사상균에 의한 고분자 가수분해 세포외 효소 생산을 위한 고체 발효 시스템 설계

Summary

이 프로토콜은 효소 생산을 향상시키기 위해 회전식 고체 발효 시스템에서 밀기울을 사용합니다. 키틴질과 같은 유도제로 보충된 기질은 통제된 조건에서 곰팡이 성장을 지원합니다. 결과는 수중 발효에 비해 효소 수율이 4-6배 더 높다는 것을 보여주며, 이는 다양한 생명 공학 응용 분야에 대한 방법의 적응성과 효과를 보여줍니다.

Abstract

고체 상태 발효(SSF)는 수성 매체에 용해되지 않는 고체 기질을 사용하는 생물 전환 공정입니다. 미생물은 기질 표면에서 성장하고 고체 매트릭스를 관통하여 발달에 필요한 필수 영양소를 추출합니다. SSF는 기판 수분 함량이 70% 이상으로 유지되는 최소한의 자유수가 특징이며 기체, 액체 및 고체의 세 가지 상호 연결된 단계를 포함합니다. 이 프로토콜은 농업 산업 부산물인 밀기울을 회전 시스템에서 효소 생산을 위한 기본 기질로 사용하는 것을 설명합니다. 기질에는 키틴질, 키토산, 전분 또는 셀룰로오스와 같은 유도제가 보충되어 가수분해 단백질의 합성을 촉진합니다. 이 시스템은 적응력이 뛰어나 균사체, 포자 또는 펠릿을 포함한 다양한 곰팡이 형태를 사용할 수 있습니다. 설명된 방법론에서 유도제와 기질은 1:100(w/w)의 비율로 혼합되고, 오토클레이브를 통해 멸균되며, 멸균수로 원하는 수분 수준으로 조정됩니다. 그런 다음 곰팡이 접종물을 추가하고 회전 시스템이 10rpm에서 작동하여 적절한 혼합 및 산소화를 보장합니다. 이 시스템은 중온성 또는 호열성/내열성 곰팡이에 대한 최적의 성장 조건에서 6-8일 동안 배양되어 다용성을 향상시킵니다. 배양 후, 효소는 효소의 종류에 따라 적절한 저온 완충액(예: 아세테이트, 구연산염 또는 인산염)을 사용하여 쉽게 추출됩니다. 추출물은 무세포 상층액을 얻기 위해 원심분리 및 여과를 통해 정화됩니다. 그런 다음 필요에 따라 효소를 추가로 농축하거나 정제할 수 있습니다. 그 결과 수중 발효(SmF)에 비해 효소 활성이 4-6배 증가하여 시스템의 효과가 강조되었습니다. 다양한 기질, 유도 물질 및 곰팡이 종에 대한 적응력으로 인해 다양한 생명 공학 응용 분야에 유용한 도구입니다.

Introduction

고체 발효(SSF)는 고부가가치 효소, 생체 활성 화합물 및 2차 대사 산물을 생산하기 위한 유망하고 지속 가능한 생물 전환 기술로 부상했습니다. 이 기술은 최소한의 자유수로 고체 기질에서 미생물을 성장시켜 자연 환경을 시뮬레이션하고 효율적인 대사 활동을 가능하게 합니다¹. 이 프로토콜의 주요 목표는 향상된 기질 활용도, 산소 확산 및 공정 확장성을 보장하는 회전식 SSF 시스템을 통해 효소 생산을 최적화하는 것입니다. 풍부한 농업 산업 부산물인 밀기울을 기본 기질로 사용하면 농업 잔류물의 가치화에 기여하고 순환 바이오 경제 관행을 촉진할 수 있습니다².

SSF낮은 에너지 및 물 소비, 더 높은 제품 농도, 밀기울, 왕겨 및 사탕 수수 사탕 수수와 같은 광범위한 저렴한 농업 잔류 물과의 호환성을 포함하여 수중 발효 (SmF)에 비해 상당한 이점이 있습니다³. 많은 양의 물과 값비싼 영양 매체가 필요한 SmF와 달리 SSF 시스템은 미생물 성장 표면 역할을 할 뿐만 아니라 미생물 활동에 필수적인 영양소를 제공하는 고체 매트릭스를 활용합니다. 또한 SSF의 제한된 자유수는 오염 위험을 최소화하여 산업 환경에서 효소 생산을 위한 보다 강력한 옵션입니다⁴. 운영상의 이점 외에도 SSF는 수중 발효(SmF)에 비해 상당한 환경적, 경제적 이점을 제공합니다. 연구에 따르면 SSF는 물 소비를 50%-70% 줄이고 지속적인 교반과 폭기가 필요한 많은 양의 물이 없기 때문에 에너지 비용을 30% 이상 절감합니다. 또한, 농업 산업 잔류물을 기질로 사용하면 원료 비용을 최소화하고 농업 부산물을 용도 변경함으로써 순환 경제 관행을 촉진할 수 있습니다 ^2,4.

SSF효율성과 확장성에 대해 광범위하게 검증되었습니다. 예를 들어, 연구에서는 SmF에 비해 SSF를 사용하여 효소 활성이 4-6배 증가했다고 보고했으며, 이 기술의 경제적 및 환경적 이점을 강조합니다 ^2,5. 또한 효소 추출에는 일반적으로 더 적은 물과 더 적은 정제 단계가 필요하기 때문에 다운스트림 공정이 단순화됩니다. 이것은SSF운영 비용과 환경 영향 감소를 목표로 하는 산업에 특히 매력적입니다⁶.

이 프로토콜에 설명된 로터리 SSF 시스템은 기존의 정적 SSF 방법에 비해 몇 가지 개선 사항을 제공합니다. 정적 시스템은 종종 불균일한 기질 집락화 및 산소 제한과 같은 문제에 직면하지만, 회전식 구성은 철저한 혼합 및 폭기를 보장하여 균일한 미생물 성장을 촉진합니다 ^7,8,9. 예를 들어, 이 시스템은 Aspergillus 및 Trichoderma²와 같은 곰팡이 종을 사용하여 키티나제, 아밀라아제 및 프로테아제와 같은 가수분해 효소를 생산하는 데 성공적으로 사용되었습니다.

이 SSF 시스템의 주요 특징은 적응성입니다. 밀기울을 기본 기질로 사용하는 것은 비용 효율적인 생물 전환을 위한 농업 산업 잔류물의 잠재력을 보여줍니다³. 또한, 키틴, 키토산 및 전분과 같은 유도제로 기질을 보충하면 특정 대사 경로를 자극하여 효소 합성을 더욱 향상시킵니다 ^2,10. 이 시스템은 또한 포자, 균사체 및 펠릿을 포함한 다양한 곰팡이 형태와 호환되므로 사용자는 특정 요구 사항에 맞게 프로세스를 조정할 수 있습니다².

SSF는 식품 생명 공학, 바이오 연료 생산 및 환경 개선과 같은 다양한 분야에 적용할 수 있는 광범위한 잠재력을 제공합니다¹¹. 비용 효율적인 기질, 탁월한 효소 수율 및 높은 공정 유연성의 통합으로 SSF는 산업 규모의 생명 공학 혁신을 위한 필수 접근 방식으로 자리 잡았습니다.

Protocol

이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 기판 준비

알림: 기질 특성의 큰 변화를 최소화하기 위해 상업용 브랜드의 밀기울을 사용하십시오. 밀기울의 각 배치는 여러 요인으로 인해 달라지기 때문에 표준화가 어려운 이질적인 재료가 되어 구성 함량의 변동을 초래합니다. 표준화된 재료가 필요한 경우 대체 매트릭스를 선택하거나 각 밀기울 배치에 대한 근접 화학 분석을 수행하여 필요에 따라 조정하십시오.

1. 밀기울을 멸균 증류수로 세 번 세척하여 유기물 잔류물, 부스러기 및 먼지를 제거합니다. 이것은 또한 발효를 방해할 수 있는 단순당을 제거합니다.
2. 씻은 밀기울을 알루미늄 트레이에 펴고 60°C의 오븐에서 24시간 동안 건조시킵니다.
3. 건조되면 밀기울을 멸균된 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.

2. 접종물의 준비

참고: 이 프로토콜은 접종 준비를 위한 세 가지 방법, 즉 포자 현탁액, 균사체 디스크를 사용한 직접 접종 및 세포 현탁액을 설명합니다. 정확한 수율 계산을 위해 초기 접종물 농도를 설정하고 단백질 수준을 정량화합니다.

1. 포자 현탁액의 준비
   1. 균사체로 포화된 직경 5mm의 한천 디스크를 신선한 감자 포도당 한천 플레이트에 옮깁니다. 플레이트를 28°C에서 5-7일 동안 또는 균사체가 배지를 포화시킬 때까지 배양합니다. 일부 곰팡이는 더 긴 잠복 시간이 필요할 수 있습니다.
   2. 플레이트에 멸균 증류수 5mL를 추가하고 멸균 루프를 사용하여 포자를 기계적으로 분리합니다.
   3. 포자 현탁액의 1:100 희석을 준비합니다. Neubauer 챔버 중앙에 10 μL를 놓고 현미경으로 포자를 계수합니다. 챔버의 계수와 희석을 기준으로 포자 농도(포자/mL)를 계산합니다.
2. 액체 매질에서 균사체의 배양
   1. 균사체로 포화된 5mm 한천 디스크를 신선한 감자-포도당-한천 플레이트에 옮기고 포화될 때까지 28°C에서 배양합니다.
   2. 멸균 125mL 플라스크와 오토클레이브에 25mL의 감자-포도당 육수를 준비합니다.
   3. 포화 플레이트에서 5mm 균사체 디스크를 멸균 육수로 옮깁니다.
   4. 곰팡이 균주에 따라 125rpm으로 24-48시간 동안 셰이커에서 플라스크를 배양합니다. 천천히 자라는 곰팡이의 잠복 시간을 연장합니다.
   5. 접종물을 위해 2mL를 수집하고 건조 중량 측정을 위해 2mL를 수집합니다.
3. 균사체 디스크의 직접 접종
   1. 균사체로 포화된 5mm 한천 디스크를 신선한 감자-포도당-한천 플레이트에 놓습니다. 포화될 때까지 28 °C에서 배양합니다.
   2. 하나의 균사체 디스크를 접종물로 사용하고 다른 하나를 사용하여 건조 중량을 측정합니다.

3. SSF 시스템의 준비

참고: 유도제는 천연 또는 상업용일 수 있습니다. 정제된 상업용 유도제는 발효 효율을 변경할 수 있는 불순물을 최소화하기 위해 선호됩니다. 상대 습도를 90% 이상으로 유지하기 위해 물 첨가량을 조정하십시오.

1. 멸균 된 50mL 원추형 튜브에 다음 구성 요소를 결합하십시오 : 건조 밀기울 5g; 유도제 0.2g(예: 상업용 키틴질); 물 5.5mL(유도기의 수분 흡수 용량에 따라 조정); 16g/L 일염기성 인산칼륨, 4g/L 황산나트륨, 2g/L 염화칼륨, 1g/L 염화칼슘, 400mg/L 염화아연, 60mg/L 붕산, 40mg/L 몰리브덴산나트륨, 150mg/L 염화마그네슘, 100mg/L 염화철 및 400mg/L 황산구리를 함유한 멸균염 용액 5mL.
2. 전극 기반 습도계를 사용하여 상대 습도를 측정하고 최소 90%의 습도를 보장합니다. 전극 프로브를 다양한 깊이에서 반응기에 직접 삽입하여 수분 분포의 대표적인 측정값을 얻습니다.
   1. 90% 미만인 경우 습도를 조정하려면 다음 단계를 따르십시오.
      1. 기질 10g당 1mL 단위로 멸균 증류수를 점차적으로 첨가합니다. 첨가할 때마다 수분의 균일한 분포를 보장하기 위해 철저히 혼합하십시오.
      2. 기판이 10-15분 동안 평형을 이루도록 합니다. 습도 수준을 다시 측정하십시오.
      3. 목표 습도인 90%에 도달할 때까지 위의 단계를 반복합니다. 프로세스 전반에 걸쳐 기판을 과도하게 적시지 마십시오.
   2. 90% 이상인 경우 습도를 조정하려면 다음 단계를 따르십시오.
      1. 멸균 환경에서 기판을 얇게 펴십시오. (1) 기판을 층류 기류에 노출시키거나 (2) 30°C의 건조실에 10-15분 동안 두어 과도한 수분을 제거합니다.
      2. 또는 기질을 부드럽게 혼합하여 균일한 수분 재분배를 촉진합니다. 치료 후 습도 수준을 다시 평가하십시오.
      3. 습도가 90%에 도달할 때까지 필요에 따라 건조 또는 혼합 단계를 반복합니다. 목표 습도에 도달한 후에만 발효를 진행하십시오.
3. 15psi에서 15분 동안 튜브를 오토클레이브합니다.
4. 냉각 후 기질에 포자 현탁액 1mL(1 x 10^6-1 x 10⁷ spores/mL), 세포 현탁액 2mL 또는 5mm 균사체 디스크 1개 중 하나를 접종합니다.

4. 고체 발효 (SSF) 절차

참고: 서로 다른 시간에서의 역학 연구 또는 매개변수 평가의 경우, 재현성을 보장하기 위해 각 시점에 대해 별도의 튜브를 준비하십시오.

1. 1분 주기로 5분 동안 최대 속도로 튜브를 볼텍싱하여 기판 응집을 방지합니다.
2. 튜브를 수평 축이 있는 회전식 믹서에 놓습니다. 기판이 튜브 내부에서 자유롭게 움직이는지 확인하십시오. 믹서가 10rpm으로 작동하도록 설정합니다.
3. 믹서를 미생물의 최적 성장 온도에서 인큐베이터로 배양합니다. 열에 민감한 유도제를 사용할 때 최적의 효소 활성을 위해 보고된 온도를 유지하십시오.

5. 효소 추출

참고: 추출 기본은 세포외 효소의 용해도와 pH-최대 활성을 기반으로 합니다. SSF가 물 매체를 피하기 때문에 세포 외 효소는 고체 매트릭스를 둘러싼 물에 관여하며, 이는 농도가 SmF보다 높다는 것을 의미합니다. 이러한 맥락에서 최상의 추출 버퍼의 선택은 원하는 활동에 대한 지식에 따라 달라집니다. 추출의 최적화는 최종 효소 농도와 사용된 추출 버퍼의 유형에 따라 달라집니다.

1. 원하는 발효 기간이 끝나면 20mL의 사전 냉각된 완충액에 기질을 재현탁합니다. 예를 들면 다음과 같습니다 : 키티나 제 추출을 위한 0.1 M 아세테이트 완충액, pH 5.6; 0.02M 인산염 완충액, pH 6.9, 아밀라아제 추출용.
2. 튜브를 주기로 소용돌이치십시오 : 최대 속도로 1 분, 얼음 위에서 1 분. 10회 반복합니다.
3. 종이 필터를 사용하여 현탁액을 여과하고 눌러 상층액을 기계적으로 추출합니다.
4. 3000 x g 에서 4 °C에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 정화합니다.
5. 미처리 추출물을 직접 사용하거나 컬럼 크로마토그래피 또는 원심 필터를 통해 효소를 추가로 정제합니다. Michaelis 상수(Km)와 최대 효소 변환 속도(Vmax)¹²를 결정하기 위해 역학 연구도 권장됩니다.

6. 최적화 프로세스

참고: 유도제의 품질과 농도, 접종물의 유형 및 농도를 평가하고 조정하여 이 프로토콜을 최적화합니다.

1. 이상적인 발효 시간을 결정하고 추출 단계를 구체화하여 효율성을 개선하십시오.
2. 온도, pH 및 폭기를 포함한 환경 조건을 제어하고 미세 조정합니다.
3. 효소 수율과 안정성을 향상시키기 위해 다양한 완충액 및 추출 조건을 테스트합니다.
4. 반응 표면 방법론과 같은 통계 분석을 수행하여 가장 영향력 있는 변수를 식별하고 최적의 효소 생산을 달성합니다.

Results

그림 1A 는 이 시스템에 사용된 회전식 믹서의 개략도를 보여주며, 50mL의 원뿔형 튜브 6개를 수용할 수 있습니다. 그림 2B 는 고체 상태 발효 과정에 들어가기 전에 컨디셔닝 중에 밀기울에서 발생하는 변화를 보여줍니다. 본 바와 같이, 유의미한 구조적 변화는 관찰되지 않았다.

그림 2는 상업용 키틴을 유도제로 사용하여 이 시스템에서 Trichoderma harzianum 곰팡이에 의한 키티나제 생산을 위한 고체 상태 발효 6일 후의 밀기울의 포화도를 보여줍니다. 그림 2A 는 발효 공정 전의 원래 재료를 보여줍니다. 현미경 사진은 곰팡이에 의한 기질의 활용을 확인하며, 이는 곰팡이와의 상호 작용으로 인해 프랙탈과 같은 구조를 잃는 변형에도 반영됩니...

Discussion

이 연구는 사상균을 위해 특별히 설계된 고체 발효(SSF) 시스템을 통해 효소 생산을 최적화하기 위한 관련 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 아래에서는 방법론의 중요한 측면과 그 중요성, 제한 사항 및 잠재적 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

프로토콜의 성공 여부는 기질 및 접종물 준비와 같은 핵심 단계에 크게 좌우됩니다. 밀기울의 적절한 세척 및 건조는 곰팡이 성장이나 효소 생성을 방해할 수 있는 불순물을 제거하는 데 필수적입니다. 또한, 상대 습도를 90% 이상으로 유지하기 위해 기질 수분을 신중하게 조정하면 최적의 곰팡이 집락화 및 활성이 보장됩니다¹³. 10rpm에서 회전 시스템의 작동은 균일한 혼합 및 산소화를 촉진하고 기판 응집을 방지하며 균일한 곰팡이 성장을 보장하기 때문에 또 다른 중요한 매개변수입니다¹⁴.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
삼각 플라스크 125mL	시그마-알드리치	CLS431684	액체 배지에서 균사체 배양용.
50mL 원뿔형 튜브	시그마-알드리치	CLS430921	기질 및 접종물을 보관하고 준비합니다.
아세테이트 완충액, pH 5.6	시그마-알드리치	320866	키티나제 추출용.
센트리콘 필터	밀리포어	UFC905024	효소의 추가 정제를 위해.
계수 세포 챔버	시그마-알드리치	Z359629	현미경으로 포자를 세는 데 사용됩니다.
여과지	왓맨	1001-110	효소 추출물을 여과하기 위해.
습도계	토도마이크로	-	기판의 상대 습도를 측정합니다.
유도제(예: 상업용 키틴)	시그마-알드리치	C9752	발효 중 효소 생산을 향상시키는 데 사용됩니다.
인산염 완충액, pH 6.9	시그마-알드리치	P5379	아밀라아제 추출용.
감자 포도당 한천	시그마-알드리치	P2182	곰팡이 균사체 성장용 배양 배지.
감자 포도당 국물	시그마-알드리치	P6685	곰팡이 균사체 성장을위한 액체 배양 배지.
로터리 믹서	써모피셔 사이언티픽	88-861-051	발효 중에 기질을 계속 움직이게 합니다.
염 용액 성분(예: KH2PO4, Na2SO4, KCl 등)	시그마-알드리치	배수	멸균 소금 용액을 준비하려면 프로토콜의 자세한 레시피를 참조하십시오.
밀기울	상업 시장	-	고체 발효용 기질.