12. 가수분해물의 총 부피를 기준으로 간 샘플의 하이드록시프롤린의 양을 계산하고(단계 3.4) 단백질 침전에 사용된 균질산염의 부피에 해당하는 조직의 질량으로 정규화합니다(단계 3.3.1). 결과를 조직 mg당 하이드록시프롤린의 ng로 표현합니다. 양자택일로, 균질액에 있는 단백질의 농도는 측정될 수 있고 결과는 단백질의 질량 당 hydroxyproline의 질량으로 표현될 수 있습니다.

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결과

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HFFD를 먹인 Ay 마우스는 LFFD를 먹인 야생형 마우스보다 체중이 더 많이 증가하고 비만이 발생합니다(그림 1A). HFFD 수유 첫 4주 동안 체중이 더 빠르게 증가하여 주당 약 3-4g이 증가합니다. 8주 후에는 대조군 쥐와 비슷한 비율로 체중이 증가합니다(약 0.6g/주)19. 16주 후, HFFD를 먹인 Ay 마우스의 무게는 약 45g - 50g(3개의 개별 실험 평균)이며 LFFD를 먹인 대조군 야생형 마우스보다 약 40% - 80% 더 무거웠습니다(그림 1B, C).

Ay HFFD 마우스는 대조군에 비해 지방 패드가 확대되어 지방 조직 저장량이 더 큽니다(그림 1D

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토론

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이 프로토콜은 인간에서 질병을 복제하는 간 섬유증을 가진 MASLD의 마우스 모델을 설명합니다 5,6. 생쥐는 간 지방증을 발병시키는데, 이는 조직학에서 미시소포증과 거대소포성 지방증이 혼합되어 있고 간 트리아실글리세롤 함량이 상승한 것으로 나타난다19. 마우스는 또한 비만, 고중성 지방혈증, 포도당 과민증을 개발하고, 간 지방증과 함께, 인간의 MASLD에 대한 진단 기준에 해당하는 고혈압이 있는 것으로 보고되었습니다19,32. 지방증(steatosis) 외에도, 이 마우스는 MASH19의 특징인 다른 변화를 보인다: 이 마우스는 간세포 손상을 가지고 있으며, 헤마톡실린(he...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금 K22CA178098, R03DK101863, 브루클린 칼리지(JMC)의 R15DK131627 및 창업 기금의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4-(디메틸아미노)벤자알데히드시그마-올드리치D2004
아세트산다양한NA
조정 칼로리 식단 서양식 식단이노티브TD.88137지방(42% kcal)과 자당(34% w/w)을 포함한 식단입니다. 다른 공급업체들도 같은 성분의 다이어트를 제공합니다
B6. CG-AY/J잭슨 연구소000021스트레인은 아구티 치명적인 노란색 돌연변이와 C57BL6/J 배경을 가지고 있습니다. 현재 잭슨 연구소는 이 균주를 보존하고 있습니다.
C57BL/6J잭슨 연구소000664
원심분리기다양한NA1.5 mL 튜브용 로터를 갖추고 냉장 보관, 16,000 xg까지 도달할 수 있습니다.
원심분리기다양한NA
클로라민-T 하이드레이트시그마-올드리치857319
구연산다양한NA
다이렉트 레드 80시그마365548-5G
에탄올디콘 연구소2701
포르말린 용액, 중성 완충시그마HT501128
과당시그마-올드리치F0127
포도당시그마-올드리치G8270
조직학 처리 장비NANA삽입 및 절편 삽입은 연구소나 외부 시설에서 이루어질 수 있습니다
균질기다양한NA비드 비터는 여러 샘플을 효율적으로 처리할 수 있습니다. 다른 균질화 방법도 사용할 수 있습니다
염산다양한NA
하이드록시프롤린시그마H5534
저지방 조절 식단이노티브TD.08485대조 식단, 저지방(13% kcal)과 자당(12% w/w)
편광 현미경 장착 현미경다양한NA
N-프로판올다양한NA
과염산다양한NA
퍼마운트 장착 미디엄피셔 사이언티브SP15-100
피크릭산, 포화 수용액, 스펙트럼피셔18612375
아세테이트 삼수화나트륨다양한NA
수산화나트륨다양한NA
소닉케이터다양한NA소닉케이터는 2.5단계에서 펠릿을 재현하는 데 유용하지만, 반드시 필요한 것은 아닙니다
트리클로로아세트산다양한NA
VWR 마이크로 커버 안경, 직사각형VWR 48393-081
VWR 프리미엄 슈퍼프로스트 플러스 현미경 슬라이드 | VWRVWR 48311-703
물, 탈이온다양한NA정수 시스템에서 추출한 탈이온수나 공급업체로부터 구매하는 물.
자일렌피셔 사이언티브X3F시트리소르브 청산소 대리인  (피셔 22-143-975)는 친환경 대안을 판매합니다

참고문헌

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